מאמר שיטה

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז'ים / Brite

38.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

28 במרץ 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

במאמר זה

סיכום

preadipocytes הלבן העיקרי שבודד מרקמות שומן לבנות בעכברים יכול להיות מובחן לתאים בז'ים / brite. מוצג כאן הוא מודל למערכת סלולרית אמינה ללמוד רגולציה המולקולרית של "השחמה" של שומן לבן.

תקציר

adipocytes בראון יש את היכולת להפריד בין שרשרת הנשימה במיטוכונדריה, ולפזר את האנרגיה כימית בצורה חומה. פיתוח adipocytes החום UCP1 החיובי ברקמות שומן לבנות (כך נקרא תאי צבע בז'ים או brite) מושרה מאוד על ידי מגוון של רמזים סביבתיים כמו חשיפה לקור כרונית או על ידי אגוניסטים PPARγ, ולכן, סוג תא זה יש פוטנציאל כמטרה טיפולית עבור טיפול בהשמנה. למרות קווי adipocyte רוב הנציחו לא יכולים לסכם את התהליך "ההשחמה" של שומן לבן בתרבות, adipocytes העיקרי מבודד משבריר כלי דם סטרומה ברקמת שומן לבן תת עורית (WAT) לספק רשת סלולרית אמינה ללמוד בקרה המולקולרית של התפתחות תא בז' / brite . כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של preadipocytes היסודי וגרימת התמיינות לתאים בז'ים / brite בתרבות. אפקט ההשחמה יכול להיות מוערך על ידי הביטוי של מארק בראון שומן סלקטיביתהתעמלות כגון UCP1.

מבוא

השמנת יתר היא להגדיל באופן משמעותי בעולם וכיום הוא נחשב לאחד מהחששות הכבדים ביותר לבריאות ציבור 1. מצב זה קשור לmisbalance בצריכת אנרגיה ביחס להוצאות ותוצאות בעודף אנרגיה מאוחסנת כשומן ברקמת שומן לבנה (WAT). WAT המוגדל קשור למסת גוף מוגבר ומשקל, בעוד שרקמת שומן חום יש את היכולת לפזר אנרגיה עודפת כדי לייצר חום. לפיכך BAT יכול לתפקד כהגנה מפני קור והן השמנת 2,3. זו מושגת על ידי תרה של מעבר האלקטרונים במיטוכונדריה ידי מתיר חלבון 1 (UCP1). חלבון זה נחשב סימן היכר לnonshivering התרמוגנזה בBAT 3. מספר מחקרים בשנים האחרונות גילו כי בני אדם בוגרים יש 4-8 BAT פונקציונליים וכתוצאה מכך, מניפולציה של BAT בבני אדם יכולה להיות התערבות טיפולית פוטנציאלית במאבק נגד השמנת יתר והמחלות הקשורות בו.

jove_content "> ראיות נוכחיות מצביע על כך ששני סוגים של adipocytes החום קיימים במכרסמים;" קלסי "או" קיים מראש "שומן החום מתפתח בשלב טרום הלידה ומהווה מחסני שומן חומים ייעודיים באזור interscapular ורקמות היקפיות אחרות מצד השני. , טופס "מושרה" של שומן חום (כך נקרא תאי Brite או בז'ים) מתפתח בשלב שלאחר הלידה וביניהם מופיע ברקמות שומן לבנות. שני הסוגים של adipocytes החום גם הם מופרדים על ידי מקורות התפתחותיים שונים. אמנם קיים מראש adipocytes החום נובע מmyoblastsic הדמוי Myf5 מבשרים, את התאים המושרים Brite / בז'ים שזורים בWAT לנבוע משושלת הלא Myf5 9,10. בנוסף, מסלולים רגולטוריים של סוג תא זה עשויים להיות שונה מהחום המופק מMyf5 adipocytes 11. ההתפתחות של תאים בצבע הבז'ים (כלומר "השחמה" של שמן ולבן) ניתן להפעיל בתגובה לחשיפה לקור כרונית וכדיβ3-adrenoceptor-אגוניסטים או אגוניסטים PPARγ במבוגרים 12-14. התאים הבז'ים / brite עשויים להיות מטרה טיפולית מבטיחה עבור מניפולציה של מאזן אנרגיה כוללת ובאופן פוטנציאלי יכולים להיות חלק מטיפול בהשמנה, ולכן, חשוב להבין מנגנונים מולקולריים מדויקים ומסלולי איתות שבו רמזים סביבתיים שולטים פיתוח בז' תאים.

