הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50201

⸱

19 בפברואר 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

תקציר

בעוד שניתן למדוד את הובלת הקטיונים על ידי טרנספורטר הממברנה האלקטרוגני Na+,K+-ATPase על ידי אלקטרופיזיולוגיה, קשה יותר לחקור את הקיבה הפועלת באופן אלקטרוניילי H+,K+-ATPase. בדיקות תחבורה רבות משתמשות ברדיואיזוטופים כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק, עם זאת, אמצעי האבטחה הדרושים מטילים מגבלות חמורות לגבי חשיפה אנושית או תכנון בדיקה. יתר על כן, הובלת יונים על פני קרומי התאים מושפעת באופן קריטי מפוטנציאל הממברנה, שאינו נשלט באופן ישיר בתרבית תאים או בתכשירי פרוטאוליפוזום. כאן, אנו עושים שימוש ברגישות יוצאת הדופן של ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית (AAS) כלפי כמויות עקבות של יסודות כימיים כדי למדוד הובלת Rb+ או Li+ על ידי Na+,K+- או H+,K+-ATPase בקיבה בתאים בודדים. באמצעות ביציות Xenopus כמערכת ביטוי, אנו קובעים את כמות ה-Rb+ (Li+) המועברת לתאים על ידי מדידת דגימות של הומוגנטים של ביצית בודדת במכשיר AAS המצויד בתנור מרסס גרפיט מחומם לרוחב (THGA), הנטען מדגימה אוטומטית. מכיוון שהרקע של קליטת Rb+ לא ספציפית לביציות בקרה או במהלך יישום מעכבי ATPase ספציפיים הוא קטן מאוד, ניתן ליישם תוכניות בדיקה קינטיות מורכבות הכוללות מספר רב של תנאי ניסוי בו זמנית, או להשוות את יכולת ההובלה והקינטיקה של טרנספורטרים שעברו מוטציה ספציפית לאתר בדיוק גבוה. יתר על כן, מכיוון שקליטת הקטיונים נקבעת על תאים בודדים, ניתן לבצע את ניסויי השטף בשילוב עם הידוק מתח של שתי אלקטרודות (TEVC) כדי להשיג שליטה מדויקת על פוטנציאל הממברנה והזרם. זה איפשר למשל לקבוע כמותית את סטוכיומטריית ההובלה 3Na+/2K+ של ה-Na+,K+-ATPase ואיפשר לראשונה לחקור את תלות המתח של הובלת הקטיונים על ידי הקיבה הפועלת באופן אלקטרו-ניטרלי H+,K+-ATPase. באופן עקרוני, הבדיקה אינה מוגבלת לחלבוני ממברנה המובילים K+, אך היא עשויה לעבוד באותה מידה כדי לטפל בפעילות של מובילי מתכות כבדות או מעבר, או ספיגה של יסודות כימיים על ידי תהליכים אנדוציטוטיים.

