הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמית זמן לשגות ניתן להשתמש כדי להשוות התנהגות של תאים בתרבית ראשונית preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי שונים של סרטן השד. לדוגמה, זמן בין חלוקות התא (גלגולים סלולריים), מספרים סלולריים אפופטוטיים, אבולוציה של שינויים מורפולוגיים, ומנגנון של יצירת מושבות ניתן לכמת והשוואה בתאים שנשאו נגעים גנטיים ספציפיים. תרביות תאים ראשוניות אפיתל חלב נוצרות מבלוטות חלב ללא גידול מוחשי. בלוטות resected זהירות עם הפרדה ברורה משרירים סמוכים, בלוטות לימפה הוסרו, והשעיות תא בודד של תאי האפיתל חלב מועשר נוצרות על ידי רקמת שד ריסוק ואחרי ניתוק וסינון האנזימטית. השעיות תא בודד מצופות וממוקמות ישירות מתחת למיקרוסקופ בתוך תא חממה עבור הדמית חית תאים. שישה עשרה 650 x 700 מיקרומטר מיקרומטר שדות בתצורת 4x4 מכל well של צלחת 6-גם הם צלמו כל 15 דקות במשך 5 ימים. תמונות זמן לשגות נבדקות ישירות למדוד התנהגויות סלולריות שיכול לכלול מנגנון ותדירות של יצירת מושבות תאים בתוך 24 השעות הראשונות של ציפוי לתאים (לעומת צבירת התפשטות תאים), שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים. מעקב תא בודד משמש ליצירת מפות גורל תא למדידה של חיי תא בודדים וחקירות של דפוסי חלוקת תא. נתונים כמותיים מנותחים סטטיסטי לאמוד את ההבדל משמעותי בהתנהגות מתואמת עם נגעים גנטיים ספציפיים.
מבוא
מודלי עכבר מהונדס גנטי הם כלים כדי ללמוד ולהבין איך נגעים גנטיים שונים תורמים לסיכון להתפתחות סרטן השד. לדוגמה, עכברים מהונדסים גנטי הראו כי שילוב של שלושה גורמים: האובדן של השד באורך מלא 1 הסרטן, התחלה מוקדמת (BRCA1) גנים בתאי האפיתל חלב, haploinsufficiency ניבט קו החלבון p53 גידול (TP53), וחלב אפיתל תא ממוקד עד מוסדר אלפא קולטן אסטרוגן (עידן) תוצאות ביטוי בהתפתחות של סרטן השד ב100% של BRCA1 (ו) וירוס 11/f11/Mouse חלב גידול (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (floxed ט-op) -ER/MMTV-reverse טטרציקלין transactivator (rtTA עכברים על ידי גיל 12 חודשים בהשוואה לאחוזים הנמוכים יותר דיווחו בBRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - עכברים ללא עידן על ביטוי (~ 50 - 60%) ועכברי BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre ללא TP53 haploinsufficiency (<5%). 1
הדמית זמן לשגות דינמית של ההתנהגות של תאי האפיתל חלב ראשוני preneoplastic מגלה הבדלים בהתנהגות תא המוערכים פחות בקלות בסעיפי רקמות סטטיות. שינויים בשגשוג והתמיינות תאים הם נצפו בחלב ראשוניים מנישאי מוטצית BRCA1 אדם. 2 יצירת השעיות תא הבודד של תאי האפיתל חלב ראשוניים מרגיל ועכברים מהונדסים גנטי נוצרות דרך התנערות האנזימטית של רקמת בלוטת חלב resected. 3 זמן לשגות תמונות נתפסות להעריך מנגנון ועיתוי של הופעה ושכיחות של שינויים מורפולוגיים בתאי אפיתל כולל מעבר-mesenchymal (EMT) ואפופטוזיס מושבת תא. דור של מפות גורל תא, כימות של משך הזמן בין חלוקות תא (גלגולים סלולריים), וקביעת הדפוסים של חלוקת תאים מתאפשרים על ידי שימוש במעקב מהתא בודד. טיםכלי מעקב של '(TTT) הוא תוכנה זמינה בפומבי משמשת ליצירת מפות גורל תא בודד. השירות שלה בהבהרת מנגנונים של גורל תא נקבע 4,5 בחינת התפתחות תקינה תא גזע hematopoietic 6-9 והדור של נוירונים. 10
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תכנית כללית
- צור תרבויות העיקריות של תאי אפיתל חלב preneoplastic מבלוטות חלב של הנדסה גנטית ולשלוט עכברי סוג פראי.
