Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

סיכום

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

תקציר

טיפול חיסוני סרטן יכול לרתום את הספציפיות של תגובה חיסונית למקד ולחסל גידולים. טיפול בתאים מאמץ (ACT) המבוססים על העברת המאמצת של תאי T המהונדס גנטי כדי לבטא רצפטור אנטיגן chimeric (CAR) הראה הבטחה רבה במחקרים קליניים ^1-4. ישנם מספר יתרונות לשימוש ברכב ⁺ תאי T לטיפול בסרטן, לרבות היכולת למקד אנטיגנים מוגבלים שאינם MHC וfunctionalize תאי T להישרדות אופטימלית, הביות והתמדה בתוך פונדקאי, ולבסוף לגרום לאפופטוזיס של מכונית ⁺ תאי T במקרה של רעילות מארח ^5.

תיחום הפונקציות האופטימליות של רכב ⁺ תאי T הקשורים לתועלת קלינית הם חיוניים לעיצוב הדור הבא של ניסויים קליניים. התקדמות בהדמית חי כמו מיקרוסקופיה multiphoton חולל מהפכה בחקר תפקוד תא חיסוני אניn vivo ^6,7. בעוד שמחקרים אלה קדמו את ההבנה של פונקציות תא T in vivo, ACT מבוסס תאי T בניסויים קליניים שלנו דורש את הצורך לקשר תכונות מולקולריות ופונקציונליות של הכנות תא T-עירוי מראש עם פוסט עירוי יעילות קלינית, על ידי ניצול ב מבחני חוץ גופיית ניטור תפקודי תא T כמו, והפרשת ציטוקינים cytotoxicity. מבחנים מבוססי הזרימה cytometry סטנדרטיים שפותחו לקבוע את התפקוד הכללי של אוכלוסיות תאי T ברמת התא בודד, אבל אלה אינם מתאימים לניטור צמודה והיווצרות חיים או את היכולת של אותו התא כדי להרוג מטרות מרובות ^8.

מערכי microfabricated תוכננו בפולימרים ביולוגיים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) הם שיטה אטרקטיבית במיוחד מרחבית להגביל effectors ויעדים בנפחים קטנים ^9. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית זמן לשגות פלואורסצנטי, thousands של אינטראקציות-היעד פעיל ניתן לפקח בו זמנית על ידי בארות בודדות הדמיה של מערך nanowell. אנו מציגים כאן שיטת תפוקה גבוהה לניטור cytotoxicity תיווך תאי T ברמת התא בודד שיכול להיות מיושמת באופן נרחב ללימוד הפונקציונלי cytolytic תאי טי.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן RPMI-PLGH ידי ערבוב 500 מיליליטר מיליליטר RPMI-1640 ו 5 כל אחד מפניצילין-סטרפטומיצין, L-גלוטמין, ופתרון HEPES.
2. הכן R10 פתרון על ידי ערבוב RPMI-PLGH עם סרום שור עוברי (10% FBS). FBS הוא חום מומת בגיל 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני תוספת.
3. טרום חם על 37 מעלות צלזיוס 50 מ"ל של RPMI-PLGH, 15 מ"ל של PBS, ו15 מ"ל של R10 בצינורות חרוטים סטריליים.
4. המצאה של מערכים של nanowells בPDMS: אב סיליקון היא מפוברקת באמצעות photolithography למעשה כפי שתואר קודם לכן ^10. מערבב היטב את בסיס Sylgard 184 אלסטומר ערכה וסוכן ריפוי ביחס 10:01 משקל בכוס חד פעמית באמצעות סכין פלסטיק. דגת התערובת בתא ואקום לשעה 1. יוצק את התערובת על גבי מערך nanowell, לאטום עם שקופית זכוכית ולתת לו לשבת במשך 30 דקות. העברת ההרכבה לתנור ל 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ומצננים בטמפרטורת חדר למשך השעה 1. אלסטומר יהיה נוכדואר בתקופה זו ורצון קשר לשקופית הזכוכית. שקופיות הזכוכית המכילות את מערך nanowell PDMS היא הרים בזהירות את אדון סיליקון, מכוסה בנייר דבק ומאוחסנים עד לשימוש עתידי.

