מאמר שיטה

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

DOI:

10.3791/50141

⸱

6 במרץ 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות פיסיות בין תחומי שומנים משובצים אלפא הסליל של חלבוני קרום לשחק תפקיד מכריע בקיפול והרכבה של קומפלקסי חלבוני קרום ובתהליכים דינמיים כגון הטרנסממברני (TM) איתות ובקרה של רמות חלבון על פני קרום תא. הבנת התכונות המבניות נהיגת העמותה של רצפים מסוימים דורשת ניתוחי biophysical וביוכימיים מתוחכמים של מתחמי פפטיד TM. עם זאת, hydrophobicity הקיצוני של תחומי TM גורם להם קשים מאוד לתמרן תוך שימוש בטכניקות כימית פפטיד סטנדרטיות, וייצור של חומר הלימוד המתאים לעתים קרובות מוכיח להחריד מאתגר. זיהוי תנאים שבם פפטידים יכולים לאמץ תצורות סליל יציבות ומתחמי צורה ספונטנית מוסיף רמה נוספת של קושי. כאן אנו מציגים הליך לייצור קומפלקסי פפטיד TM הטרו dimeric מחומרי הומו או שבאים לידי הביטוי בE. colאני, ובכך מאפשר שילוב של תוויות יציבות איזוטופים לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) או חומצות אמינו לא טבעיות ליישומים אחרים יחסית זול. החדשנות המרכזית בשיטה זו היא שקומפלקסי TM מיוצרים וטהרו כמכלולים הקשורים קוולנטית (דיסולפיד crosslinked-) כי יכול להיוצר מבנים יציבים, stoichiometric והומוגנית כאשר מחדש לחומרי ניקוי, שומנים בדם או חומרים אחרים קרום כוזבים. אנו מציגים גם נהלים מותאמים בקפידה לביטוי וטיהור שחלים גם אם הפקת תחומי TM בודדים או מתחמי crosslinked ולספק ייעוץ להתאמת שיטות אלה לרצפי TM חדשים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה הליך שפתחנו להפקת מתחמי דיסולפיד התייצבו-הטרנסממברני של פפטידים (TM) למחקרים מבניים באמצעות NMR פתרון. ההליך מנצל את הביטוי החזק הניתן על ידי מערכת היתוך ΔtrpLE1413 (ראה להלן) ומאפשר מתחמי פפטיד TM של הרכב מוגדר להיות שנוצר תוך שימוש בטכניקות תיוג-איזוטופ היציב מתוחכמות עבור ניסויי NMR רבי ממדים מודרניים. יש לנו מועסקים הטכניקות הללו כדי לקבוע כמה מבני NMR שחשפו מידע חדש וחשוב על איך immunoreceptors הלימפוציטים-מפעילות מורכבים מיחידות משנת חלבון קרום רבות באמצעות אינטראקציות בין תחומי TM (לאחרונה בדק ב1). טכניקות אלו חלות על מערכות רבות אחרות בממברנה חלבונים, כמו גם מגוון רחב של שיטות אנליטיות במורד זרם בנוסף לתמ"ג פתרון. אמנם הדוגמא שניתנה כאן מנצלת שאריות ציסטאין ילידיםליצירה מורכבת, שמחק באופן טבעי דיסולפיד מלוכדות החלבון, העיצוב הוא מתאים באותה מידה גם ליצירת קשרי דיסולפיד מהונדסים לייצב מתחמי שבדרך כלל מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות חלשות יותר, שאינן קוולנטיים כגון הומו והטרו מתחמי TM dimeric של קולט גורם גדילה באפידרמיס חלבונים (EGFR)-משפחה 2-4 או מתחמי integrin αβ heterodimeric 5,6.