- צלם תמונות חי תאים כל 15 דקות באמצעות תוכנת רכישת תמונת Volocity (גרסת 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) לתקופה של עד 5 ימים.
- צפו בתמונות זמן לשגות ולהעריך עיתוי ואת המנגנון של יצירת מושבות תאי אפיתל, שכיחות של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים.
- המרת Volocity נוצר. ערימות TIFF ל. קבצי JPG באמצעות שינוי שם קבצים דיגיטליים תמונה (שינוי השם 2.1.6, אוטומצית MetaMorph מיקרוסקופי ותוכנת ניתוח תמונה (התקנים מולקולריים, LLC Sunnyvale, CA) וhttp://www.softpedia.com/get / מערכת / ניהול קבצים /-Rename.shtml) כדי לאפשר תאימות עם תוכנת כלי המעקב של טים (TTT,"Target =" _blank tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
- שימוש TTT, ליצור מפות גורל תא לקביעת הזמן בין חלוקות תא (גלגולים סלולריים) ודפוסים של חלוקת תאים (סימטרי לעומת סימטרי).
- ניתוח נתונים כמותיים משלבי 3 ו 5 לעיל כדי לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין דגמים השונים של עכבר מהונדס גנטי ו / או פקדי סוג פראי.
2. דור של תרביות תאים ראשוניות חלב אפיתל
- הכן מדיה מלאה לבידוד של תאי האפיתל חלב יחידים הבאים וריאציה של הוראות היצרן (EpiCult-B עכבר בינוני קיט, טכנולוגיות Stemcell, ונקובר, BC). שלב 450 מ"ל בינוני Epi-Cult-B, תוספת 50 מ"ל Epi-B קאלט התפשטות, סרום שור עוברי (5% FBS), 50 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (PenStrEP) ופקטור 10 ng / ml צמיחת אפידרמיס (EGF).
- הכן דיסוציאציה מדיה על ידי שילוב של חלק 1 של תערובת 10x collagenase / Hyaluronidase עם 9 חלקי מדיה מלאה מ2.1.
- להרדים את העכבר ולהמשיך מייד לנתיחה לאחר המוות. מקום עכבר על הגב שלה על פלטפורמת קלקר נתיחה לאחר מוות ולאבטח את כל ארבעת הגפיים כדי שהעור של גחון הוא מתוח. להרוות עור גחון ושיער, כולל שכיסה את הגפיים, עם 70% אתנול. לחשוף # 2/3 (חזה) ו# 4/5 (מפשעתי) בלוטות חלב על ידי ביצוע חתך קו אמצע דרך העור (לא יזין הצפק), המשתרע לY-חתך דרך העור המדיאלי של כל איבר וחזית הפוך חתך Y דרך העור המדיאלי של כל איבר אחורי.
- באמצעות נתיחה בוטה, להפריד את העור מunderlyingperitoneum, למשוך בחזרה בשני הצדדים של העור עד שהוא מתוח, ולאבטח אותו לנתיחה לאחר מות פלטפורמת הקלקר באמצעות סיכות. החל מהצד החיצוני, השתמש נתיחה בוטה עם שימוש נבון של disseמספרי ction לבודד מפשעתי השלמים ו / או בלוטות חלב בית חזה מרקמת חיבור בסיסית ושרירים. הנח לא יותר משני בלוטות חלב בצלחת פטרי סטרילית 10 סנטימטרים ולעבור למכסת מנוע תרבית רקמה.
- במכסת מנוע תרבית רקמה, לבחון בלוטות לבלוטות הלימפה חלב המזוהים כגושים קטנים, מעוגל וברורים עם צבע צהבהב. הסרת בלוטות לימפה מהבלוטה מקיפה באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים. ברר ברקמת שד ל~ 1 3 קוביות מ"מ באמצעות שני אזמלים סטריליים, אחד בכל יד.
