Assay Chemotaxis סי אלגנס

סיכום

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של Elegans Caenorhabditis מתואר. מדד chemotactic (CI) הועסק כדרך להעריך בדיוק את התגובה של תולעים למטרות מסוימות, ומשמש כפלטפורמה להשוואה בין זנים ותרכובות של עניין.

תקציר

אורגניזמים רבים משתמשים chemotaxis לחפש מקורות מזון, להימנע מחומרים רעילים, ולמצוא בני זוג. Caenorhabditis elegans יש התנהגות chemotaxis מרשימה.

הנחת היסוד מאחורי בודק את התגובה של התולעים לodorant הוא למקם אותם בשטח ולבחון את התנועה עוררה בתגובה לodorant. אפילו עם מבחני הזמינים רבים, אופטימיזציה של תולעת מתחילה מיקום יחסי הן לשליטה ואזורי מבחן, תוך מזעור האינטראקציה של תולעים אחד עם השני, תוך שמירה על גודל מדגם משמעותי נשארה בתהליך עבודה ^1-10. השיטה המתוארת כאן שואפת לטפל בבעיות אלה על ידי שינוי assay שפותח על ידי Bargmann et al. ^1. צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים, שני רביעים מול מסומנים "בדיקה" ושתיים מיועדים "שליטה". הרדמה ממוקמת בכל המבחן ובאתרי בקרה. את התולעים ממוקמים במרכזה של הצלחת עם circlדואר מסומן סביב המוצא כדי להבטיח שתולעים אינם נעימים ביהיו להתעלם ממנו. ניצול מערכת של ארבעה רביעים ולא אחד או שתיים 1 2 מבטל הטיה בתנועה של התולעים, כפי שהם במרחק שווה מדגימות בדיקה ובקרה, ללא קשר לאיזה צד של המקור שהם התחילו. זה עוקף את הבעיה של תולעים נאלצים לנסוע דרך מקבץ של תולעים אחרים להגיב לodorant, אשר יכול לעכב את התולעים או להכריח אותם לקחת דרך עקיפה יותר, מניב פרשנות שגויה של הנתיב המיועד שלהם. שיטה זו מראה גם יתרונות מעשיים על ידי בעל מדגם גדול יותר ומאפשר לחוקר להפעיל את assay ללא השגחה ולהבקיע את תולעי פעם אחת הזמן המוקצב פג.

מבוא

וורד פותח לראשונה בשנת 1973 assay chemotaxis ^5, ומאז יש לו יישומים מרחיקים לכת. נוירוביולוגיה היא תחום אחד שיש לו יתרון בשימוש במגוון רחב של מבחני chemotaxis. הסתגלות חוש הריח, צורה פשוטה של למידה וזיכרון, הודגמה בג elegans באמצעות מבחני chemotaxis ^6. הם גם היו בשימוש כדי להראות שג elegans יכול לפתח אתנול סובלנות-תוצאה שמדגימה את הגמישות התנהגותית של התולעים לא רק, אבל זה גם מראה כי התולעים יכולים להיות שימושיים מאוד במחקר של תלות באלכוהול בבני אדם ^3. מבחני אפילו פותחו כדי להדגים את יכולתו של ג elegans לאחסון קצר וזיכרון לטווח ארוך על ידי מראה כי עמותות מבוצעות על ידי התולעים בין chemoattractants ומזון (OP50) ^7. בנוסף, בהתחשב במידע הרב זמין כרגע לגבי ג elegans הגנום, chemotaxiהתנהגותו של ג של elegans השתנה פעמים רבות על ידי גרימת מוטציות ^1,8. זה מאפשר להרבה אפשרויות הנדסיות מרגשות, כגון פיתוח של ג elegans ככלי bioremediation. לכן, מאז הפיתוח הראשוני של assay chemotaxis בשנת 1973, זה כבר שינה בתדירות גבוהה ומשמש להבהיר תעלומות במגוון רחב של תחומים.

מבחני מסוימים שנועדו לגלות את המסלול הספציפי שצולם על ידי את התולעים לכיוון יעד. Assay הטיפוסי מסוג זה פותח על ידי וורד ^5. שלושה תולעים הונחו על אגר נמסו במשך 15 דקות. התנועות שלהם אותרו על ידי החותם שהשאיר כמו שהם נסעו מהפריפריה של הצלחת עד לשיפוע attractant במרכז הצלחת. כל התולעים על הצלחת נעצרו באמצעות כלורופורם בסופו של כל משפט. צאצא אחד של שיטה זו הניח תולעת אחת באמצע הצלחת עם attractant ושליטהמרחקים שווים והפך לא מהמקור ^2.

