גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

סיכום

כלי optogenetic מקודד גנטי מאפשרים מניפולציה לא פולשנית של תאי עצב ספציפיים ב דרוזופילה מוח. כלים כאלה יכולים לזהות נוירונים הפעלה שדי בכך כדי לעורר או לדכא התנהגויות מסוימות. כאן אנו מציגים שיטה להפעלת Channelrhodopsin2 המתבטאת בתאי עצב ממוקדים בזבובי חופשיות הליכה.

תקציר

מספר הולך וגדל של כלים גנטיים מקודדים הופכים זמין המאפשר מניפולציה לא פולשנית של הפעילות העצבית של הנוירונים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster ^1. ראשי בין אלה הם כלי optogenetic, המאפשרים הפעלה או ההשתקה של תאי עצב מסוים בחיים השלמים ונעו בחופשיות באמצעות אור בהיר. Channelrhodopsin (ChR2) הוא ערוץ קטיון אור פעיל, שכאשר מופעלים על ידי אור כחול, גורם לאובדן קיטוב של נוירונים שמבטאים אותו. ChR2 היה יעיל לזיהוי תאי עצב קריטיים להתנהגויות ספציפיות, כגון הימנעות ₂ CO, סיומת חוטם ותגובה בהלה תיווך ענקי בסיבי ^2-4. עם זאת, כמקורות האור החזקים המשמשים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, טכניקות optogenetic אלה לא עודכנה בעבר בשימוש במערכת הראייה. כאן, אנו משלבים גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction להדגמהnstrate כי הפעלת מקבץ של נוירונים נול רגישים באונה האופטית של הזבוב, Foma-1 נוירונים, יכול לנהוג התנהגות בריחה המשמשת למניעת התנגשות. אנחנו השתמשנו אלל ריק של רכיב חיוני של מפל phototransduction, פוספוליפאז C-β, מקודד על ידי גן norpA, כדי להבהיר את הזבובים עיוורים וגם להשתמש במערכת activator תעתיק Gal4-כטב"מ לנהוג ביטוי של ChR2 בפומה-1 הנוירונים. זבובים בודדים מונחים על משטח קטן המוקפים נוריות כחולות. כאשר הנוריות מוארות, עף במהירות המראה לטיסה, באופן דומה להתנהגות מונעת חזותי נול-בריחה. אנו מאמינים כי טכניקה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בהעברת זבובים בחופשיות.

מבוא

ארסנל גובר של כלים גנטיים מקודדים פותח כדי לתפעל פעילות עצבית בתאים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster ^1. כלים אלה מאפשרים הפעלה או השתקה לא פולשנית של תאי עצב מסוימים בחיים השלמים ונעו בחופשיות. בין אלה, Channelrhodopsin2 (ChR2), ערוץ קטיון אור פעיל, מציע יתרונות חשובים, שכן הוא יכול להיות נשלט באופן זמני ומושרה במהירות. כאשר נוירונים ההמפורש ChR2 נחשפים לאור בהיר כחול (470 ננומטר) שהם במהירות depolarize ולהציג שיעורי ירי גבוה ^3-5. הפעלה ממוקדת כגון תאי עצב ספציפי בבעלי חיים שנעו בחופשיות חשפה את התלות של נוירונים מסוימים להתנהגויות כגון הימנעות ₂ CO ^3, חוטם ^2,4 הארכה, ותגובות בהלה בתיווך ענקי בסיבי ^4. עם זאת, כמקורות האור החזקים הדרושים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, החלת אופטכניקות togenetic למערכת הראייה היו מוגבלות. על ידי שילוב של גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction, אנו מראים כי הפעלה של אשכול ספציפי של תאי עצב באונה האופטית של הזבוב יכולה לנהוג התנהגות הבריחה המשמשת למניעת התנגשות ^6.

רוב, אם לא כל, חיות חזותיות מפגינות התנהגות בריחה כדי למנוע התנגשויות עם אובייקטים מתקרבים. הליכה או נייח זבובים, כאשר הציגו עם התנגשות ממשמשת ובאה, המראה לטיסה, הרחק מההתנגשות המתקרבת ^7-9. המראות אלו מאופיינים בכנפיים לפני ההמראה ומסלול טיסה יציבה ^10,11 שהועלו. תגובה זו שונה מהתגובה ענקית בסיבי תיווך הלה, הקפיצות שלא קדמו להם כנפיים שהועלו, ובדרך כלל תוצאה של נפילה בנפילה ^{חופשיה-4,9.} לאחר זיהה אשכול ספציפי של תאי עצב רגיש נול באונה האופטית, Foma-1 נוירונים, שהם uniquאיליי מכוון כדי לקודד אובייקטים מתקרבים, בקשו לחקור את מעורבותם בהתנהגות בריחת נולו של הזבוב. כאן אנו מדגימים את שימוש optogenetics סלקטיבי להפעלת הנוירונים האלה וגרם להתנהגות בריחתו של הזבוב.