- מקום טחון רקמת שד ב5 מ"ל דיסוציאציה מדיה, לערבב ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2-3 פעמים באמצעות פיפטה 10 מ"ל, ו דגירת הלילה (עד ~ 16 שעות) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם CO 2 ב5% צינור 50 מ"ל חרוטים עם כובע משוחרר.
- למחרת בבוקר, להכין תערובת קרה של פתרון 'חלק 1 הנקס מאוזן המלח (HBSS) מכיל 2% FBS ו4 חלקים נאגר פתרון אמוניום כלוריד לקדם האדום blתמוגה ood תא (HFAmCl) כמו גם HBSS הקר בתוספת 2% FBS (HF). טרום חם טריפסין-EDTA (0.25%), 5 מ"ג / המ"ל Dispase בתמיסת המלח המאוזנת של האנק השתנה, 1 מ"ג / המ"ל DNase, ומדיה מלאה.
- הסר את צינור צנטריפוגה חרוטים עם רקמת השד מהחממה ועדינות דופק פעמי מערבולת 2-3 שניות. צנטריפוגה הצינור ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C), והשלך את supernatant.
- Resuspend הגלולה במינימום של 10 מ"ל וHFAmCl צנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
- הוסף 3 מ"ל טריפסין-EDTA לגלולה ולערבב תחילה עם 5 מ"ל פיפטה ולאחר מכן עם micropipettor P1000 עד מגויד דקות (1-3). הוסף 10 המ"ל HF, צנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
- הוסף 2 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ו 200 Dispase μl של 1 מ"ג / המ"ל DNase לגלולה ולערבב עם micropipettor P1000 לדקות 1. מדגם צריך להיות cloג'ודי אך לא סיבי. אם סיבי, להוסיף 100 μl של DNase אני ומערבב שוב.
- הוסף 10 המ"ל הקר HF, מסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב450 × גרם למשך 5 דקות (טמפרטורת חדר או 4 ° C) ולהשליך supernatant.
- Resuspend הגלולה הסופית במדיה מלאה. לכמת את המספר הכולל של תאים (באמצעות hemocytometer או קולטר נגדי). שתי בלוטות חלב להניב כ 1 x 06-1 אוקטובר x 10 7 תאים. תאי אפיתל פלייט עיקריים בצלחת שטוחה תחתית 6-גם בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים לכל היטב.
3. הדמית Live-תא
- מייד לאחר ציפוי התאים, הנח את הצלחת 6-היטב היטב על במת מיקרוסקופ בתוך 5% CO 2 / רוויים humidity/37 ° C טמפרטורת חדר דגירה. התאם את הקבל לקולר תאורה ומרכז את טבעות השלב. לניסויים שהוצגו כאן, הפוך ניקון אקליפס TE300/PerkinElmer ספינינג הדיסק Confocalמערכת מיקרוסקופ במצב לעומת שלב widefield עם עדשה אובייקטיבית 10x הייתה בשימוש.
- תוכנת רכישת תמונה פתוחה, וליצור שם ספרייה עבור תמונות זמן לשגות, ולשמור במיקום עם מספיק מקום לקבצים גדולים. הניסויים שהוצגו כאן תוכנה מנוצלת Volocity תמונת רכישה (גרסת 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
- אפשר הצלחת כדי לאזן במיקרוסקופ החממה למינימום של 15 דקות. מנמיך את העדשות, כדי למנוע הפרעת שלב עדשה. תחת הכותרת "במה", בחר "כייל שלב". לרכוש מחדש את המטוס, סט מוקד Z = אפס תחת x, y, z כרטיסייה וסימן נקודתי ההדמיה על ידי בחירה באפשרות "הוסף נקודה" תחת "במה" הכותרת. נקודתי Place במרכזו של כל היטב של הצלחת 6 היטב להדמיה כהדמיה לעומת שלב עשויות להיות מעוות בסמוך לפריפריה של בארות פלסטיק. סדר נקודות בכיכר בשדות 4 4 x (650 x 700 מיקרומטר שדות מיקרומטר), כל אחד עם חפיפה קטנה (כ 5%). שמור את הנקודות הנבחרות תחת "צבידואר ".
