מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אינטראקציות פיסיות בין תחומי שומנים משובצים אלפא הסליל של חלבוני קרום לשחק תפקיד מכריע בקיפול והרכבה של קומפלקסי חלבוני קרום ובתהליכים דינמיים כגון הטרנסממברני (TM) איתות ובקרה של רמות חלבון על פני קרום תא. הבנת התכונות המבניות נהיגת העמותה של רצפים מסוימים דורשת ניתוחי biophysical וביוכימיים מתוחכמים של מתחמי פפטיד TM. עם זאת, hydrophobicity הקיצוני של תחומי TM גורם להם קשים מאוד לתמרן תוך שימוש בטכניקות כימית פפטיד סטנדרטיות, וייצור של חומר הלימוד המתאים לעתים קרובות מוכיח להחריד מאתגר. זיהוי תנאים שבם פפטידים יכולים לאמץ תצורות סליל יציבות ומתחמי צורה ספונטנית מוסיף רמה נוספת של קושי. כאן אנו מציגים הליך לייצור קומפלקסי פפטיד TM הטרו dimeric מחומרי הומו או שבאים לידי הביטוי בE. colאני, ובכך מאפשר שילוב של תוויות יציבות איזוטופים לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) או חומצות אמינו לא טבעיות ליישומים אחרים יחסית זול. החדשנות המרכזית בשיטה זו היא שקומפלקסי TM מיוצרים וטהרו כמכלולים הקשורים קוולנטית (דיסולפיד crosslinked-) כי יכול להיוצר מבנים יציבים, stoichiometric והומוגנית כאשר מחדש לחומרי ניקוי, שומנים בדם או חומרים אחרים קרום כוזבים. אנו מציגים גם נהלים מותאמים בקפידה לביטוי וטיהור שחלים גם אם הפקת תחומי TM בודדים או מתחמי crosslinked ולספק ייעוץ להתאמת שיטות אלה לרצפי TM חדשים.
מבוא
בפרוטוקול זה הליך שפתחנו להפקת מתחמי דיסולפיד התייצבו-הטרנסממברני של פפטידים (TM) למחקרים מבניים באמצעות NMR פתרון. ההליך מנצל את הביטוי החזק הניתן על ידי מערכת היתוך ΔtrpLE1413 (ראה להלן) ומאפשר מתחמי פפטיד TM של הרכב מוגדר להיות שנוצר תוך שימוש בטכניקות תיוג-איזוטופ היציב מתוחכמות עבור ניסויי NMR רבי ממדים מודרניים. יש לנו מועסקים הטכניקות הללו כדי לקבוע כמה מבני NMR שחשפו מידע חדש וחשוב על איך immunoreceptors הלימפוציטים-מפעילות מורכבים מיחידות משנת חלבון קרום רבות באמצעות אינטראקציות בין תחומי TM (לאחרונה בדק ב1). טכניקות אלו חלות על מערכות רבות אחרות בממברנה חלבונים, כמו גם מגוון רחב של שיטות אנליטיות ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שיבוט ועיצוב Construct
לשכפל את הרצפים של עניין לוקטור PMM-פפטיד (אשר יכול להיות מסופק על פי בקשה) בשימוש באתרי הגבלת BamHI (ראה תרשים 1) HindIII ו. להוסיף גדילי הדנ"א כפול צריך לשלב, לפי הסדר הבא: אתר HindIII; קודון מתיונין אחת למחשוף CNBr; E. פפטיד coli קודון המותאם לקידוד רצף; קודון עצירה; אתר BamHI. כל methionines האחר בפפטיד צריך לחסל ורצף dipeptide ASP-Pro יש להימנע ככל שזה יהיה גם הבקיע בתנאים חומציים.
שאריות ציסטאין ייחודיות צריכות להיות הציגה לכל ר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רמת הביטוי להושגה fusions trpLE היא משתנה ותלוי מאוד ברצף החומצות האמינו של הפפטיד המצורף. איור 3 מציג את ניתוח SDS-PAGE של טרם הגיוס (1 נתיב) וזמן של קציר (מסלול 2) דגימות מתרבות שהניבה כ 120 מ"ג של היתוך טהור, שלם trpLE-DAP12TM מ1 ליטר של התרבות ומטריצת ניקל מ"ל 4. כל היתוך trpLE-DAP12TM היה מקומי להכללת גוף הכדורי (מסלול 4) בניגוד לsupernatant (3 נתיבים).