פירס-Shimomura et al. פיתחה assay להתבוננות בטבעה של התנועה מעורבת בchemotaxis ⁹ המדויק. תולעים בודדים הוצבו ב9 מנות ס"מ פטרי המכילים גם ריכוז אחיד של attractant או שיפוע בצורה רדיאלית, שהגיעו לשיא במקור attractant. תוכנת מחשב שזיהתה את התולעת הייתה בשימוש כדי להקליט את ההתנהגות הנצפית. מצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ עבדה בשיתוף עם הבמה כדי להתאים את צלחת פטרי באופן אוטומטי כassay רץ על מנת להבטיח את התולעת נשארה בשדה הראייה. מזה, מידע מפורט יותר התגלה לגבי הגורם לפירואטים המוצגים על ידי ג elegans.

מבחני אחרים, יותר דומים לזה שתואר כאן, בדקו את התגובה של אוכלוסייה גדולה של תולעים לתרכובות בדיקה. מבחני chemotaxis שתי כבר ברבעהשתמש כדי לחקור את התפקידים שנוירונים שונים, קולטנים, ומולקולות העברת אותות שיחק כאשר ג elegans נחשף לתרכובות שונות ^1. בין 20-50 תולעי שטף הוצבו בסמוך למרכז הצלחת עם attractant ושליטה בשני קצוות קוטביים יחד עם ההרדמה, אזיד הנתרן (NAN _3). לאחר 60 דקות, מדד chemotactic עם ערכים מ -1.0 ל 1.0 נוצר על בסיס ההפרש בין כמה תולעים הוצמדו לattractant או השליטה. מדד chemotactic דומה היה בשימוש בassay דיווח במאמר זה, אם כי assay קודם לכן לא הצליח להעריך אך ורק תולעים שאינן ניעתי. assay זה היה לאחר מכן הוחל בהמשך לבדיקת ההשפעות של אבלציה העצבית בchemotaxis.

וריאציה נוספת של assay האמור בוצעה בו 100-200 תולעים הונחו במרכז צלחת המכילה ארבעה רביעים ^3. רביעים סמוכים גם הכילו את המבחן אולשלוט בחומר. כמו במבחנים קודמים, התולעים היו משותקים על ידי הפעולה של אזיד הנתרן לפני שהבקיע. שיטה דומה מתוארת כאן כדרך להעריך את התגובות של ג elegans לתרכובות שונות. עם זאת, יש לו את השיטה מתחת לערך מוסף של הערכה רק תולעים שעברו מרחק סף המפריד נייד מנייחים תולעים.

מבחני אחרים לא שולבו הנחיות דומות להתעלמות תולעים נייחים. Frøkjær-ג'נסן et al. פיתחה assay תכליתי אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תרכובות מסיסים שניהם נדיפים ומים ^10. צלחת פטרי הייתה מחולקת לארבעה רבעים. הרביעים העליונים ותחתונים לא מכילים ממסים. הרבע השמאלי הכיל מים, והזכות הכילה attractant. כאשר בודקים odorants נדיפים, אנליטי הונח על המכסה של הצלחת, מעל רבע הראוי, ואילו תרכובות מסיסים במים הונחו ישירות על אגאr.

השיטות קיימים כיום להערכת תגובת chemotactic של ג elegans כל הזמן להיות מעודן כדי לייעל את נוחות השימוש, יעיל, ודיוק שלהם. כך, בעוד שיש לו את assay המתואר כאן את היכולת להעריך את המספר הגדול ביותר של תולעים (תפוקה המקסימלית:. 250 תולעים / לשעה לכל צלחת, מעט גדולה יותר מהתפוקה שהפגינה לי ואח' ^3); הוא כוח האמיתי של שיטה זו שיאו תמציתי של רבים מהמאפיינים של מבחני קודמים (טבלת 1).

פרוטוקול

1. הכנה / שטיפת התולעים

1. לסנכרן את התולעים עד ¹¹ בוגרים צעירים.
2. מיליליטר פיפטה 2 מתוך סל S על צלחת Chemotaxis ס"מ 5 של מבוים תולעים שפשוט ניקית את הדשא של OP50 E. coli. הטה את הצלחת לפי צורך כדי להבטיח את התולעים נשטפים מפני שטח הצלחת לתוך המאגר.
3. 1 מיליליטר פיפטה של ​​הפתרון בסל תולעת-S לתוך צינור microcentrifuge.
4. צנטריפוגה במשך 10 שניות תוך שימוש בPicoFuge 6,600 סל"ד.
5. לשאוב סל S, משאיר את הכדור ללא הפרעה של תולעים.
6. הוסף פתרון 1 S מ"ל בסל לצינור microcentrifuge, להפוך כמה פעמים כדי לשטוף את התולעים.
7. חזור על שלבים 1.4-1.6 עוד שלוש פעמים.
8. צנטריפוגה במשך 10 שניות פעם החמישית, הפעם aspirating supernatant לנפח סופי של CA. 100 μl.
9. פיפטה μl 2 של התולעים על גבי צלחת NGM על מנת להבטיח שיש בין 50 ל 250 תולעים בכל דגימת μl 2. להתאיםהריכוז של תולעים בסל S לפי צורך על ידי resuspending את התולעים בנפח קטן יותר או גדול יותר של סל S.
10. השתמש בתולעים בassay מייד לאחר שטיפה את התולעים עד שעה 1.

