מדידה של Allodynia משושים בדגם Murine של ערמונית קטריאלי

סיכום

דלקת של הערמונית עלולה להיות גורם תורם בתיווך כאב באגן בערמונית כרונית. אנו מתארים את הליך ההכנה של בידוד חיידקים טופל, החדרה של חיידקים לתוך השופכה של עכברי זכרים ומתודולוגיה למדידת allodynia מישוש בעכברים לאורך זמן.

תקציר

coli Escherichia Uropathogenic (UPEC) הם פתוגנים שמשחקים תפקיד חשוב בדלקות בדרכי שתן וערמונית חיידקי ^1. אנחנו הראינו לאחרונה שUPEC יש תפקיד חשוב בייזום של כאבי אגן כרוניים ^2, תכונה של ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS) ^3,4. הדלקת של הערמונית על ידי UPEC הרלוונטי קליני יכולה ליזום ולהקים כאב כרוני דרך מנגנונים שעשויים לכלול ניזק לרקמות וחניכה של מנגנוני אוטואימוניות ^5.

אתגר להבנת הפתוגנזה של UPEC בערמונית הוא נגישותו היחסית של בלוטת הערמונית למניפולציה. אנו מנוצלים שיטה שתוארה לעיל intraurethral זיהום ⁶ כדי לספק מתח קליני של UPEC לעכברים ממין זכר ובכך הקמת זיהום עולה של הערמונית. כאן, אנו מתארים הפרוטוקולים שלנו לתקנון bacterial ⁷ בידוד, כמו גם את ההליך לcatheterizing עכברי זכרים מורדמים להחדרה של חיידקים.

CP / CPPS מאופיין בעיקר על ידי הנוכחות של המישוש allodynia ^4. בדיקת התנהגות הייתה מבוססת על הרעיון של hyperalgesia עורית כתוצאה ^8-10 כאבים קרביים הופנו. התמקדות ברקמות מעי רגיז מפחיתה את סף כאב עוריות המאפשרים לתגובה מוגזמת לגירויים בדרך כלל אינם כואבים (allodynia). יישום של כוח נורמלי לתוצאות בעור תגובות חריגות שנוטות להגדיל עם עוצמת כאב הבטן הבסיסית. אנו מתארים מתודולוגיה בעכברי NOD / ShiLtJ לנצל סיבי פון פריי לכמת allodynia מישוש לאורך זמן בתגובה לזיהום חיידקים בודד עם UPEC.

פרוטוקול

1. הכנת חיידקים להרכבת חיסון מאוס

הבא חייב להיעשות בתנאים אספטיים.

1. קח 1 17 100 צינורות פוליפרופילן מ"מ x עם כובעים ולהוסיף 3 מ"ל של תקשורת הטריה וריא מרק (LB). באמצעות טיפי autoclaved, לקחת כמה מניות גליצרול חיידקים קפוא של זן CP1 ² ולהעביר כמות קטנה של התרבות לתוך המבחנה המכילה את המדיה LB. החזר את מכסה צינור החמצן כך שעדיין תוכל להיכנס לצינור - התרבות צריכה לגדול בתנאים אירוביים. צינור מקום ב 37 ° C בחממה רועדת ב220 סל"ד לילה.
2. למחרת, להעביר 5 μl של תרבות הלילה לצינור טרי עם 3 מדיה LB מ"ל ולגדול בתנאים סטטיים בחממת לילה בשעת 37 ° C.
3. ביום 3 העברה 40 μl של התרבות לתוך צינור מיליליטר aa 50 המכילה 40 מ"ל LB תקשורת כל אחת. מקום במעלות צלזיוס למשך לילה חממת סטטי 37.
4. הפעל ולהגדיר צנטריפוגה עד 4 ° C.לאחר צנטריפוגה הגיעה טמפרטורה סופית, להעביר כל תרבות מ"ל 40 לתוך צינור צנטריפוגה 40 מ"ל Nalgene.
5. שוקל צינורות לאזן צנטריפוגה - להתאים את עוצמת קול עם תקשורת LB לפי צורך. ספין צינורות ב6000 סל"ד במשך 20 דקות.
6. מוציא בזהירות את supernatant ועדינות להשעות גלולת חיידקים ב40 המ"ל סטרילי PBS.
7. חזור על שלב 1.5 עם PBS.
8. לשאוב את supernatant ולהשעות את החיידקים ב500 PBS סטרילי μl. להעביר את הפתרון לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. קח 10 μl של השעיה ולדלל ב990 μl של PBS קר כקרח. השתמש ספקטרופוטומטר לקרוא את _ננומטר OD ₄₂₀ כדי לקבוע את הנפח הדרוש לחיסון. כדי לקבוע את הנפח המתאים לקר כקרח PBS להשעות גלולה ב: קח את מספר _{420 ננומטר} OD (במ"ל) ולחסר את הנפח המשוער של גלולת החיידקים [לשעבר. OD _{420 ננומטר} = 0.545, גלולה כ 0.075 מ"ל. 0.545-0.075 = 0.470].
9. להסיר 10 μl של השעית חיידקים ודיהלאוטה 990 PBS μl קר כקרח. קראו את _ננומטר OD _420. המטרה היא להשיג שווי _{420 ננומטר} OD להשעיה המדוללת של 1.000 ± .010. אם המספר שלך הוא הדילול מעל היעד זה, להוסיף יותר נפח להשעיה ולקחת עוד קריאה. אם המספר הוא מתחת .990 אז ספין למטה ההשעיה וקריאת _{ננומטר 420} OD חוזר עד לקבלת קריאה רצויה.