- תחת "שלב", בחר "הפוך מפת מוקד" ופעל לפי הנחיות כדי להגדיר את המיקוד של כל נקודה. הגדר עיתוי רכישת תמונה כדי ללכוד 4 תמונות לשעה (כל 15 דקות). זה יכול להיות מותאם בהתאם לדרישות של הניסוי הספציפי. שמור את מפת המוקד תחת "במה".
- לחץ לחיצה ימנית על "יבוא תמונות" בצד ימין כלי הבר ולשמור את הגדרות ההדמיה. לחץ על כפתור ההקלטה כדי להתחיל את ההדמיה. לאחר השעה 1, לבדוק את הפוקוס של תמונות כדי לראות אם יש צורך בהתאמה.
- לפקח ולהמשיך הדמיה חייה במשך 5 ימים, שהסתיים כאשר תאים הופכים confluent.
4. צפייה ישירה של תמונות זמן לשגות להערכת עיתוי ומנגנון יצירת המושבות ראשונית אפיתל הסלולרי, תחולה של אפופטוזיס, וביטול הדרגתי של שינויים מורפולוגיים
- צפייה ישירה של תמונות זמן לשגות ניתן לבצע באמצעות כל תוכנת צפייה בוידאו תואמת (למשל http:/ / Www.real.com/ RealPlayer או תוכנות חינם זמינות מסחרי אחרות). תמונות ניתן לראות ב. פורמט TIFF בשלב זה או לאחר המרה לקבצי JPG. (ראה שלב 5).
- כדי לקבוע מנגנון של יצירת מושבות ראשונית, להתחיל עם מחסנית אחת דימוי מייצג אתר הדמיה אחד על הצלחת. במסגרות ראשוניות, תאים יהיו צפים. בצע תמונות סדרתיים כדי לקבוע מתי תא אפיתל 1 שומר על הצלחת. בשלב זה, תאי האפיתל יכולים להיות מזוהים ומובחן מן fibroblasts ידי מורפולוגיה cuboidal יותר שלהם. עקוב תא אפיתל יחיד זה דרך תמונות סדרתיים וגורלה של מעל 24 שעות לאחר מכן. להקליט אם הוא הופך להיות מוקף בתאי האפיתל נוספים או עובר אגף או אפופטוזיס תא. אם מוקף בתאי אפיתל, המנגנון של יצירת מושבות ניתן לקבוע באופן ישיר, על ידי הצגה אם התאים שמסביב נגזרים מתאים צפים שאז המצרפי עם תא החסיד הראשוני (הים) אומחלוקה של תא החסיד הראשוני. רשום את מספר המושבות שהוקמו על ידי צבירת תא לעומת חלוקת תא במהלך 24 השעות הראשונות.
- כדי לקבוע את מספר התאים בתחילה חסיד העוברים אפופטוזיס על תקופת זמן מסוימת, בצע את תמונות סידוריות להופעת תכונות קלסיות של אפופטוזיס מתפתחות בתא שהיה חסיד (http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html), ומספר התאים אפופטוטיים זוהו במהלך כל תקופת ההדמיה או בתוך מסגרות זמן מסוימות נרשמו.
- במשך זמן, תאי אפיתל בתרבות לשנות המורפולוגיה שלהם מצורת cuboidal ראשונית להופעה בקנה אחד עם EMT מוארכת יותר. בצע תמונות סדרתיים כדי לקבוע היום / שעה לאחר ציפוי כאשר זה מתרחש.
5. שינוי קובץ תמונה
- באמצעות תוכנת Volocity, לייצא את קבצי תמונה לערימות TIFF. הנה אוטומצית MetaMorph מיקרוסקופית ותוכנת ניתוח תמונה (התקנים מולקולריים, LLC Sunnyvale, CA) שמשה כדי לפתוח את קבצי מחסנית TIFF ואז הם נצלו בMetaMorph כתמונות JPG בודדות..