רצפים פפטידים מאוד הידרופובי כגון אלה נגזרים משומני bilayer התפרסות על חלקים של חלבוני TM הם נושאים קשים ביותר למחקרים ביוכימיים וbiophysical. בנוסף להיות מאוד מאתגר לתמרן באמצעות חלבון סטנדרטי וטכניקות כימית פפטיד, הם לעתים קרובות למדי רעילים לתאים ולכן קשים לייצר recombinantly. אנחנו 7,8 ואחרים 9-11 יש לו הצלחה משמעותית לבטא רצפים פפטידים כה קשים בחיידקים כבמסגרת Carboxy-מסוףfusions לגרסה שונה של ΔtrpLE1413 הרצף נגזרת מE. coli trp אופרון 12. פוליפפטיד trpLE ~ 13 kDa מקודד על ידי רצף זה יכול להיות מיוצר ברמות גבוהות תחת אמרגן T7 והוא לגמרי מקומי לגופי הכללה בי בעיות הנוגעות לרעילות ו / או חוסר יציבות עוקפות. שינוי של הרצף על ידי תוספת של תג 9-היסטידין 13 וחיסול שאריות מתיונין וציסטאין פנימיים מרצף trpLE 14 fusions אפשר trpLE-פפטיד להיות מטוהר על ידי מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה ומתעכל באמצעות ציאנוגן ברומיד (CNBr-מסוף אמינית ) כדי לשחרר את רצף הפפטיד הרצוי. אנחנו השתמשנו בהצלחה במערכת זו כדי להביע יותר מתריסר רצפים שונים כמו fusions trpLE מייצג ברי חלבון קרום המכילים עד ארבעה תחומי TM (7,8 ותוצאות לא פורסמו; ראו סעיף דיון גם).

חדשנות מרכזית בפרוטוקול זה היא זיהוי של תנאים בי fusions בלתי המובנה וצורה הגרועה מאוד מסיס trpLE-TM יכול להיות יעיל דיסולפיד crosslinked-בהקשר של זרימת עבודה יעילה. כמה היבטים של ביטוי, טיפול תשואה גבוהה וטיהור של מוצרים פפטידים גם מוטבו ביסודיות, ואת ההמלצות שהציגו כאן הן לא פחות רלוונטיות לייצור שאינם דיסולפיד crosslinked-מוצרים (monomeric) TM פפטיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיבוט ועיצוב Construct

לשכפל את הרצפים של עניין לוקטור PMM-פפטיד (אשר יכול להיות מסופק על פי בקשה) בשימוש באתרי הגבלת BamHI (ראה תרשים 1) HindIII ו. להוסיף גדילי הדנ"א כפול צריך לשלב, לפי הסדר הבא: אתר HindIII; קודון מתיונין אחת למחשוף CNBr; E. פפטיד coli קודון המותאם לקידוד רצף; קודון עצירה; אתר BamHI. כל methionines האחר בפפטיד צריך לחסל ורצף dipeptide ASP-Pro יש להימנע ככל שזה יהיה גם הבקיע בתנאים חומציים.

שאריות ציסטאין ייחודיות צריכות להיות הציגה לכל רצף פפטיד פי המיצוב הרצוי של crosslink דיסולפיד במתחם סופי, וכל cysteines האחר יש מוטציה לסרין. פלסמיד נושא קלטת התנגדות kanamycin לבחירה.