2. הכנת לוחות המבחן

1. סימון התחתון של צלחת 5 ס"מ, לחלק את המנה ל 4 רבעים שווים. ניתן להשתמש בו אגר chemotaxis או NGM. מינימום של 3 ניסויים נדרשים לזן גנטי הנבדקים.
2. סמן את העיגול ברדיוס של 0.5 ס"מ סביב המוצא (איור 1).
3. סמן את נקודה בכל רבע עם או "T" עבור "מבחן" או "C" עבור "בקרה", להבטיח כי באתרים הם במרחק שווה ממקורו ואחד את השני. הנקודות חייבים להיות לפחות 2 ס"מ מהמקור. סמן את הרביעים שמאליים והימניים תחתון כעליונים רביעים מבחן וצד ימין למעלה ורביעים שמאליים תחתונים כקבוצת ביקורת (איור 1).

3. פועל Assay

1. מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של בדיקת כמויות שווה של מתחם הבדיקה ו0.5 מ 'אזיד (הרדמה משמשת לעצור את התולעים עם הגיע ברבע). מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של שליטת הממס משמש לדילול מתחם הבדיקה עם אזיד M 0.5.
2. פיפטה μl 2 מפתרון התולעת (שהוכן ב1.8) מהגלולה על המקור (שבו שתי השורות מצטלבות).
3. מייד לאחר מכן, פיפטה μl 2 של פתרון המבחן על שני האתרים "T". כמו כן, פיפטה את אותה הכמות של תמיסת הבקרה על גבי שני האתרים "C".
4. ברגע שתולעת ואת טיפות odorant כבר נספגו באגרו, החלף את המכסים ולהפוך את הצלחות.
5. לאחר 60 דקות, הנח את התולעים ב4 ° C בחממה. להסיר רק צלחת מן החממה, כאשר ניתן לספור אותו. השארת תולעים בטמפרטורת חדר עשויה לאפשר להם לגייס שוב.
6. רשום את מספר התולעים בכל רבע שחצה את circ הפנימי לחלוטיןLe.
7. חזור על שלבים 3.2-3.6 באמצעות תמיסת הבקרה בשני ורביעי מבחן שליטה. זה ישמש כצלחת שליטה. שלוש צלחות כאלה צריכים להיעשות ולרוץ לשמש כשליטה מתאימה.

4. לפרש את הציונים / קביעת מדד Chemotaxis

1. לחשב את מדד chemotaxis באמצעות משוואה 1. זו תניב מדד chemotactic בין -1.0 ו 1.0.

(1)

Chemotaxis מדד = (# תולעים בשני רביעי מבחן - # תולעים בשני רביעי בקרה) / (סה"כ # מוורמס הבקיע)

ציון 1.0 מציין משיכה מקסימלי לעבר המטרה ומייצג 100% מהתולעים המגיעים ברביעים המכילים את היעד הכימי. מדד -1.0 מעיד על דחייה מקסימלי. שיטות assay דומות כבר מועסקות ³ (טבלת 1).

2. דווח על ממוצע Chemotaxiשל מדד (CI) ושגיאת תקן של משמעות (SEM). לבצע מבחן t של סטודנט השוואת הנתונים מצלחות הבדיקה ובקרה.

תוצאות

השוואה בין ג פראי סוג (N2) elegans לODR-10 (ky10) שעברו המוטציה.

אנחנו השתמשנו דיאצטיל, ג ידוע chemoattractant elegans, להשוות תולעי wildtype לזה של מוטציה שחסרה את הקולטן ^ל1,12 דיאצטיל. לwildtype (N2) תולעי מדד chemotactic היה 0.100 ± 0.066 לאתנול, ו0.839 ± .031-.5% דיאצטיל. כצפוי, דיאצטיל מעורר תגובת chemoattractive משמעותית מwild-type תולעים (P <0.003). ב...

דיון

Chemotaxis, למרות שנשלט על ידי מערכת מורכבת של מנגנונים עצביים וסלולריים, יכול להיות בקלות ובאופן אובייקטיבי לכמת באמצעות מבחני chemotaxis. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מכל מבחני, יש לנקוט בצעדים קריטיים מסוימים. ראשית, בימוי התולעים הוא חיוני במניב תוצאות ניסוי עולות בקנה אחד. תולעים בשלבי חיים שונים מתנהגים בצורה שונה ^13; תולעים בשלב כל כך מעורבים עשויים להטות תוצאות ניסוי. שנית, להבטיח לכל א ' coli הוא לשטוף את התולעים הוא קריטי, כשיירי חיידקים עלול...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O ל-1 ליטר.] אוטוקלב
PicoFuge	Stratagene	400552
מיקרוסקופים	Leica
חיתוך	Leica
Pipette P1000	Gilson
Pipette P10	Gilson
0.5 M Sodium Azide
אגר Chemotaxis [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) או 2% Difco-agar. אוטוקלב. מוסיפים 5 mM אשלגן פוספט, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/מי זיקוק
תרכובות בדיקה (למשל. 0.5% diacetyl)
אגר	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531