כדי להבין את השליטה המולקולרית של ההשחמה של שמן ולבן, בניסויים במבחנה הם מתאימים ביותר כבידול של preadipocytes מתרחש ולא באופן אסינכרוני, וקשה לזהות את התאים באתר 15. למרות שמחקרים על התפתחות adipocyte שעד כה בוצעו בעיקר על שורות תאים כגון-L1 3T3, 3T3-F442A או HIB1, שורות תאים אלה נראות חסרי החתימה המולקולרית של תאים בצבע בז'ים. מצד השני, adipocytes העיקרי שבודד מתת עורית WAT הוא סיכוי טוב ביותר לסכם על procesהים של השחמה של שומן לבן בצורה אוטונומית תא. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד יעיל של שבריר סטרומה וכלי דם מרקמות שומן וגרימת ההשחמה של שומן לבן בתגובה לאגוניסטים PPARγ. Rosiglitazone הוכח להיות מתווך יעיל במיוחד של השחמה בתאים אלה. כפי שהציע בעבר 16, רשת סלולרית זה יכול לשמש כדי לשרת את המערכת סלולרית אמינה ללמוד על התפתחות תאים בז'ים / brite.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן בינוני עיכול

הפוך 5 מ"ל לכל 5 עכברים לרקמות (/ רקמת שומן כ 1 מ"ל 1 ז).

  1. לשקול באנזימי עיכול:
    - D Collaginase: 1.5 u / מ"ל ​​(1108874103, 1 גרם, רוש, 70334223)
    - Dispase השני: 2.4 u / מ"ל ​​(04942078001, 0980 מ"ג / איו, רוש, 11466200)
  2. הוסף 25 המ"ל PBS ומערבב היטב להמסה
  3. הוסף CaCl 2 רק לפני העיכול של הרקמה בריכוז סופי של 10 מ"מימ

2. לנתח רקמת שומן מעכברים

  1. נתיחה צריכה להתבצע בזהירות, ומייד לאחר שהעכברים (6-8 שבועות) הם הקריבו. עבודה סטרילית עם אתנול רוסס על פרוות העכבר לפני פתיחתו. הנח את הרקמה באופן ישיר הנקי PBS, BAT interscapular הנפרד ותת עורית מפשעתי ואט.
  2. לBAT interscapular: יש להציב את העכבר בחלק האחורי מתמודד, מלא חתכים פתוחים לאורך הגב וכל הדרך עד לצוואר. החוםרקמת שומן ניתן למצוא ממש מתחת לעור שבין הכתפיים (interscapular). BAT ניתן לראות בשתי אונות דמוי, פרפר. שכבה דקה של שומן לבן שכיסה את המחבט צריכה להסיר בזהירות.
  3. לתת עורית WAT (מפשעתי WAT): להסיר עור. מפשעתי WAT נמצא ישירות מתחת לעור בשני הצדדים, החל כמעט על הגב והולך לצד, חלק הפנימי של ירכיים ומטה לכיוון האשכים.

3. גזור ולעכל רקמת שומן

  1. מהירות להסיר את כל הזיהומים, כמו שיער שרירים, שלד ורקמות חיבור מסעיפי הרקמות.
  2. לייבש רקמות במהירות על נייר שלא לדלל בינוני נתיחה עם PBS ומניח אותו על צלחת יבשה.
  3. הוסף בינוני עיכול (הוסיף 2 CaCl לפני העיכול) ולרכך את הרקמה לחתיכות קטנות. מערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 5 מ"ל. להעביר את הרקמות הטחונות ב 50 מיליליטר צינורות עם שאר מ 'העיכולedium, לערבב עוד יותר על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. דייג'סט ב37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב 150 סל"ד עבור 40-50 דקות. בדקו כל 10-15 דקות כדי לוודא העיכול הולך טוב וכדי למנוע יתר מערכת עיכול.