2. ביטוי של trpLE-peptiפיוז'ן דה

  1. איפור ובינוני סטרילי מסנן M9/Kan מינימאלי צמיחה (0.1 המ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgSO 4, 3 ג'/ ליטר KH 2 PO 4, 7.5 גר '/ ל' Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 גר '/ L NaCl, 1 גרם / L NH 4 Cl, 4 גרם גלוקוז / L, סולפט 50 מ"ג / ליטר kanamycin). תוספת עם Centrum מלא לאבץ כדי לספק B-ויטמינים ומתכות קורט: לפזר 1 טבלית ב40 המ"ל H 2 O עם הערבוב למשך 30 דקות, צנטריפוגות כדי להסיר חומר מסיס וסטרילי סינון supernatant הכתום. פתרון חנות מנייה ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות ולהשתמש 4 מ"ל / ליטר בM9.
    הערה: 15 4 Cl N-מועשר NH, 13 גלוקוז C-מועשר או מבשרים אחרים יציב, איזוטופ שכותרת-עשוי להיכלל במדיום M9 בשלב זה אם רוצה.
  2. לחסן תרבות המתנע 100 מ"ל מהפך טרי BL21 (DE3) המתח E. חיידק במדיום M9/Kan. לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס עם הרעד ב 200 סל"ד.
  3. למחרת בבוקר, בדוק את OD 600 של תרבות המתנע - זה צריך להיות בטווח של 2 או יותר. דלל את תרבות 100 מיליליטר המתנע לנפח כולל של 1 הליטר Centrum-M9 תוספת בינונית. התפצל לשתי 2 צלוחיות מבולבלות L (500 מיליליטר תרבות בכל בקבוק) ולגדול ב 37 ° C רועד ב 140 סל"ד עד 600 OD מגיע 0.6.
  4. הגדר את הטמפרטורה ייקרה עד 18 מעלות צלזיוס ולהמשיך רועדים לשעה 1, המאפשר תרבויות להתקרר לחלוטין לפני הגיוס.
  5. קח לדוגמה טרם גיוס לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1), לאחר מכן להוסיף IPTG לריכוז סופי 0.1 מ"מ כדי לגרום ביטוי של היתוך trpLE-פפטיד. להמשיך ולצמוח ב18 ° C/140 סל"ד הלילה (16-20 שעות) תחת אינדוקצית IPTG.

3. הכנת גוף הכללה ועקידת מטריקס ניקל

  1. OD 600 של תרבויות ביטוי הלילה במדיום מינימאלי הסופי הוא משתנה וshould להיות בין 2.5 ל 5.0. קח דוגמה לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1) ולאסוף תאים על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב5000 x גרם.
  2. Resuspend תא גלול מתרבות 1 ליטר בחיץ תמוגה מ"ל 50 (50 mM טריס-HCl pH 7.5, 20 מ"מ β-ME, 0.2 מ 'NaCl). מתלי תא ניתן לאחסן קפוא לעיבוד מאוחר יותר.
  3. Lyse תאים על ידי sonication על קרח בתפוקה מקסימלית לדקות 1 ומנוחה על קרח למשך 5 דקות. אנו משתמשים Sonicator Misonix 3000 (600 ואט פלט לכל היותר) עם קצה בעצמה גבוהה להחלפת ½ אינץ'. חזור sonication / קירור לשלושה מחזורים.
  4. איסוף הכללת גוף חומרי לא מסיסה (IB) על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב20000 XG ולהשליך supernatant. שכבה רופפת, דקה של פסולת תא בצבע בהיר יכולה להיות גלויה בחלק העליון של IB הגלולה הצפופה, זה יכול להיות נשטף באמצעות מים או חיץ עם תסיסה עדינה. ניתן לחזור על שלבים 3.3 ו 3.4 כדי לשפר את הטוהר של שבריר IB אם desiאדום. דוגמאות של גלולה וחומר supernatant צריכות לקחת לניתוח SDS-PAGE כדי לאשר לוקליזציה היתוך trpLE-TM לגופי הכללה.
  5. ממס IB כדורים בguanidine פתרון (6 M guanidine HCl, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 מ"מ β-ME), תוך שימוש ב25-50 מ"ל לליטר של תרבות מעובד. צעד זה יחייב כמה שעות עם תסיסה וsonication קל מדי פעם.
  6. נקה IB lysate ידי צנטריפוגה לשעה 1 ב75,000-100,000 XG ו20 ° C. למזוג supernatant וסינון דרך קרום מיקרומטר 0.2.
  7. שלב פינה IB lysate, בצינור 50 מיליליטר חרוטים או כלי גדול שיכול להיות סגור היטב, עם שרף זיקת ניקל שנשטף במים ומתאזנים לפתרון guanidine. השתמש שרף התיישב מ"ל 3-4 לליטר של תרבות מעובדים לfusions שמבטא במידה דומה כמו trpLE-DAP12TM מוצג כאן (איור 3, בסמטה 2). לאגד תצווה על ידי דוגר בלילה בחדר לא emperature עם ערבוב עדין.