2. יעד סלולרי תיוג (ט)

1. רוזן 5000000 תאי מטרה מתרבית תאים באמצעות hemocytometer וגלולת התאים במבחנה סטרילית 15 מיליליטר חרוטים ידי צנטריפוגה XG ב 340 למשך 5 דקות. תרבית התאים מתחלקת ביום הקודם בנפח כולל מ"ל 5 (צפיפות = 1 מ'/ מ"ל) ותרבית בבקבוק T-25 (VWR). פרוטוקולים לספירת תאים באמצעות hemocytometer תוארו בפירוט בעבר ¹¹
2. לשאוב תקשורת העודפת שמשאירה אחרי כ 50 μl של תקשורת.
3. הכן את פתרון עובד של תא Tracker אדום (CTR) על ידי ערבוב מניית ק"ל μl 0.5 (מ"מ 1) עד 150 μl RPMI-PLGH (ריכוז סופי 2.5 מיקרומטר). הוסף 150 μl של הפתרון עובד לתאי המטרה ומערבבת היטב באמצעות פיפטה P200.לחלופין, PKH 26 (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר) ניתן להשתמש בתאי מטרת תווית בהתאם להוראות היצרן.
4. לדגור על 37 מעלות% 5 / CO ₂ למשך 20 דקות.

3. (ה) סימון תא מפעיל

1. רוזן 5000000 תאי מפעיל מתרבית תאים באמצעות hemacytometer וגלולת התאים במבחנה סטרילית 15 מיליליטר חרוטים ידי צנטריפוגה XG ב 340 למשך 5 דקות.
2. לשאוב תקשורת העודפת
3. הכן את פתרון עובד של פתרון כתם DyeCycleViolet Vybrant ידי הוספת μl 1 מתוך מניות יולטו Vybrant 5 מ"מ ל1 מ"ל של R10 תקשורת (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר). הוסף פתרון עובד לתאים וresuspend באמצעות P200 פיפטה. לחלופין, PKH 67 (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר) ניתן להשתמש בתאי מטרת תווית בהתאם להוראות היצרן. אם PKH 67 משמש, אז SYTOX ירוק לא צריך להיות בשימוש מאז שהם נמצאים באותו הערוץ פלואורסצנטי. הספירה של מטרות אפופטוטיים נעשית באופן בלעדי באמצעותמכתים nnexinV במקרה זה.
   הערה: אם ביצוע זמן לשגות ולא מדידות נקודתי קצה, צבעי UV כמו ותולט Vybrant יש להימנע.
4. לדגור על 37 מעלות% 5 / CO ₂ למשך 20 דקות.

