Method Article

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

DOI:

10.3791/50143

⸱

August 20th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים את השימוש בהתקנת microfluidic פשוט, שבו ניתן לעקוב אחר תאי שמרי ניצנים בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם. שבב microfluidic מנצל את ההבדל בגודל בין תאים אם ובתה באמצעות מערך של micropads. לאחר הטעינה, תאים לכודים מתחת micropads אלה, משום שהמרחק בין micropad ומכסה הזכוכית דומה לקוטר של תא שמרים (מיקרומטר 3-4). לאחר הליך הטעינה, תרבות בינונית הוא הסמיק ברציפות באמצעות השבב, שיוצר סביבה קבועה ומוגדרת לא רק לאורך כל הניסוי, אלא גם את החום מתפתחים התאים בת, שאינם נשמרים מתחת לרפידות עקב הגודל הקטן שלהם. ההתקנה שומרת תאי אמא כל כך יעילה, כי בניסוי אחד יכולים להיות במעקב עד 50 תאים בודדים באופן אוטומטי לחלוטין למשך 5 ימים או, במידת צורך, זמן רב יותר. בנוסף, את התכונות האופטיות מעולות של השבב תאפשר גבוהותרזולוציה הדמיה של תאים במהלך תהליך ההזדקנות כולו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הזדקנות 1. עד לאחרונה לומד replicative הזדקנות בתאי שמרים היה תהליך מייגע הדורש נתיחת שיטה, שבה כל ניצן הוסר באופן ידני מהתא האם 2,3. כדי לפתור בעיה זו, אנו הצגנו לאחרונה התקנת microfluidic רומן מסוגלת לעקוב אחר תאי אמא בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם 4.

בשבב microfluidic שלנו, תאי שמרים לכודים תחת micropads מבוסס אלסטומר הרך (ראה איור 1). זרימה רציפה של מדיום שוטפת חדש שנוצרו תאי בת ומספקת את התאים עם חומרים מזינים טריים. בניסוי אחד, יכולים להיות במעקב עד 50 תאים האם בא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור והכנה של עובש פרוסות סיליקון

שבבי microfluidic נוצרים מתבנית פרוסות סיליקון המיוצרת על ידי יתוגרפיה הרכה. ניתן לעשות שימוש חוזר ופלים אלה פעמים רבות כדי לייצר שבבי microfluidic. מומלץ כי ייצור של פרוסות סיליקון בהתאמה מבוצע על ידי קבוצה מתמחה ב6 מיקרופלואידיקה.

רקיק הוא עשה בתהליך photolithography שני שלבי שימוש בשתי שכבות שונות של photoresist השלילי, SU-8 7. השכבה התחתונה משמשת ליצירת אזור השמנת התא (SU-8 2002; מיקרומטר 3-4 גובה), ואילו הערוצים נעשים עם השכבה העל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, תאים נטענים לתוך שבב microfluidic ישירות מתרבות אמצע מעריכי. על מנת לבדוק אם התפלגות הגילים של תאים הלכודים בשבב microfluidic היא דומה לזה של התרבות לפני הטעינה, תאים היו מוכתמים agglutinin החיטה מצומדת לFITC (WGA-FITC) כדי להמחיש צלקות ניצן. כפי שניתן לראות באיור 3, המלכודת של תאים תחת micropads של שבב microfluidic אינה מוטה לתאים בגיל מסוים.

פשוט ניתן לקבוע replicative תוחלת חיים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת microfluidic המתוארת כאן היא כלי חשוב בתהליך הזדקנות רומן מחקר כפי שהיא מאפשרת יצירה פשוטה והאוטומטית של נתוני תוחלת החיים replicative שמרים בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מתמשכת. תכונות אלה הן שיפורים משמעותיים על פני האפשרויות הניסיוניות של השיטה הקלסית לנתיחה, עדיין יש כמה מגבלות של השיטה שצריך להילקח בחשבון.

שימו לב שיכול להיות מושפעים נקבעה replicative תוחלת חיים על ידי היעילות של שימור תאי אמא: לכל תא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לSchippers לורה לכתיבה את גירסאות הראשונות של תא טעינת הפרוטוקול ומרקוס דה Goffau וגיי Zampar עבור מניה המורפולוגיות המיטוכונדריה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DC Sylgard 184 אלסטומר Mavom bv1060040חבילה זו מכילה בסיס PDMS וחומר ריפוי PDMS.
צלחות פטרי זכוכית 120/20 מ"מ VWR International391-2850
כיסוי משקפיים 22x40 מ"מ CBN Labsuppliers BV190002240
Tough-Tags Sigma-AldrichZ359106
רדיד
פלסטיק חד פעמי
פיפטה סרולוגית 5 מ"ל VWR בינלאומי612-1245
סקוטש טייפ VWR International819-1460
משחת בייסילון (סיליקונים של GE Bayer) צינורות מיקרו-קדח סיגמא-אולדריץ'85403-1EA
PTFE, 0.012 אינץ' מזהה x 0.030 אינץ' OD Cole ParmerEW-06417-11המכונה צינורות דקים
Tygon microbore Tubing, 0.030 אינץ' ID x 0.090 אינץ' OD Cole ParmerEW-06418-03מכונה צינורות עבים
אזמל VWR International233-5334
50 מ"ל מזרקי Luer-Lok BD300137
5 מ"ל, קצה לואר VWR International613-1599
פינצטה VWR International232-2132
20 מד Luer stubs Instech SolomonLS20
מסנני מזרק (גודל נקבוביות 0.20 μ m) תקע קטטר נירוסטה Sigma-Aldrich16534K
, 20 ga x12 מ"מ Instech SolomonSP20/12
צלחות פטרי VWR International391-0892
<חזק>ציוד
מנקה אוזון UV-שולחן NOVA סריקתPSD-UVT
משאבת הרווארד 11 מנגנון הרווארד70-4505
SU-8 תבנית מאסטר סיליקון (רקיק) מתוצרת עצמית; לפרטים צרו קשר עם המחבר המקביל
Balance Sartorius corporationED4202S
משאבת ואקום KNF NeubergerN022 AN.18
Desiccator VWR International467-2115
פלטה חמה VWR International460-3267
אופציונלי: מחזיק מתכת לזכוכית כיסוי (22x40 מ"מ) תוצרת עצמית; לפרטים צור קשר עם
מיקרוסקופ המחבר המקביל (פלואורסצנטי) עם יכולות אובייקטיביות של 60x, פוקוס אוטומטי, זמן-lapse ורצוי שלב אוטומטי (בקרת XY ממונע) NikonEclipse Ti-E
אלומיניום עלית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
  2. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  3. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Budding Yeast AgingMicrofluidic ChipYeast Cell TrackingReplicative LifespanContinuous MicroscopyMother Daughter SeparationPDMS Chip FabricationFluorescence MicroscopyMitochondrial MorphologyLifespan Curve Analysis

Related Articles