מבוא

רצינו לפתח אלטרנטיבה רגישה, בטוחה וזולה לניסויי מעקב רדיואקטיביים כדי לחקור את פעילות ההובלה הספציפית של חלבוני ממברנה מעבירים יונים על מנת לעקוף מגבלות לגבי גישה למעבדות איזוטופים, דרישות בטיחות או שימוש ברדיואיזוטופים יקרים, שכמו במקרה של ליתיום עשויים אפילו להיות לא זמינים בגלל זמני דעיכה קצרים במיוחד. התענייננו במיוחד בקביעת הפעילות של הקיבה H+,K+-ATPase הפועל באופן אלקטרו-ניטרלי, מכיוון שהאנזים אינו מייצר זרם ולכן לא ניתן לטפל בפעילותו בשיטות אלקטרופיזיולוגיות. מכיוון ש-Na+,K+- ו-H+,K+-ATPase הובלה Rb+ יעילה כמו K+ (וגם Li+), הרגישות הגבוהה של טכניקת AAS לרובידיום או ליתיום אמורה להקל על זיהוי רגיש של פעילות תחבורה. ספקטרופוטומטרים של ספיגה אטומית הם מכשירים אנליטיים נפוצים, המופצים באופן נרחב במעבדות כימיות ואמורים להיות נגישים למספר רב של מדענים מעוניינים. יתר על כן, רצינו לנצל את מערכת ביטוי הביציות Xenopus, המשתמשת בתאים בודדים גדולים (בקוטר של כ-1.0-1.5 מ"מ) המאפשרים להשיג שונות נמוכה להפליא מתא לתא לגבי רמת ביטוי החלבון בתוך אצווה בודדת. חישוב פשוט מדגים את היתכנות בדיקת ה-AAS: גבול הזיהוי (מסה אופיינית) עבור רובידיום בטכניקת THGA-AAS הוא 10 pg או 1.2.10-13 מול (Rb: 85.47 g/mol), עבור ליתיום 5.5 pg או 7.9.10-13 מול (Li: 6.94 g/mol). עם ביטוי הטרולוגי של Na+,K+-ATPase בביציות Xenopus, ניתן להשיג זרמי משאבה של 100 nA (השווה לכ-6.2·1011 מטענים אלמנטריים לשנייה, או 1.03·10-12 מול s-1), ובכך לגרום להובלה של 6·10-6 מעלות צלזיוס של מטען תוך דקה אחת. מכיוון שהובלה של מטען נטו אחד תואמת את הספיגה של שני יוני Rb+ (עקב הסטוכיומטריה 3Na+/2K+), זרם של 100 nA למשך דקה אחת מתאים לספיגה של 1.2·10-10 מול Rb+. לפיכך, אפילו בדילול של פי 1,000 (הומוגניזציה של ביצית בנפח של כ-1 מיקרוליטר ב-1 מ"ל מים), דגימת THGA-AAS טיפוסית (20 מיקרוליטר) מכילה 2.4.10-12 מול Rb+ (או 204 pg), שהוא הרבה מעל סף הזיהוי. לכן, אפילו טרנספורטרים עם פעילות הובלה נמוכה פי 100 או ביטוי קרום פלזמה יכולים להיבדק בטכניקה על ידי התאמה מתאימה של זמן השטף של הניסוי.

מכיוון שקצב השאיבה תלוי ברגישות בטמפרטורה (אנרגיות הפעלה אופייניות עבור Na+,K+-ATPase הן בטווח של 90 kJ/mol עד 130 kJ/mol1-3, מה שמביא לעלייה של כ-30% בקצב התחלופה עם שינוי מ-20 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס), חובה לבצע את מדידות השטף תחת בקרת טמפרטורה מדויקת (מיזוג אוויר) עם פתרונות חיץ מאוזנים היטב. יתר על כן, יש לבחור בקפידה ביציות לגבי גודל הומוגני לביטוי של מוביל יונים. עם אמצעי זהירות אלה, ניתן להשיג באופן שגרתי שגיאות תקן ניסיוניות של פחות מ-10 אחוזים עם כ-10 תאים לכל תנאי ניסוי. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לקבוע למשל את זיקות ה-Rb+ לכאורה של הובלת קטיון4-6, את ההשפעה של pH חוץ-תאי ותוך-תאי7 ואת ההשפעה של מוטציות של שאריות המעורבות בתיאום הקטיונים במהלך ההובלה4,8. היתרון של הטכניקה הוא שניתן לקבוע שטפי יונים גם בשילוב עם הידוק מתח של שתי אלקטרודות של הביציות, מה שמבטיח מצד אחד שליטה מדויקת על פוטנציאל הממברנה במהלך ההובלה ומצד שני מאפשר לתאם שטף יונים עם זרם הממברנה. לפיכך, ניתן היה לאמת את הסטוכיומטריה 3Na+/2K+ של ה-Na+,K+-ATPase (ראה תוצאות לדוגמה להלן) ולקבוע את תלות המתח של הובלת הקטיונים של הקטיון של הקיבה H+/K+-ATPase7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מבני cDNA וביטוי חלבונים בביצי Xenopus

יש לשבט את ה-cDNA של חלבון הממברנה הרצוי לתוך וקטור המתאים לביטוי באוציטים של Xenopus laevis, כגון pTLN9 או pcDNA3.1X10. וקטורים אופטימליים אלו מכילים את האזורים שאינם מתורגמים (UTR) של ה-5' וה-3' של הגן ל-β-globin של Xenopus laevis המקיפים את אתר השבוט הרב-חלקי (MCS), רצף פרומוטר של RNA polymerase (ב-pTLN: SP6, ב-pcDNA3.1X: T7) הממוקם לפני ה-5' UTR, רצף poly-A בכיוון 3' של ה-MCS כדי להבטיח את יציבות ה-cRNA בתאים, ובהמשך זרם מטה רצף נוסף של אתרי חיתוך בודדים של אנדונוקליאז רסטריקציה לצורך ליניאריזציה של הפלסמיד כדי שישמש כתבנית לטרנסקריפציית cRNA in vitro.