4. הפרדה של תאי חיים ומלח באמצעות שיפוע צפיפות

1. הוסף 6.8 מ"ל ו 6.0 מ"ל של RPMI-PLGH ליעד ותאי מפעיל, בהתאמה ומערבב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
2. 3.5 מיליליטר השכבה של Paque FICOLL פלוס לתחתיתו של כל צינור חרוטים המכיל תאי יעד ומפעיל. שכבת FICOLL לאט כדי להבטיח היווצרות טובה של שכבות בין FICOLL ותקשורת.
3. צנטריפוגה שני הצינורות ב340 XG למשך 30 דקות. ללא בלם ותאוצה.
4. במהלך צנטריפוגה, להעביר 7 מ"ל של PBS מראש שחומם לצלחת 4-כן. הכן מערך nanowell (מפוברק בPDMS): תחתון נקי של שקופיות זכוכית עם אתנול והחמצן PDMS בהגדרת RF גבוהה באמצעות חמצן פלזמה לדקה 1. צעד זה STErilize מערך nanowell גם בעת מתן PDMS הידרופילי. מייד להעביר את מערך nanowell לצלחת המכילה PBS.
5. להעביר את הצלחת לארון בטיחות ביולוגי ולשאוב PBS העודף. הפוך 1% אגר 10 מ"ל אציל על ידי הוספת האבקה אגר מ"ג 100 ל מי 10 מ"ל DI ולאחר מכן אותו למיקרוגל 30-45 שניות. החל לחמם 1% אגרו אצילי על קצה עליון ותחתון של שקופיות זכוכית המכיל את מערך nanowell כדי לשתק את המערך ולחכות 10 דקות לאגר לביסוס. הוסף 3 המ"ל PBS ואגר עודף aspirate.
6. הוסף 3 מ"ל של R10 אל גגו של מערך nanowell ולתת לו לאזן ל~ 10 דקות.
7. לאחר FICOLL צנטריפוגה, לשאוב 5 מיליליטר תקשורת מהשכבה העליונה של כל צינור. היזהר שלא לשאוב את השכבה המכילה את התאים.
8. לקצור את התאים (שכבה לבנה) על ידי מחל מ"ל 1-2 מהשכבה בין FICOLL ותקשורת עם P1, 000 פיפטה ומעבר לצינורות חרוטים סטריליים חדשים. חזור על פעולה זו עבור שתי הקבוצות של תאים תוך הקפדה שהאמרהize תאי ההתאוששות.
9. הוסף 3 מ"ל של טרום התחמם RPMI-PLGH לכל צינור, לערבב ידי pipetting וגלולה ידי צנטריפוגה XG ב 340 במשך 5 דקות בהאצה ובלמים מלאים.
10. לשאוב תקשורת העודפת, מוסיף 5 מ"ל של טרום התחמם RPMI-PLGH לכל צינור וחזור צנטריפוגה ב XG 340 במשך 5 דקות.
11. לשאוב תקשורת העודפת וresuspend התא גלול ב 500 μl של R10.
12. ספירת תאים חיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה Trypan על hemacytometer.

5. טוען תא על מערך Nanowell

1. לשאוב תקשורת העודפת ממערך nanowell ולהוסיף 2 מ"ל של R10 הטרי על המערך. לשאוב שוב תוך הקפדה העליונה של מערך nanowell הוא לא רטוב מדי / יבשה כמו זה ישפיע על חלוקת תאים.
2. הפקדת 1 x 10 ⁵ תאי מפעיל ב200 μl של R10 גבי משטח המערך nanowell (צפיפות = 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל).
3. בואו תאים להתפשר על 5 דקות ובאמצעות המחאת מיקרוסקופ תרבית רקמה סטנדרטית לenבטוח שחלוקת תאים רצויה. הוסף יותר תאים במידת צורך.
4. 1 פיקדון x 10 ⁵ תאי המטרה בR10 ​​μl 200 על פני מערך nanowell (צפיפות = 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל).
5. בואו תאים להתפשר על 5 דקות ובאמצעות המחאת מיקרוסקופ תרבית רקמה סטנדרטית כדי להבטיח שחלוקת תאים רצויה. הוסף יותר תאים במידת צורך.
6. יש לשטוף בזהירות עם מערך nanowell 2 מ"ל R10 ותקשורת העודפת לשאוב.
7. הכן 3 R10 מראש התחמם מ"ל בצינור חרוטי מיליליטר סטרילי 15. הוסף 3 μl של חומצה ירוקה 0.5mm SYTOX גרעין כתם (0.5 מיקרומטר ריכוז סופיים) ו 60 μl של Annexin V-Alexa פלואוריד 647 להכין פתרון עובד. הוסף פתרון עובד לצלחת 4-גם בזהירות תוך הקפדה שתאים אינם נעקרו מהבארות.
8. לדגור על 37 מעלות% 5 / CO ₂ למשך 15 דקות.