אנו משתמשים במערכת activator תעתיק Gal4-כטב"מ לנהוג ביטוי של ChR2 בנוירונים Foma-1. ChR2 דורש cofactor כל טרנס הרשתית וזה נמצא ברמות נמוכות במערכת העצבים המרכזית תסיסנית יש להשלימו בתזונה של הזבובים. ^3,4 כאור בהיר משמש להפעלת ChR2 וזבובים מפגינים התנהגויות phototactic חזקות ^12, שבקשנו לשלול את האפשרות של תגובה לגירוי ויזואלי. כדי לעשות זאת, השתמש בעלי חיים שהיו מוטצית הומוזיגוטים לאלל ריק של גן norpA, אשר מקודד מרכיב קריטי של מפל phototransduction, C-β פוספוליפאז. קולטני אור בזבובים מוטנטיים כאלה אינם מסוגלים responד להדליק ^13. כדי לבדוק את גירוי optogenetic של תגובת הבריחה, אנחנו צריכים לבודד זבוב אחד ולשטוף אותו באור כחול בהיר. כדי לעשות זאת, אנו שמים זבובים בודדים בטיפי pipet. טיפ pipet אחד ממוקם בבעל מותאם אישית, כגון שזבוב geotactically יצעד טיפ ויצא על גבי פלטפורמה מלבנית. הזבוב הוא מסוגל ללכת בחופשיות על גבי פלטפורמה זו. הפלטפורמה היא מוקפת בארבעה מערכים LED כחולים, כל 3 נוריות המכילות, התמקדו בחלק העליון של הפלטפורמה. אחרי הזבוב הוא על הרציף, הנוריות מוארות, ותגובתו של הזבוב נרשמת באמצעות מצלמה במהירות גבוהה ^6.

פרוטוקול

1. צור זבובי Channelrhodopsin

1. צלב-ChR2 כטב"מ זבובים עם Gal4 נהג על פי בחירתך, אנו משתמשים G105-Gal4, המתבטא בנוירונים-1 Foma באונה האופטית.
2. כדי לשלול את האפשרות של תגובה חזותית לאור הגירוי הכחול, שני הקווים, הזבוב נמצאים בaw ⁺ רקע norpA.
3. תוצאת סיום: w ⁺ norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. לאחר מבוגר זבובי eclose, לשים נקבות נבחרו על מזון טרי, בתוספת 10 מיקרומטר כל טרנס רשתית (שיתוף גורם נדרש לChR2) ומוגנים מפני אור, במשך 3 ימים לפני ביצוע הבדיקה התנהגותית.

2. הפוך 10 מזון משופר-All-טרנס רשתית מיקרומטר

1. להמס 100 מ"ג כל טרנס הרשתית ב17.6 מ"ל של אתנול 95% כדי 20 מ"מ רשתית. ממשיך כל טרנס הרשתית מוגנת מפני אור בכל העת.
2. ממס אוכל זבוב קמח תירס רגיל במיקרוגל, ומצנן עד חמים למגע.
3. מערבב 50 μl של 20 מ"מכל טרנס רשתית לבקבוקונים של 10 מ"ל של אוכל לטוס.
4. בואו בקבוקונים לצנן ולשמור מוגנים מפני אור.

3. ציוד

1. טיפי Pipet: 1000 טיפי pipet μl סטנדרטיים הם חתכו ליד הקצה, יצירת קוטר נקבובי של ~ 2.25 מ"מ.
2. פלטפורמה (ראה תרשים 1).
   1. בסיס Delrin, 17 סנטימטרי X 25 סנטימטר, נבנה עם חורי הברגה בכל פינה כדי להתאים ¼ "מחברי צינור קירור NPT.
   2. בעל אנכי, עשוי מDelrin, מחובר למרכז הבסיס. המידות הכוללות הן 25 מ"מ X 40 מ"מ X 65 מ"מ (רוחב X עומק X גובה). חריץ רחב 10 מ"מ לכל האורך של המחזיק, עם בורג אגודל בתחתית. פלטפורמה מחוברת לראשו של הבעל, 25 מ"מ X 40 מ"מ X 10 מ"מ, עם חור בקוטר 3.5 מ"מ מיושר עם החריץ במחזיק.
3. מערכי LED (ראה תרשים 1).
   1. ארבע זרועות של צינור נוזל קירור, ארוך ~ 18 סנטימטרים, הם מודבקים לפלטפורמת basדואר משתמש במחבר צינור נוזל הקירור. צינור נוזל קירור משמש רק כתמיכה מבנית ואינו משמש למטרות קירור.
   2. חריצים כראוי רווח נחתכים לחלק האחרון של נוזל קירור שטיפה של כל זרוע להדביק גוף קירור לסוף כל זרוע.
   3. רבל LED כחול Tri-כוכבים הוא רכוב לכל גוף קירור באמצעות דבק תרמי חתוך מראש. Carclo 18 ° Tri-עדשה מודבקת לכל כוכב Tri-.
   4. Tri-כוכבי LED מחווטים לנהגי BuckPuck DC ואספקת חשמל כפי שצוינה. יש לנו ההגדרה מסודרת שלנו עם כל BuckPuck powering 2 Tri-כוכבים בסדרה.
   5. תאורה של כל הארבעה LED-כוכבי Tri ב700 mA הניב קרינה של 713 ואט / מ ² בפלטפורמה שלנו.
4. מצלמה: המצלמה היא רכובה על חצובה קטנה והתמקדה בחלקו העליון של המצע.