4. Crosslinking חמצונים בטור

  1. טען השעית lysate / ניקל IB השרף לעמודת זרימה הכבידה ריקה עם תמיכת מיטה נקבובית, והוסיף ברציפות עד שכל הנפח זורם דרכו. לאסוף ולשים בצד flowthrough, שעדיין עשויה להכיל חלבון היתוך לא מאוגד.
  2. שטוף את שרף ניקל ידי זרימה הכבידה עם 5 כרכי המיטה של ​​תמיסת אוריאה (8 אוריאת M, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl) המכילים 5 מ"מ β-ME.
  3. שטוף את שרף ניקל שוב עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה בלי β-ME.
  4. שטוף את שרף ניקל פעם שלישית עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה שכבר השלימו עם 20 מיקרומטר CuSO 4 ו2 מ"מ החמצון גלוטתיון. לאחר שטיפה זו, סגור את שקע העמודה ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר היווצרות קשרי דיסולפיד מקסימלי.

5. Elution וquantitation TFA

תוכן "> זהירות: חומצת Trifluoroacetic (TFA) גורמת לכוויות קשות במגע עם עור ואדים הם מעצבן ביותר TFA המרוכז יש להשתמש רק במנדף כימי אושר בהגנה על עין וכפפות ללא לטקס בדקו את התאימות הכימית מכולם.. חומרים בשימוש; פוליפרופילן תואם את כל השלבים של פרוטוקול זה.

  1. לשטוף את פתרון אוריאת חמצון עם 10 כרכי מיטה של ​​מים ולייבש את מיטת העמודה על ידי יישום שורת ואקום לשקע עמודה.
  2. סגור את שקע העמודה ולהוסיף 1.5 כרכים של מיטה המסודר (99-100%) TFA. מערבב את שרף ניקל עם מרית קטנה כדי להבטיח אפילו חשיפה לחומצה ודגירה במשך 5 דקות. פתח את שקע העמודה ולאסוף eluate החומצה, pressurizing עדינות עם מזרק או קו האוויר דחוס במידת צורך לדחוף את כל הנוזלים.
  3. חזור על שלב elution חומצה עם 1.5 כרכים עוד מיטה של ​​TFA המסודר. לעבוד במהירות בשלב זה כדי להימנע מפירוק מלא של beadeד agarose מטריצה. תשואת חלבון ניתן לקבוע בשלב זה על פי משוואת באר למברט ומקדם ההכחדה הטוחנת התיאורטית של רצף trpLE-פפטיד. לדלל מדגם של eluate TFA (1:20-01:50) בtrifluoroethanol (TFE) ולמדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, באמצעות TFA / TFE באותו הדילול כריק.

6. עיכול CNBr

זהירות: ברומיד Cyanogen (CNBr) הוא רעיל ביותר ויש לטפל רק בברדס אשר כימי קטר. PPE כולל משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות לטקס שאינם נדרשים באופן מוחלט. CNBr הוא תגובה ללחות ויש להביא לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. צור קשר עם משרד הביטחון המוסדי לקבלת הוראות לנטרול / סילוק של פתרונות CNBr מזוהמים וחומרים.