כ 70% מהיתוך ניקל מטוהר-trpL.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הביטוי של fusions trpLE-TM. מניסיוננו, fusions trpLE-TM מבוטא היטב במדיום התרבות עשיר על 37 מעלות צלזיוס, ובתנאים שתוארו כאן התרבות הוכיחו מוצלחים עבור רצפים שונים המכילים 1-4 תחומי TM עם תשואות הנעות 50-150 מ"ג / ליטר של היתוך טהור, ללא פגע. קידוד fusions שלוש או ארבעה שברי TM GPCR (CCR5 האנושי TM1-TM3 וTM4-TM7, בהתאמה) או שבר קטליטי ליבה של peptidase פפטיד אות האנושית (ארבעה תחומי TM, ראה שופט 15) מייצג הנמוכים ביותר בטווח זה של ביטוי רמות, ואילו גרסות D.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מימון עבור עבודה זו ניתן על ידי ביטוח בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC פרויקט מענק 1011352 לMEC וMJC; תכנית מחקר עצמאית מכוני תשתיות תמיכה [IRIISS] מענק לWEHI) והממשלה ויקטוריאני (VESKI חדשנות המלגה לMEC; תמיכת מדינה ויקטוריאני ממשלה תפעולית תשתיות לWEHI). MEC הוא עמית אליזבת שנייה מלכת המועצה למחקר האוסטרלי. EFXB מודה תמיכה מתכנית נורמה ילדת שוסטר המלגות באוניברסיטת מלבורן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב / חומרים | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| ציאנוגן ברומיד | ALDRICH | P.No-C91492, CAS-506-68-3 | חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים. מאוד רעילים בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. צור עם חומצות משחרר גזים רעילים מאוד. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. |
| חומצת Trifluoroacetic | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, מספר CAS 76-05-1 | חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים., גורמים לכוויות קשות. מזיק בשאיפה. מזיק לאורגניזמים ימיים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, מספר CAS 60-24-2 | חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. רעיל בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. מרגיז לעור. סיכון לניזק חמור לעיניים. עלול לגרום לרגישות במגע עם עור. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | מספר המוצר 52512, CAS-לא. 920-66-1 | חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. מזיק בשאיפה ובבליעה. גורם לכוויות. |
| חומצה פורמית | המרק KGaA | K41186564 | נוזל דליק ואדים. יוצר כוויות קשות ולניזק לעיניים. |
| אוריאה | Univar, AJAX FINECHEM | מספר מוצר, 817, CAS-לא 57-13-6 | כאשר מחומם, דצמברomposes לפחמן דו חמצני ואמוניה, ואם נשרף, פולט כמויות קטנות של תחמוצות חנקן. יכול לגרום לאדמומיות וגירוי של עור ועיניים. |
| מושהה guanidine | Amresco | P.No-M110, מספר CAS: 50-01-1 | מזיק אם נבלע, גורם לגירוי חמור בעיניים, גורם לגירוי עור, רעילויות חריפות, גירוי עור, גירוי עיניים שבעל פה. |
| Triton X-100 | SIGMA | מספר-T8532 מוצר CAS לא: 9002-93-1 | טריטון X-100 הוא חומר ניקוי nonionic, 100% חומר פעיל, המשמש לעתים קרובות ביישומים ביוכימיים לsolubilize חלבונים. X-100 טריטון אין מאפיינים מיקרוביאלית ונחשב חומר ניקוי מתון יחסית שאינם denaturing- |
| בחירתו-ג'ל ניקל הזיקה | SIGMA-ALDRICH | מספר סידורי-P6611 | ג'ל זיקת ניקל IS-בחירה הוא מוצר משותק מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה (IMAC). HIS-בחירת ניקאל זיקת ג'ל הוא chelate quadridentate קניינית בחרוזי agarose הואשם בניקל, שפותח במיוחד כדי לאגד חלבונים המכילים היסטידין. |
| (-)-גלוטתיון, מתחמצן | SIGMA-ALDRICH | מספר סידורי 150568 | |
| sonicator Misonix S-3000 | QSONICA | S-3000 (שהופסק) | תפוקת הספק מרבי 600 ואט. חללית 1/2-inch-טיפ להחלפה לוקחת בעצמה גבוהה 1/2-inch, טיפים בנפח גבוה ומגוון בעצמה גבוהה, טיפים בנפח נמוך. מודלים הקרובים ביותר הזמינים כיום מחברה זו הם Q500 וQ700. |
| RP-HPLC: מערכת כרומטוגרפיה DuoFlow ביולוגית, גרסת תוכנה 5.3 | Bio-Rad Laboratories | מספר סידורי 760-0047, Config לא: AU500571, מספר סידורי: 484BR3705 | הפפטידים נקשרו להפוך עמודות שלב HPLC בaq הגבוהשלב ונייד ueous הם eluted מעמודות RP HPLC עם שלב נייד אורגני גבוה. בRP פפטידים HPLC מופרדים מבוססים על האופי הידרופובי. פפטידים יכולים להיות מופרדים על ידי ריצת שיפוע ליניארי של הממס אורגני. |
| טור Prep HT C3 ZORBAX 300SB-אנליטי HPLC, 21.2 מ"מ 150 x, גודל חלקיקים מיקרומטר 5 | Agilent | לא מוצר: 895150-909 | התהפך שלב HPLC קולום |
| Bis-טריס NuPAGE 12% ג'ל | חי טכנולוגיות | NP0341BOX | ג'ל אלקטרופורזה היצוקה המוקדם לחלבון |
| קלטות Slide-A-G2 Lyzer דיאליזה, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | לא מוצר: 87724 | דיאליזת מדגם |
מקורות
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