6. 1 הדמיה

1. לרכוש תמונות של מערך nanowell באמצעות micr פלואורסצנטיoscope: בדוגמה זו, אנו משתמשים אובזרוור ZEISS מיקרוסקופ Z-1 מצויד בשלב ממונע ומבדה-DG4.
2. לאתחל את התוכנה ומיקרוסקופ ולבדוק את עוצמת האות באור המועבר וערוצי הניאון האחרים. בסך הכל, יהיו חמישה ערוצים מקבילים: לאור מועבר, Annexin V-647 (Cy5 מסנן), שק"ל (DsRed מסנן), SYTOX גרין (FITC מסנן), וVybrant יולטו (DAPI מסנן). ודא שהתקנתו מיקרוסקופ כדי להבטיח אות לרעש מקסימלי תוך הימנעות רוויה.
3. הגדר X ו Y מיקום למערך nanowell. להתחיל את התהליך על ידי קביעת עמדת האפס ומאתחל את ההתמקדות במרכז הבלוק 7 x 7 nanowell מערך בפינה שמאלית העליונה של בול מערך nanowell. הגדר את x, y עמדות במקביל למרכזו של כל גוש וערך z כדי לשקף במדויק את הפוקוס על כל בלוק.
4. ברגע שהעמדה וההתמקדות כל הסט, הקפד להגדיר את רכישת תמונה במצב ליניארי ולרכוש תמונות. הערה: אם תורו צורך בחממה וCO ₂ במיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני הניסוי.

7. לאחר ההדמיה

להעביר את הצלחת 4-גם מכילה מערך nanowell לתוך חממה (37 ° C% / 5 CO ₂₎ עבור 6 שעות.

8. הדמיה 2

לרכוש את התמונות בזמן נקודה השנייה כפי שמתואר בשלב 6.

9. ניתוח תמונה

1. התפוסה של תאים בתוך nanowells נקבעת על ידי השימוש בתוכניות פילוח תמונה המתאימות (למשל ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/) למעשה כפי שתואר לעיל ^9,12.
2. ניתוח של הקבוצה הראשונית של תמונות מיקרוסקופ (t = 0 שעות; t ₀₎ משמש ליצירת מסד נתונים של nanowells הבודד המכיל בדיוק תא היעד חי אחד (מזוההעל ידי CellTracker האדום; האדום) ולא תאים מתים (שזוהה על ידי צביעת V Annexin, ירוק) _[0 T1t nanowells].
3. ניתוח של הסט השני של תמונות מיקרוסקופ (t = 6 שעות, ₆ t) משמש באופן עצמאי כדי לקבוע מסד נתונים המכיל nanowells שני של תא המטרה 1 (אדום) _[6 T1t nanowells]. בדיקת תקינות (שאילתא מסד נתונים), מיושמת כדי להבטיח שכל מטרות החיות בt ₀ מותאמות למטרות ב ₆ לא לייצר סט אחרון של מטרות מתאימות (מיושם כnanowells כי יש T1t ₀ = ₆ T1t, מיועד כT1match)
4. מספר תאי מפעיל בnanowells נקבע באמצעות שימוש מכתים ויולט Vybrant בt ₀ [nanowells E1]
5. שאילתא מסד נתונים מיושמת לזהות nanowells המכיל effectors הבודדה משותף מודגרות-עם יעדים יחידים (מוגדר כnanowells כי יש _התאמת E1 וT1, המיועדים כE1T1)
6. אפופטוזיס המושרה פעיל הוא הבקיע ידי dentifying מטרות שAnnexin V שליליים בt ₀ וAnnexin V החיובי בt ₄ (E1T1 עם מכתים יעד V Annexin בשעת ₆ t).

10. הדמיה אופציונלית זמן לשגות של הרג שימוש BioStation IM של ניקון

1. קח צלחת פטרי עם תחתית coverslip ולחתוך חתיכה קטנה של שבב מערך nanowell (מוכן בשלב 5) שתתאים בדיוק על coverslip. ודא שהשבב נשאר רטוב בעת חיתוך.
2. מערבבי 1 x 10 ⁶ יעדים ו -1 10 ⁶ תאי T x 100 בתקשורת, ופיפטה μl על coverslip.
3. אפשר כ 15-30 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב.
4. במהירות להפוך את שבב מערך nanowell הקטן ומניח אותו על coverslip.
5. על מנת להבטיח שהשבבים לא יוכלו להזיז אחד או שניים x 20mm coverslips 20mm במהלך ההדמיה, המקום על גבי השבב. להפעיל לחץ בשקט לדחוף את השבב לתחתית הצלחת.