  1. דלל את eluate החומצה לריכוז TFA סופי 80% על ידי בנוסף dropwise של מים תוך כדי הערבוב בעדינות. אם נוצר משקע,dd חזרה נפח קטן (0.5-1 מ"ל) של TFA המסודר עד שהתמיסה מבהיר, אז מחדש נכונה עד 80% במים. קח 5 מדגם מראש לעכל μl לניתוח SDS-PAGE, הקפאה בחנקן נוזלי וlyophilizing המדגם באופן מיידי.
  2. הוסף גבישי CNBr לכ -0.2 גר '/ מ"ל, מטפל לשקול כימי הרעילה בבטחה בצינורות סגורים, מראש שקלו או באמצעות איזון בתוך מנדף הכימי. מערבב בעדינות עד שהיא נמסה לחלוטין. לשטוף ולאטום את כלי תגובה בגז אינרטי (חנקן או ארגון זרם) ולדגור שעות 3-4 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור.
  3. קח 5 מדגם הפוסט לעכל μl לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. להעביר את התגובה לקלטת לעכל תאית מחדש דיאליזה או צינורות (יצטט תאית יתמוסס בחומצה מרוכזת) עם הפסקת משקל מולקולרית של 3.5 kDa או פחות, בהתאם לגודלו של מתחם פפטיד הצפוי. דיאליזת הלילה עד 4 ליטר מים במנדף הכימי כדי להפחית את ריכוז TFA ולפרק כל CNBr unreacted. השאר מקום בקלטת הדיאליזה או צינורות לגידול משמעותי בנפח (כמו שתיים ושלושה של פי) במהלך דיאליזת הלילה.
  4. הסר את פתרון תגובת הדיאליזה עם משקע הושעה מקלטת הדיאליזה או צינורות (רוב החלבון יזרזו כאשר ריכוז TFA מצטמצם) ולהעביר את ההשעיה עד 50 צינורות חרוטי מ"ל. הקפא וlyophilize להסיר מים ועקבות של CNBr / TFA. צעד זה עשוי לדרוש כמה ימים.
    זהירות: שניהם תגובה לעכל דיאליזה ודיאליזת המים צריכה להמשיך להתייחס אליהם כרעיל וטפל / נפטר עם אמצעי זהירות מתאים.
  5. דוגמאות של תרבויות משלבים טרם גיוס וקציר, הכללת הגוף supernatant וגלול, eluate TFA וCNBr-מתעכל חומר עשויות להיות מנותחות על ידי SDS-PAGE. הכן את הדגימות על ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בInvitrogen NuPAGE LDS samplחיץ דואר. דגימות לעכל eluate וTFA צריך להיות מוכן בתנאי שני הקטנה ולא להפחתה לזיהוי ולהערכה של מוצר crosslinking חמצונים.
  6. הפרד את הדוגמות על 12% ג'ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide באמצעות MES-SDS חיץ פועל לרזולוציה אופטימלית של המוצרים לעכל הקטנים ביותר.

