הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמית זמן לשגות ניתן להשתמש כדי להשוות התנהגות של תאים בתרבית ראשונית preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי שונים של סרטן השד. לדוגמה, זמן בין חלוקות התא (גלגולים סלולריים), מספרים סלולריים אפופטוטיים, אבולוציה של שינויים מורפולוגיים, ומנגנון של יצירת מושבות ניתן לכמת והשוואה בתאים שנשאו נגעים גנטיים ספציפיים. תרביות תאים ראשוניות אפיתל חלב נוצרות מבלוטות חלב ללא גידול מוחשי. בלוטות resected זהירות עם הפרדה ברורה משרירים סמוכים, בלוטות לימפה הוסרו, והשעיות תא בודד של תאי האפיתל חלב מועשר נוצרות על ידי רקמת שד ריסוק ואחרי ניתוק וסינון האנזימטית. השעיות תא בודד מצופות וממוקמות ישירות מתחת למיקרוסקופ בתוך תא חממה עבור הדמית חית תאים. שישה עשרה 650 x 700 מיקרומטר מיקרומטר שדות בתצורת 4x4 מכל well של צלחת 6-גם הם צלמו כל 15 דקות במשך 5 ימים. תמונות זמן לשגות נבדקות ישירות למדוד התנהגויות סלולריות שיכול לכלול מנגנון ותדירות של יצירת מושבות תאים בתוך 24 השעות הראשונות של ציפוי לתאים (לעומת צבירת התפשטות תאים), שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים. מעקב תא בודד משמש ליצירת מפות גורל תא למדידה של חיי תא בודדים וחקירות של דפוסי חלוקת תא. נתונים כמותיים מנותחים סטטיסטי לאמוד את ההבדל משמעותי בהתנהגות מתואמת עם נגעים גנטיים ספציפיים.
מבוא
מודלי עכבר מהונדס גנטי הם כלים כדי ללמוד ולהבין איך נגעים גנטיים שונים תורמים לסיכון להתפתחות סרטן השד. לדוגמה, עכברים מהונדסים גנטי הראו כי שילוב של שלושה גורמים: האובדן של השד באורך מלא 1 הסרטן, התחלה מוקדמת (BRCA1) גנים בתאי האפיתל חלב, haploinsufficiency ניבט קו החלבון p53 גידול (TP53), וחלב אפיתל תא ממוקד עד מוסדר אלפא קולטן אסטרוגן (עידן) תוצאות ביטוי בהתפתחות של סרטן השד ב100% של BRCA1 (ו) וירוס 11/f11/Mouse חלב גידול (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (floxed ט-op) -ER/MMTV-reverse טטרציקלין transactivator (rtTA עכברים על ידי גיל 12 חודשים בהשוואה לאחוזים הנמוכים יותר דיווח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תכנית כללית
- צור תרבויות העיקריות של תאי אפיתל חלב preneoplastic מבלוטות חלב של הנדסה גנטית ולשלוט עכברי סוג פראי.
- צלם תמונות חי תאים כל 15 דקות באמצעות תוכנת רכישת תמונת Volocity (גרסת 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) לתקופה של עד 5 ימים.
- צפו בתמונות זמן לשגות ולהעריך עיתוי ואת המנגנון של יצירת מושבות תאי אפיתל, שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים.
- המרת Volocit....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאי אפיתל ופיברובלסטים יכולים להיות מכובדים על ידי מורפולוגיה של תאים. תאי האפיתל יש צורת cuboidal (איור 1 א-B) ומושבות תאי טופס (איור 1 א). Fibroblasts, סוג של תא סטרומה, יש מורפולוגיה מוארכת (האיור 1C).
תאים היו מעוגלים וצפו בתחילת ההדמיה (איור 2A-D). לאחר התקשרות לצלחת שהם נעשו שטוחים והפגינו הופעת cuboidal סוג (2E איור, ח). ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים קריטיים
חשוב לוודא שבלוטות חלב נקצרות מעכברי בנים אותו הגיל לשליטה לשונות הקשורים בגיל בהתנהגות תא אפיתל חלב. כאשר ציפוי התאים, אותו מספר התאים צריך להיות מצופה בכל אחד גם לכל ניסוי. תאים צריכים להיות דלילים יחסית כאשר ציפוי כך שתרבויות לא הופכות confluent מהר מדי כך שניתן לעקוב אחר תאים בודדים מרובים באמצעות תמונות סדרתיים. זה חיוני כי הצלחת תהיה מתאזנת בחממה לפני ההדמיה בגלל ההתמקדות תשתנה אחרי הצלחת היא מתא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לBofan וו והנוצרי Raithel לקבלת סיוע טכני ומיכאל ריגר להקדמתו להדמיה חייה תאים. נתמך על ידי NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), דויטשר Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), משרד ההגנה W81XWH-11-1-0074 (REN), תכנית WCU (World Class אוניברסיטה) באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה ממומנת על ידי משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (ציוד מתקן גדר מכרסם), וNIH NCI 5P30CA051008 (מיקרוסקופי ומשאבי הדמיה ובעלי חיים משותפים).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| עכבר בינוני אסאל EpiCult-B | טכנולוגיות StemCell | 05610 | |
| EpiCult-B מאוס תוספים למניעת הפצת נשק | טכנולוגיות StemCell | 05612 | |
| רקומביננטי עוריות Growth Factor האנושי (rhEGF) | טכנולוגיות StemCell | 02633 | |
| Collagenase / Hyaluronidase | טכנולוגיות StemCell | 07912 | |
| Scapels חד פעמי | נוצה | 2975 # 10 | |
| תמיסת המלח המאוזן "הנקס | טכנולוגיות StemCell | 37150 | |
| כלוריד mmonium | טכנולוגיות StemCell | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | טכנולוגיות StemCell | 07901 | |
| Dispase | טכנולוגיות StemCell | 07913 | |
| אני DNase | טכנולוגיות StemCell | 07900 | |
| מסננת תא 40 מיקרומטר | טכנולוגיות StemCell | 27305 | |
| FBS | טכנולוגיות StemCell | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
מקורות
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