2. זיהום בעלי חיים

עכברים (5 עד 7 שבועות ישנים, 10 לכל קבוצה) נרכשו מג'קסון המעבדה (הבר הרבור, ME).

1. עכברים מורדמים על ידי שאיפה של 1-4% isoflurane בתא פרספקס ומנוטרים עד שכיבה.
2. עכבר אחד בכל פעם הוא נלקח להחדרה של חיידקים באמצעות צנתור עם פוליאתילן (PE10) צנתר המחובר למחט 30 G שונה של זכוכית המילטון מזרק (אורך של 1.5-2.0 סנטימטר). הצנתר המוחדר לרכזת של המחט. העכבר הוא Placאד על פני השטח הגבי שלה תחת הרדמה נשמר באמצעות חרטום.
3. הפין של העכבר הוא שמפריש לחץ עדינים וכמויות נדיבות של חומר סיכה על ספוגיות כותנה משמש לשימון של הכניסה לשופכה בפין.
4. 10 μl של פוספט נאגר מלוח המכיל 1 x 10 ⁸ חיידקים מוחדר לשופכה של עכברים מורדמים לאחר צנתור.
5. עכברים נשמרים במדינה הרדימה במשך 15 דקות בתא פרספקס לאחר הקדמת חיידקים כדי לאפשר מצורף חיידקים וכדי למנוע הטלת שתן מיידית.
6. עכברים מוצבים בחזרה בכלוביהם ומעקב במשך 24 השעות הבאות.

3. בדיקת התנהגות

עכברים נבדקו לפני הזיהום (בסיסי) ובימים 3, 7, 14, 21 ו 28 לאחר הדבקה. hyperalgesia התייחס והמישוש allodynia נבדק באמצעות חוטי פון פריי הוחלו על הבטן ^11,12 וr הפלנטריegion של רגלו האחורית ^13. בדיקה הייתה מעודה בזמן של יום קבוע, מתודולוגיה סטנדרטית ובדיקת הנסיינית אחת של כל בעלי החיים היו מועסקות. בדיקות מסונוור מקבוצות נוצלו כדי להילחם על המגבלות של בדיקות כאב מבוססות התנהגות במודלים של בעלי חיים. חמישה חוטי פריי פון בודדים עם כוחות של 0.04, 0.16, 0.4, 1.0 ו 4.0 גרם (Stoelting, ארה"ב) היו מוחלים על הבטן והתדירות של תגובות גמילה היה מחושב.