4. Assay התנהגות

1. בקצרה לטשטש את זבובים על קרח.
2. הנח זבובים בודדים בטיפי pipet, באמצעות קלטת כדי לסגורשני קצוות של הקצה.
3. לאחר שהתעוררו והזבובים פעילים בוחנים את קצה pipet, להסיר את הסרט ואת מקום pipet בחריץ בבעל אנכי. הבורג משמש כדי לאבטח את קצה pipet במקום ולסגור את החלק התחתון של הקצה.
4. כמו הזבוב בוחן את קצה pipet (בדרך כלל 30-60 שניות), להתחיל בהקלטת המצלמה ממש לפני שעולה לטוס מהקצה על גבי הפלטפורמה.
5. אחרי הזבוב התפתח על גבי הפלטפורמה, לחכות 1-2 סקו, ולהדליק נוריות הכחולות. השתמש בטיימר ידני כדי למדוד את הזמן עד הזבוב יוזם טיסה.

תוצאות

עיוור או זבובים להביע ChR2 או G105 הנהג לבד מצביע על שיעור נמוך של ההמראה בעקבות ההארה שלהם עם אור כחול בהיר. עיוור זבובים הציגו שיעור הזהה של המראה ללא קשר לתאורה (איור 2), המצביע על כך המראות-אלה היו ספונטניות ולא בשל תאורה עם אור כחול. כאשר ChR2 מתבטאת בFoma1 נוירונים, לעומת זאת, תאורה עם אור כחול מעוררת את תגובת הבריחה. מעל 50% מהזבובים שנבדקו המריאו בתוך 1 שניות של הארה, ו75% בתוך 5 שניות (איור 2). לעומת זאת, רק 10% מזבובי בקרה המריאו בתוך 1 ...

דיון

אנחנו הוכחנו גירוי optogenetic של התנהגויות בריחה ידי רחיצת הליכת זבובים באור כחול בהיר באופן חופשי. גישה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בזבובי חופשיות הליכה, וניתן לשנותם לפלטפורמות גדולות יותר, פשוט על ידי ריצוף את מערכי LED ששמשנו אותנו על פני שטח גדול יותר. שימוש או המצלמה היקרה שאנו מתארים, או מערכות מצלמה זמינות אחרות, המשתמש יכול להתאים את קצב הפריימים והרזולוציה מרחבית של התמונות שנרכשו כדי להתאים את ההתנהגות של עניין. בנוסף, ההדמיה שלנו מוגבלת לזמן ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
			מגיב
כל טרנס הרשתית	התקדמות מדעית והכימית Inc	R3041
			ציוד
מפזר חום 9.2 C / W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 המ"מ X 30 מ"מימ מרובעים גבוהים
Carclo 18 ° Tri-עדשה	Luxeonstar	10507
רבל LED הכחול על בסיס Tri-Star	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 ננומטר, 174 lm @ 700 אמפר.
700 Driver mA BuckPuck DC	Luxeonstar	3021-DE-700
לרתום חיווט למנהל BuckPuck	Luxeonstar	3021-HE
דבק תרמי חתוך מראש	Luxeonstar	LXT-S-12	מאגר הקס 20 מ"מ
צינור נוזל הקירור snap-Loc, ¼ "מזהה	מקמאסטר-קאר	5307K49
מחבר צינור נוזל קירור snap-Loc	מקמאסטר-קאר	5307K39	¼ "זכר NPT
אספקת מעבדת כיתת החלפת מצב תכנות כוח DC	BK Precision	1698
Exilim מצלמה	קאסיו	EX-FH20