- שנה את שמות תיקיות וקבצי התמונה בהתאם לדרישות לתוכנת כלי המעקב של טים השתמש בתוכנה חופשיה כמו שינוי השם 2.1.6 (http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml) כדי לשנות שמות קבצים בקבוצות. צור תיקייה אחת המכילה את כל התיקיות וקבצים של הניסוי ושם לתיקייה (לדוגמה: EXPERIMENTNAME).
- יצירת תיקיית משנה עבור כל נקודה / מצב שבו התרבות הייתה הדמיה. תנו לתיקיות: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. מספר המיקום צריך להיות 3 ספרות. דוגמה: 072511RN_p001. לשים את כל קבצי התמונה של עמדת הפרט בתיקיית המשנה.
- הוסף timepoint (באמצעות 5 ספרות) ומספר ערוץ (מאחר שקיים רק ערוץ אחד, שדה בהיר, השתמש "0") בסופו של כל שם קובץ בפורמט זה:
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - ליצור קובץ יומן לכל תפקיד על ידי הורדת TTTlogfileconverter התכנית הראשונה חינם מאתר TTT. הפעל את תכנית TTTlogfileconverter ובחר את תיקיית הניסוי. קלט מרווח תמונה (בשניות). לתמונה שצולמה בכל 15 דקות, זן 900 שניות. לאחר מכן לחץ על הכפתור הירוק קבצים הסמוי יומן.
6. דור של מפות גורל תא של תאים בודדים באמצעות TTT
- גreate תיקייה בשם TTTexport ותיקיית משנה בשם TTTfiles שבו יאוחסן כל נתוני המעקב הסלולרי בעקבות הוראות תוכנת TTT
- הפעל את תכנית TTT, בחר ראשי תיבות של משתמשים, ולחץ על "המשך".
- לחץ על "קבע NAS," בחר את המשתמש יצר תיקייה "TTTexport", ולחץ על אישור. בדפדפן, בחר תיקיית ניסוי, בחר תיקיית עמדה, ולאחר מכן לחץ על כפתור "טען עמדה".
- הגדרת גורם לעיני "10x". טען מספר התמונות הנדרשות (טעינה כל התמונות מומלצות לפעם הראשונה).
- בחלון עורך תא, בחר "מושבה חדשה" תחת תפריט הקובץ. בחלון הסרט, לחץ על "תא המסלול" או F2 כדי להתחיל לעקוב אחר תא.
- זהה את התא בMחלון ovie ועכבר שימוש לממקם את הסמן מעל לתא. מעגל עם מספר התא אמור להופיע לאחר F2 כבר לחץ. השתמש במקש "0" בלוח המספרים של המקלדת כדי לעקוב אחר מיקומו של התא ולהתקדם לתמונה הבאה. הזז את הסמן למעקב המיקום של כל תא בכל מסגרת. כדי למחוק ולחזור למסלול הקודם תמונת העיתונות "הדל" במקלדת הנומרית. כדי להעביר מסגרות קדימה ללא מעקב תא העיתונות "3", וכדי לנוע אחורה בלי מעקב עיתונאים "1" במקלדת הנומרית.
- כדי לסמן חלוקת תא לחץ על הכפתור "האגף" בחלון הסרט. כדי לסמן מוות של תאים לחץ על הכפתור "תא המוות" בחלון הסרט. ברגע שחלוקה התרחשה, תאי הבת יכולים להיות במעקב באותה מפת גורל תא על ידי לחיצה ימנית על סמל העיגול של התא בת הייעודי בחלון עריכת התא כדי להתחיל לעקוב אחר מצב באופן אוטומטי.
- לחץ על F10 כדי לשמור על העץ. כל עץ יחסוך בקפל התפוקה המיועדתאה (TTTExport). כדי להתחיל מפת גורל תא חדשה, בחר "מושבה חדשה" תחת אז "קובץ" תפריט "פתח" בחלון עריכת התא.
- לווח נתונים סלולריים לאחר שאסף את כל חיים מהכרטיסייה "נתונים סלולריים" בחלון עריכת התא.