1. לאחר תקופה של 30 דקות של התאקלמות, עכברים ממוקמים בתאי פרספקס בודדים (6 x 10 סנטימטר X12) שנעשו בבית עם רצפת רשת תיל פלדה אל חלד.
2. hyperalgesia התייחס והמישוש allodynia נבדקו באמצעות החמישה חוטי פון פריי. כל חוט היה מוחל על 1-2 שניות עם מרווח בין גירוי של 5 שניות למשך 10 פעמים כלל, ואת השערות נבדקו בסדר עולה של כוח.
3. כל נימה מוחלת על אזור הבטן התחתונה באזור הכללי של הערמונית וטיפול נלקח כדי לגרות אזורים שונים בתוך אזור זה, כדי למנוע הפחתת רגישות או "לסכם" אפקטים. חוטים היו מיושמים בהגדלת סדר כוחות ל1-2 שניות עם לפחות 5 שניות מרווחים בין גירויים לסך הכל 10 פעמים.
4. שלושה סוגים של התנהגות נחשבים תגובה חיובית לגירוי חוט: 1) נסיגה חדה של הבטן, 2) מלקקים מיידי או גירוד באזור של גירוי חוט; 3) קפיצות.
5. תדירות תגובה הייתה מחושבת כאחוז מתגובה חיובית (מתוך 10, למשל 5 תגובות של 10 = 50%) ונתונים שדווחו כאחוז הממוצע של תדר התגובה ± SE
6. חיות עם יותר מ 25 תגובות בסיסיות כלל חיוביות הוצאו מהמחקר.
7. המישוש allodynia נבדק על האזור הפלנטרי של רגלו האחורית באמצעות חוטי פון פריי עם כוחות של 0.04, 0.16, 0.4, 1.0 ו 4.0 גר '. 50% סף הנסיגה החציוני (5) הוערך באמצעות למעלה למטהשיטה שבה בדיקות התחילו עם חוט 0.04 גרם מיושמת בניצב לפני השטח הפלנטרי של רגלו האחורית עד הנימים הכפופים מעט. חוטים נבדקו בסדר עולים עד תגובה חיובית נצפתה. תגובה חיובית לנימה הוגדרה כאחד נסיגה חדה של כפה או ללקק מכפת המבחן. כאשר תגובה חיובית נרשמה הנימה החלשה הבאה יושמה, ואם תשובה שלילית נצפתה, אז החוט החזק הבא יושם.
8. הניסויים ומתודולוגיה שתוארו כבר נבדקו ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן ולהשתמש ועדה.

תוצאות

בחנו הנהון / ShiLtj וC57BL/6J עכברי זכרים לנוכחות של כאב כרוני על זיהום חיידקים. עכברי זכרים (5 עד 7 שבועות ישנים) החדירו עם מי מלח או חיידקים לתוך השופכה (איור 1). גירוי מכאני של אזור האגן עם חוטי פון פריי של עכברים מלוחים החדירו C57BL/6J ועכברי C57BL/6J UPEC נגועים הביא לתדירות תגובה, כי לא השתנה במהלך 28-היום של הניסוי (איור 1). לעומת זאת, בעכברי NOD UPEC נגועים הציגו תגובות לגירוי אגן שהיו גדולים באופן משמעותי ונשארו גבוה באופן משמעותי ע...

דיון

דלקת של ערמונית העכבר עם UPEC מאפשרת בדוגמנות vivo של אירועים שעשויים להיות מעורב בפתוגנזה של ערמונית חיידקים, CP / CPPS או כאירוע predisposing בדלקת כרונית. השיטות מתוארות להכנת חיידקים ותיקו החדרה על גוף גדול של ספרות על מודלי UPEC בדלקת בדרכי שתן נשית ^7,14. המודל יש תחולה רחבה ללימוד פתוגנזה, בודק מועמדים פוטנציאליים ומנגנוני חיסון של אפנון חיסוני. היכולת לעקוב אחר התנהגות כאב באופן מדיד מאפשרת לחקר היווצרות כאב זיהום הנגרם על ידי ובאופן פוטנציאלי כמודל קלינ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
צינורות תרבות	BD פלקון	352059
LB מרק מילר	EMD	EM1.10285.0500
צינורות Nalgene צנטריפוגות	Thermo	3118-0050
Isoflurane	שיין באטלר	NDC 11695-6776-1
30G המחט קטטר	המילטון	91030
PE10 צינורות	BD intramedic	427400
חוטי זכרונות פון פריי	Stoelting	58025-31