<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

סיכום

אנו מציגים In vivo בדיקה לבדיקת חדירות כלי דם. בדיקה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של הדמיה לצבוע ולאחר מכן של דיפוזיה שלו למרחבי ביניים.

תקציר

שיטה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בעכברים כמודל חית המבחן. אוונס הכחול הוא צבע שנקשר אלבומין. בתנאים פיסיולוגיים האנדותל בלתי חדיר לאלבומין, כך שרידי אלבומין כריכה כחולה אוונס מוגבל בתוך כלי דם. בתנאים פתולוגיים שמקדמים חדירות תאי אנדותל כלי דם מוגבר באופן חלקי לאבד הקשר הקרוב שלהם והאנדותל הופך חדיר לחלבונים קטנים כגון אלבומין. מצב זה מאפשר לextravasation של אוונס הכחול ברקמות. האנדותל בריא מונע extravasation של הצבע ברקמות כלי הדם הסמוכות. איברים עם חדירות מוגברות יציגו צבע כחול גדל באופן משמעותי בהשוואה לאיברים עם האנדותל בשלמותה. רמת חדירות כלי דם יכולה להיות מוערכת על ידי הדמיה פשוטה או על ידי מדידת כמותית של הצבע המשולבת למיליגרם של רקמה של שליטה מול חיים / רקמות ניסיוניות. שני poweהיבטי rful של assay זה הם הפשטות שלו ומאפייני כמותיים. אוונס הכחול צבע ניתן לחלץ מרקמות על ידי דוגר כמות מסוימת של רקמה בפוראמיד. מרבית הספיגה הכחולה אוונס הוא בעמ '620 ננומטר וספיגה מינימאלית היא ב740 ננומטר. באמצעות עקומת סטנדרט עבור אוונס הכחול, מדידות צפיפות אופטיות ניתן להמיר את צבע מיליגרם כבש למיליגרם של רקמה. ניתוח סטטיסטי יש להשתמש כדי להעריך הבדלים משמעותיים בחדירות כלי דם.

מבוא

גיבוש ותחזוקה של מחסומים חדירים סלקטיבית הם חיוניים להתפתחות איבר תקין ^ו1,2 ביצועים. תאי האנדותל קו לום כלי הדם ויוצרים מחסום חדיר למחצה כי הוא חיוני בהובלה סלקטיבית בין הדם למרחב ביניים של כל האיברים. מחסום חדירות נאותות נשמר באמצעות צומת תא לתא צפופים הנשלטים בקפידה על ידי גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות הקשורות מתח אחרות ^3. שיבוש של מכשול התא האנדותל יכול לגרום לחדירות מוגברות ודליפה של כלי דם. תופעות אלו נצפות במצבי מחלה שונים וההבנה של האיתות המולקולרית הקו התחתונה דורשת שיטות רבות תחומיות ^4,5. במאמר זה, אנו מתארים בשיטת vivo למדוד חדירות כולים תוך שימוש במודל עכבר.

פרוטוקול

1. הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בוריד זנב העכבר לרוחב

1. הכן 0.5% תמיסה סטרילית של אוונס הכחול ב PBS. במידת צורך, מסנן-לעקר את הפתרון כדי להסיר כל חומר חלקיקים שאינו מומס.
2. לשאוב פתרון 200 μl אוונס הכחול לתוך מזרק. הימנע מכל בועות האוויר שאולי נמלטו לתוך המזרק.
3. עכברי מקום שהם ישנים 8-12 שבועות לתוך מכשיר איפוק כדי שבעל החיים אינם חופשי ניידים אבל זנבו ניתן לטפל.
4. הנח את מכשיר איפוק העכבר על צי....

תוצאות

אנחנו השתמשנו בבדיקת חדירות vivo לבדוק זליגת כלי בעכברים 8-12 שבועות ישנים. בדיקה זו היא שימושית בהשוואת חדירות כלי דם היחסיות בין בעלי חיים של רקע גנטי שונה או בזן אחד של עכברים הנתונים לטיפולים המשפיעים על מערכת כלי הדם. התוצאות שלנו מראות כי זן של עכברים מהונדסים גנטי שנוצרנו במעבדה שלנו יש האנדותל חדיר יותר בהשוואה לעכברי סוג פראי. שינויים אלה ניכרים ברמת מקרוסקופית באיברים רבים (איור 1).

דיון

חדירות כלי דם היא סמן קריטי למצב כלי דם. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות נוכח בכמה מחלות מערכתיות, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ומחלות אוטואימוניות ^6,7,8. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות מתווכות על ידי מאמץ גזירה, גורמי גדילת כלי דם האנדותל כמו גורם גדילה ופקטור גדילה פיברובלסטים, מתווכים דלקתיים כמו סרוטונין, היסטמין וbradykinin ^9. Extravasation של מים ומולקולות קטנות הוא חשב להתרחש דרך פתחים קטנים בין תאי האנדותל. כוחו של צומת תא לתא מווסת בקפדנות על ידי אינטראק.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
			מגיב
אוונס כחול	SIGMA	E2129
פוראמיד	Invitrogen	15515-026
PBS			פוספט 0.2m 1.5M NaCl pH 7.4
			ציוד
ספקטרופוטומטרים	אפנדורף	952000006
התקן ריסון MOUSE	הרווארד מכשיר	340012
מזרק	BD	309659
מחטים	BD	305106	המד של המחט תלוי בגודלו של בעל החיים.
מאזן	מכשיר דנבר	TP-64