7. טיהור של מכלולי פפטיד דיסולפיד-crosslinked HPLC התהפך שלב

  1. ממס עד 100 מ"ג של מוצרים לעכל lyophilized לחומצה פורמית 2-3 מ"ל מסודר ועומס על preparative קנה מידה (21.2 x 150 מ"מ) Agilent ZORBAX SB-300 C3 עמודת PrepHT בממס (בדרך כלל אצטוניטריל 10-20% או 5 -10% Isopropanol במים עם 0.1% TFA).
  2. Elute את המוצרים לעכל בשיפוע של B ממס (אצטוניטריל או isopropanol עם 0.1% TFA) על לפחות 5 כרכי עמודות. ראה דיון להצעות על הבחירה של שיפוע תנאים אופטימליים לרצפים פפטידים שונים.
  3. לקחת50-100 דגימות μl מכל שבריר HPLC לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. הסרת ממסי HPLC היא מהירה וצריכה להיות מלא ב1-2 שעות.
  4. הכן דגימות HPLC lyophilized לSDS-PAGE ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בחיץ מדגם LDS NuPAGE Invitrogen ללא סוכן צמצום. מצננים ולפצל כל דגימה שווה ל 2 צינורות microcentrifuge, והוסיף DTT 100 מ"מימ לאחד מהם וחימום מחדש לזמן קצר.
  5. הפרד את דגימות HPLC המופחתות ואינן מופחתות על 12% ג'ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide עם MES-SDS ריצת חיץ כאמור לעיל. פפטידים קטנים, הידרופובי לעתים קרובות לא יתפסו Coomassie הכתם היטב ולא יכולים לרוץ במשקלים המולקולריים הצפויים שלהם. עם זאת, השוואה של דגימות מופחתות ואינן מופחתות צריכה להקל זיהוי של המוצרים וההערכה של טוהר פפטיד crosslinked.
  6. נתח את שברי מועמד פפטיד המכילים על ידי מטריקס בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסה (MALDI TO-F) ספקטרומטריית מסה (ראה דיון) כדי לזהות את המין של עניין ולאשר המוניים הצפויה שלו.
  7. שלב, להקפיא וlyophilize שברי HPLC המכילים קומפלקס הטהור, crosslinked TM פפטיד ולקחת משקל יבש של המוצר הסופי כדי לקבוע את התשואה. שברים עם תוכן isopropanol גבוה לא יכולים להישאר קפואים. אם שברי פפטיד להתייבש עד לסרט ולא מוצר lyophilized אוורירי, מחדש להתמוסס לחלוטין בסרט נפח קטן של טהור hexafluoroisopropanol (HFIP), להקפיא וlyophilize שוב. מוצר HFIP טופל צריך להיות חרוט קטן, לבן, כי הוא הטה קלות החוצה ומשקליו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמת הביטוי להושגה fusions trpLE היא משתנה ותלוי מאוד ברצף החומצות האמינו של הפפטיד המצורף. איור 3 מציג את ניתוח SDS-PAGE של טרם הגיוס (1 נתיב) וזמן של קציר (מסלול 2) דגימות מתרבות שהניבה כ 120 מ"ג של היתוך טהור, שלם trpLE-DAP12TM מ1 ליטר של התרבות ומטריצת ניקל מ"ל 4. כל היתוך trpLE-DAP12TM היה מקומי להכללת גוף הכדורי (מסלול 4) בניגוד לsupernatant (3 נתיבים).