הערה: בינוני עיכול נכון וזמן הם חשובים. הרקמות צריכות להיות מעוכלות היטב, אבל עיכול עודף יכול לגרום ניזק לתאים.

4. השעית תא סינון

  1. עצור עיכול על ידי הוספה בינונית מלאת מ"ל 5 (DMEM/F12 FPS ו-P / S המכיל 10%). התאים אמורים להיות כמעט לחלוטין הומוגנית. מערבב היטב על ידי pipetting.
  2. צנטריפוגה ב XG 700 עבור 10 דקות.
  3. SVF כעת ניתן לראות חום גלולה בתחתית של תחתית. לשאוב את השכבה הבוגרת adipocyte השמנונית על גבי ורוב שכבת הנוזל - לשמור על הכדור ולפזר אותו במדיום 10 מ"ל מלא. מערבב היטב.
  4. הנח מסננת תא (50-70 קוטר מיקרומטר) מעל 50 חדשים צינור המ"ל ולסנן את השעית התא.

5. תאי פלייט

  1. העברת השעית תא לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה XG ב 700 למשך 10 דקות.
  2. לשאוב בינוניים וגלולה מחדש להשעות במדיום מלא 10 מ"ל. פיפטה ומערבבת היטב.
  3. להעריך כמה צלחות יש צורך. זה עשוי להשתנות ותלוי בגודל הגלול. כלל הוא 2 מתוך 10 צלחות 5 סנטימטר מעכברים למפשעתי WAT וצלחת סנטימטר 1 10 לBAT.
  4. תאי צלחת על מנות מצופות קולגן (R & D) במדיום מלא
  5. 1-2 שעות לאחר ציפוי התאים, הבינוני aspirate, לשטוף עם PBS פעמים ולהוסיף את המקור טרי. שלב זה חשוב כמו זה יכול להסיר תאי דם אדומים, תאי מערכת חיסון ומזהמים אחרים.

6. להבדיל תאים

  1. הפוך תחזוקה ומדיומי אינדוקציה.

תחזוקה בינונית

השלם עם מדיום הוסיף:

אף אוזן גרון "> אינסולין, conc הסופי. 5 מיקרוגרם / מ"ל (5 מניות מ"ג / מ"ל, 100 *** μl של חומצה אצטית ב10 המ"ל H 2 O להכין חומציות מי acidified 2.5. לפזר אינסולין במי acidified. מניות בחנות -20 ° C)

3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine (T3), קונצרט כלשהו סופי. 1 ננומטר (מניות מיקרומטר 10, *** לפזר T3 ב1N NaOH ומוסיף בינוניים להכין ציר מיקרומטר 10. סיגמא חתול # T-2877)

חנות ב 4 ° C, טובה לשבוע אחד

בינוני אינדוקציה

תחזוקה בינונית מכיל תרכובות הבאות:

Indomethacin, conc סופי. 125 מיקרומטר (0.125 מניות M באתנול, חתול סיגמא # I-7378). Indomethacin חייב להיות מחומם ל 60 מעלות צלזיוס עד שנמס.

דקסאמתאזון, conc הסופי. 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​(2 מ"ג / מ"ל ​​בגרב אתנול, סיגמא חתול # D-1756)
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), קונצרט כלשהו סופי. 0.5 מ"מ (0.25 מניית M בDMSO, סיגמא חתול # I-5879)
Rosiglitazone, סופי קונצרט כלשהו. 0.5 מיקרומטר(10 מ"מ במניות DMSO, חתול סיגמא # R-2408)

הערה: ודא אינדוקציה טריה בינוני בכל פעם.