אוהל "> הערה: החלק התחתון של שבב מערך nanowell עבה מדי להדמיה ברזולוציה גבוהה ולכן יש התהפך במהלך זה, רבים מהתאים נשטפים החוצה מכיוון שזו לא יכולה להיות מספרי קלות מבוקר, תאים בשלב 9.2.. וזמן דגירה בשלב 9.3 צריכים להיות מותאם.

תוצאות

דוגמה ליישום של assay cytolytic התפוקה הגבוהה באה לידי ביטוי באיור 2. בקצרה, שכותרת CAR CD19 ספציפי ⁺ תאי T נלקחו ביחד עם מודגרות-EL4 תאי מטרת עכבר שכותרתו בבארות הבודדות של מערך nanowell (סעיפים 1-5). תמונה ראשונית נרשמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי כדי לזהות את התפוסה (effectors ו / או מטרות) של כל אחת nanowell במערך (סעיף 6). עיבוד תמונה נעשה שימוש כדי לזהות את כל nanowells המכיל בדיוק מטרה אחת ומפעיל אחד ולהוציא nanowells המכיל מטרות מתות (סעיף 9...

דיון

נציין כאן את הפרוטוקול לבדיקת cytolytic תפוקה גבוהה מתא בודד אפשרה באמצעות שיתוף דגירה של effectors ויעדים במערכים של nanowells (איור 1). בנוסף לתפוקת יתרון עיקרי של השיטה הוא היכולת לנטר cytotoxicity פעיל בתיווך כנגד תאי המטרה רצויה ללא צורך בהנדסת תא היעד אשר בתורו מאפשר לשימוש בתאי autologous או התאמה / עיקריים סרטניים כתאי מטרה. הבידוד המרחבי מאפשר אחזור ושיבוט עוקב של תאי T תפקודיים בסוף assay ^9. הגבלה של assay היא הצורך במיקרוסקופים מיוחדים עם שלב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
RPMI-1640 w / o L-גלוטמין	Cellgro	15-040-CV
פניצילין סטרפטומיצין	Cellgro	30-002-CI	יחב"ל פניצילין מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין 10000 10000
L-גלוטמין	Cellgro	25-005-CI	פתרון 200 מ"מ
HEPES	סיגמה אולדריץ	H3537	1M
סרום שור עוברי (FBS)	אטלנטה ביולוגית	S11150	הרבה נבדק
תא Tracker כתם אדום	Invitrogen	C34552	50 מיקרוגרם
Vybrant DyeCycle יולט כתם	Invitrogen	V35003	5 מ"מ
חומצת גרעין הירוק SYTOX Stain	Invitrogen	S7020	5 מ"מ
Annexin V-Alexa פלואוריד 647	Invitrogen	A23204	500 μl
PBS של Dulbecco	Cellgro	21-031-CV	500 מ"ל
אגר נובל	DIFCO	2M220	100 גרם
Trypan הכחול	סיגמה אולדריץ	T8154	0.4% נוזל, סטרילי מסונן
Hemocytometer	האוסר Scientifics	1492	קו בהיר
צלחת 4-היטב	תרם פישר	167603
מנקה Harrick פלזמה	Harrick פלזמה	PDC-32G	שואב פלזמה בסיסי
Observer.Z1	ZEISS	מיקרוסקופ ניאון (עובד עם השלושה החלקים בהמשך)
מבדה 10-3	מכשיר סאטר		מסנן בקר
מבדה DG-4	מכשיר סאטר		Ultra-High-Speed ​​אורך הגל switcher
Hamamatsu EM-CCD מצלמה	Hamamatsu	C9100-13	מצלמת CCD-מיקרוסקופ
צינור 15 מ"ל חרוטים	BD פלקון	352097
צינור 50 מ"ל חרוטים	VWR	3282-345-300
ניקון Biostation	ניקון מכשירים בע"מ	Biostation IM
מנת תרבות תחתית הזכוכית	מאטק תאגיד	P35G-0	35 צלחת פטרי מ"מ, 10 המ"מ microwell