7. ניתוח סטטיסטי
- השתמש במבחן t או של הסטודנט (אם השוואת שני גנוטיפים) או ANOVA (אם משווים> 2 גנוטיפים) כדי לקבוע אם הבדלים בנתונים פרמטריים כגון מספרים של מושבות ראשונות סלולריות, גלגולים סלולריים או שעות עד להופעת EMT בין גנוטיפים שונים מבחינה סטטיסטית משמעותי. תדירות אפופטוטיים ניתן להשוות את המספר / תאים מצופים מספר כוללים של הסטודנטים באמצעות מבחן t או ANOVA או עם מאן ויטני או Kruskal-ואליס כאשר נגזרו כאחוז מתאי חסיד.
- לבצע בדיקות חשמל באמצעות נתונים מניתוחים של ניסויים ראשוניים כדי לקבוע כמה ניסיוני משכפל צריכה לבצע ומפות גורל תא שנוצרו מכל לשכפל לים הולםכוח tatistical שימוש חינמי זמין (למשל http://statpages.org/). בניסויים שהוצגו כאן, תרביות תאים שמקורם משלושה עכברים לגנוטיפ היו מספיקות כדי לקבוע אם היו הבדלים משמעותיים סטטיסטי ביצירת מושבות תא וגלגולים סלולריים כאשר שינויים גנטיים ספציפיים שנעשו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאי אפיתל ופיברובלסטים יכולים להיות מכובדים על ידי מורפולוגיה של תאים. תאי האפיתל יש צורת cuboidal (איור 1 א-B) ומושבות תאי טופס (איור 1 א). Fibroblasts, סוג של תא סטרומה, יש מורפולוגיה מוארכת (האיור 1C).
תאים היו מעוגלים וצפו בתחילת ההדמיה (איור 2A-D). לאחר התקשרות לצלחת שהם נעשו שטוחים והפגינו הופעת cuboidal סוג (2E איור, ח). ע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים קריטיים
חשוב לוודא שבלוטות חלב נקצרות מעכברי בנים אותו הגיל לשליטה לשונות הקשורים בגיל בהתנהגות תא אפיתל חלב. כאשר ציפוי התאים, אותו מספר התאים צריך להיות מצופה בכל אחד גם לכל ניסוי. תאים צריכים להיות דלילים יחסית כאשר ציפוי כך שתרבויות לא הופכות confluent מהר מדי כך שניתן לעקוב אחר תאים בודדים מרובים באמצעות תמונות סדרתיים. זה חיוני כי הצלחת תהיה מתאזנת בחממה לפני ההדמיה בגלל ההתמקדות תשתנה אחרי הצלחת היא מתא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לBofan וו והנוצרי Raithel לקבלת סיוע טכני ומיכאל ריגר להקדמתו להדמיה חייה תאים. נתמך על ידי NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), דויטשר Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), משרד ההגנה W81XWH-11-1-0074 (REN), תכנית WCU (World Class אוניברסיטה) באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה ממומנת על ידי משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (ציוד מתקן גדר מכרסם), וNIH NCI 5P30CA051008 (מיקרוסקופי ומשאבי הדמיה ובעלי חיים משותפים).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| עכבר בינוני אסאל EpiCult-B | טכנולוגיות StemCell | 05610 | |
| EpiCult-B מאוס תוספים למניעת הפצת נשק | טכנולוגיות StemCell | 05612 | |
| רקומביננטי עוריות Growth Factor האנושי (rhEGF) | טכנולוגיות StemCell | 02633 | |
| Collagenase / Hyaluronidase | טכנולוגיות StemCell | 07912 | |
| Scapels חד פעמי | נוצה | 2975 # 10 | |
| תמיסת המלח המאוזן "הנקס | טכנולוגיות StemCell | 37150 | |
| כלוריד mmonium | טכנולוגיות StemCell | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | טכנולוגיות StemCell | 07901 | |
| Dispase | טכנולוגיות StemCell | 07913 | |
| אני DNase | טכנולוגיות StemCell | 07900 | |
| מסננת תא 40 מיקרומטר | טכנולוגיות StemCell | 27305 | |
| FBS | טכנולוגיות StemCell | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
מקורות
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