  1. לגדול adipocytes העיקרי למפגש 95-97% בבינוני שלם (confluent אך לא ארז יותר מדי)
  2. שינוי בינוני מלא קבועה עם מדיום אינדוקציה (יום 0)
  3. לאחר 48 שעות (יום 2), לשנות את המדיום למדיום תחזוקה עם rosiglitazone (0.5 מיקרומטר)
  4. לאחר 48 שעות נוספות (יום 4), שינוי למדיום טרי תחזוקה עם rosiglitazone (1 מיקרומטר) במשך 2-3 ימים נוספים. 6-7 ימים לאחר הוספה בינוני אינדוקציה, תאי התמיינותו להתבגר תאי שומן ומלאים בטיפי שמן. טיפין תופענה סביב 3-4 ימים לאחר האינדוקציה.

הערה: כל שינוי בינוני 2-3 ימים עד שהתאים נבדלים באופן מלא.

תאים כעת ניתן לקצור וביטוי mRNA של Ucp1 וotheגני r החומים adipocyte ספציפיים ניתן למדוד qRT-PCR. כתם מערבי ישמש לזיהוי חלבונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בראונינג adipocytes העיקרי ניתן לגשת על ידי מדידת ביטוי mRNA של Ucp1 וגנים חומים אחרים שומן ספציפיים או סלקטיבית ידי qRT-PCR. מוצג באיור 1 הוא נתוני ביטוי גנים במפשעת adipocytes העיקרי WAT-נגזר. התאים היו מושרים להבחין בנוכחותם של שני מינונים שונים של rosiglitazone ב50 ננומטר ו 500 ננומטר, בהתאמה. תת קבוצה של תאים טופלה בforskolin ב10 מיקרומטר ל4 שעות לפני הקציר. זה יניע מחזורי-AMP (cAMP) בתאים ולהפעיל את התכנית גנטית תרמוגנית כולל Ucp1 ביטוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים מערכת סלולרית אמינה ללמוד על התפתחות תאים בז'ים / brite בadipocytes תרבית הראשוני בעכברים. בהשוואה לכמה שורות תאים הנציחו זמינות, מערכת זו היא צפויה להציע רלוונטית משופרת להשחמה של לבן שומן בגוף חי.

למרות שהמחקר של adipocytes הראשוני אלה מציע כמה יתרונות, קיימים גם קיים מספר מגבלות וחששות שחשוב לקחת בחשבון. ראשית, מערכת זו היא מסתמכת במידה רבה בעצמה את התמיינות התאים. ביטוי של גנים בשו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים Haruya אונו, Kosaku ינודה, לואיס ארפ, אמי Tomoda, ולורן רואיז לדיון, עזרה טכנית וסיוע בעריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (DK087853), מהתכנית למחקר ביו פריצת הדרך ומAsubio פארם בע"מ לSKULA היה נתמך על ידי מלגות מנית דוקטורט מאוניברסיטת קופנהגן והאיחוד האירופי FP7 פרויקט DIABAT (בריאות-F2 -2,011-278,373) לליז מדסן וקרסטן Kristiansen. אנחנו גם מכירים DERC מרכז המענק (NIH P30 DK063720).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב
D Collaginase רוש 11088874103
Dispase השני רוש 04942078001
CaCl 2
DMEM בינוני דיג 10017-CV עם גלוקוז 2,5 ג'/ L & L-גלוטמין בלי פירובט נתרן
אינסולין
T3 (3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine) סיגמא T-2877
Indomethacin סיגמא I-7378
דקסאמתאזון סיגמא D-1756
IBMX סיגמא I-5879
Rosiglitazone סיגמא R-2408
ציוד
מנות קולגן מצופות BD 354450 10 צלחות סנטימטר
70 מיקרומטר סינון BD פלקון 352350 תא מסננת, 70 מיקרומטר הניילון 1/ea

מקורות

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UCP1Q RT PCRWestern BlotRO Glitazone

מאמרים קשורים