כ 70% מהיתוך ניקל מטוהר-trpLE-DAP12TM ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביטוי של fusions trpLE-TM. מניסיוננו, fusions trpLE-TM מבוטא היטב במדיום התרבות עשיר על 37 מעלות צלזיוס, ובתנאים שתוארו כאן התרבות הוכיחו מוצלחים עבור רצפים שונים המכילים 1-4 תחומי TM עם תשואות הנעות 50-150 מ"ג / ליטר של היתוך טהור, ללא פגע. קידוד fusions שלוש או ארבעה שברי TM GPCR (CCR5 האנושי TM1-TM3 וTM4-TM7, בהתאמה) או שבר קטליטי ליבה של peptidase פפטיד אות האנושית (ארבעה תחומי TM, ראה שופט 15) מייצג הנמוכים ביותר בטווח זה של ביטוי רמות, ואילו גרסות D...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון עבור עבודה זו ניתן על ידי ביטוח בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC פרויקט מענק 1011352 לMEC וMJC; תכנית מחקר עצמאית מכוני תשתיות תמיכה [IRIISS] מענק לWEHI) והממשלה ויקטוריאני (VESKI חדשנות המלגה לMEC; תמיכת מדינה ויקטוריאני ממשלה תפעולית תשתיות לWEHI). MEC הוא עמית אליזבת שנייה מלכת המועצה למחקר האוסטרלי. EFXB מודה תמיכה מתכנית נורמה ילדת שוסטר המלגות באוניברסיטת מלבורן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב / חומרים חברה מספר קטלוגים תגובות
ציאנוגן ברומיד ALDRICH P.No-C91492, CAS-506-68-3 חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים. מאוד רעילים בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. צור עם חומצות משחרר גזים רעילים מאוד. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית.
חומצת Trifluoroacetic SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387, מספר CAS 76-05-1 חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים., גורמים לכוויות קשות. מזיק בשאיפה. מזיק לאורגניזמים ימיים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית.
2-Mercaptoethanol SIGMA-ALDRICH P.No M7154, מספר CAS 60-24-2 חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. רעיל בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. מרגיז לעור. סיכון לניזק חמור לעיניים. עלול לגרום לרגישות במגע עם עור. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SIGMA-ALDRICH מספר המוצר 52512, CAS-לא. 920-66-1 חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. מזיק בשאיפה ובבליעה. גורם לכוויות.
חומצה פורמית המרק KGaA K41186564 נוזל דליק ואדים. יוצר כוויות קשות ולניזק לעיניים.
אוריאה Univar, AJAX FINECHEM מספר מוצר, 817, CAS-לא 57-13-6 כאשר מחומם, דצמברomposes לפחמן דו חמצני ואמוניה, ואם נשרף, פולט כמויות קטנות של תחמוצות חנקן. יכול לגרום לאדמומיות וגירוי של עור ועיניים.
מושהה guanidine Amresco P.No-M110, מספר CAS: 50-01-1 מזיק אם נבלע, גורם לגירוי חמור בעיניים, גורם לגירוי עור, רעילויות חריפות, גירוי עור, גירוי עיניים שבעל פה.
Triton X-100 SIGMA מספר-T8532 מוצר CAS לא: 9002-93-1 טריטון X-100 הוא חומר ניקוי nonionic, 100% חומר פעיל, המשמש לעתים קרובות ביישומים ביוכימיים לsolubilize חלבונים. X-100 טריטון אין מאפיינים מיקרוביאלית ונחשב חומר ניקוי מתון יחסית שאינם denaturing-
בחירתו-ג'ל ניקל הזיקה SIGMA-ALDRICH מספר סידורי-P6611 ג'ל זיקת ניקל IS-בחירה הוא מוצר משותק מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה (IMAC). HIS-בחירת ניקאל זיקת ג'ל הוא chelate quadridentate קניינית בחרוזי agarose הואשם בניקל, שפותח במיוחד כדי לאגד חלבונים המכילים היסטידין.
(-)-גלוטתיון, מתחמצן SIGMA-ALDRICH מספר סידורי 150568
sonicator Misonix S-3000 QSONICA S-3000 (שהופסק) תפוקת הספק מרבי 600 ואט. חללית 1/2-inch-טיפ להחלפה לוקחת בעצמה גבוהה 1/2-inch, טיפים בנפח גבוה ומגוון בעצמה גבוהה, טיפים בנפח נמוך. מודלים הקרובים ביותר הזמינים כיום מחברה זו הם Q500 וQ700.
RP-HPLC: מערכת כרומטוגרפיה DuoFlow ביולוגית, גרסת תוכנה 5.3 Bio-Rad Laboratories מספר סידורי 760-0047, Config לא: AU500571, מספר סידורי: 484BR3705 הפפטידים נקשרו להפוך עמודות שלב HPLC בaq הגבוהשלב ונייד ueous הם eluted מעמודות RP HPLC עם שלב נייד אורגני גבוה. בRP פפטידים HPLC מופרדים מבוססים על האופי הידרופובי. פפטידים יכולים להיות מופרדים על ידי ריצת שיפוע ליניארי של הממס אורגני.
טור Prep HT C3 ZORBAX 300SB-אנליטי HPLC, 21.2 מ"מ 150 x, גודל חלקיקים מיקרומטר 5 Agilent לא מוצר: 895150-909 התהפך שלב HPLC קולום
Bis-טריס NuPAGE 12% ג'ל חי טכנולוגיות NP0341BOX ג'ל אלקטרופורזה היצוקה המוקדם לחלבון
קלטות Slide-A-G2 Lyzer דיאליזה, 3.5K MWCO Thermo Scientific לא מוצר: 87724 דיאליזת מדגם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

E coliHPLCSDS Page

מאמרים קשורים