כדי להבדיל בין הפעילות של Na+/K+-ATPase אנושי מובטא ביתר (תת-יחידה α2 + תת-יחידה β1) לבין Na+/K+-ATPase אנדוגני של האואוציטים, הוכנסו המוטציות Q116R ו-N127D כדי לקבל חלבון העמיד לאואבאין עם IC50 בטווח מילימולרי11. במקרה של H+/K+-ATPase, מדידות שטף בוצעו באמצעות מוטנט S806C של תת-היחידה α של H+/K+-ATPase, מאחר ששטפי Rb+ נמצאו במתאם עם נתונים קינטיים מניסויי voltage-clamp fluorometry (VCF). טכניקת ה-VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12 מבוססת על חיבור ספציפי של פלואורופור לשארית ציסטאין שהוכנסה באופן אסטרטגי, המדווחת על שינויים קונפורמציונליים של האנזים.

2. ליניאריזציה וטיהור של תבנית ה-DNA

  1. לצורך ליניאריזציה של תבנית ה-DNA, לבצע עיכול של 3 μg של plasmid DNA בנפח תגובה של 50 μl עם 5 μl של באפר בריכוז 10x המתאים לאנזים ההגבלה ו-10 U של אנזים הגבלה למשך שעה אחת ב-37 °C.
  2. לטהר את ה-DNA הליניארי באמצעות ה-High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). ראשית, להוסיף 350 μl של binding buffer (המכיל guanidiniumisothiocyanate) למבחנת העיכול. לאחר שלב טהרה זה, תבנית ה-DNA הליניארית היא בדרגת 'RNA grade' כיוון ש-guanidiniumisothiocyanate הוא דנטורנט חלבונים יעיל והוא משמיד במיוחד RNAse, המהווה מזהם נפוץ במעבדות ביולוגיה מולקולרית.
  3. להכניס עמודי spin לתוך מבחנות איסוף, להעמיס על העמוד את תמיסת ה-DNA משלב 2, לסובב בצנטריפוגה ב-13,000 x g למשך 30 שניות ולהשליך את הנוזל שעבר (flow-through).
  4. להוסיף 500 μl של washing buffer לעמוד. לסובב בצנטריפוגה במשך דקה אחת ב-13,000 x g ולהשליך את הנוזל שעבר.
  5. להוסיף 200 μl של washing buffer לעמוד. לסובב בצנטריפוגה במשך דקה אחת ב-13,000 x g כדי לייבש את העמוד לחלוטין.
  6. להניח את עמוד ה-spin במבחנת Eppendorf נקייה של 1.5 ml ולהוסיף לעמוד 50 μl של nuclease-free water (Ambion Product # AM9937). לבצע אלוציה על ידי סבוב בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות מקסימלית.
  7. לאחר האלוציה, לרכז את התמיסה המכילה את ה-DNA לנפח של כ-15 μl. שלב זה מבטיח שהתמיסה תכיל 0.5 μg של DNA ליניארי ב-3 μl, שהוהה את הריכוז המומלץ לתגובת שעתוק cRNA in vitro הבאה.

3. סינתזת cRNA In Vitro

  1. בחרו את ערכת ה-mMessage mMachine המתאימה (Ambion Product #1340, #1344) בהתאם לרצף הפרומוטור בפלסמיד (SP6, T7). לנפח תגובה כולל של 10 μl, הוסיפו 3 μl של DNA ליניארי מהשלב הקודם ו-1 μl של תחליל טרנסקריפציה (transcription buffer) למנות של 5 μl של NTP-cap mix שהוכנו מראש. חלוקה מראש של ה-NTP-cap mix נחוצה כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה תכופים, העלולים להוביל לדגרדציה של הנוקליאוסיד-טריפוספטים. לבסוף, הוסיפו 1 μl של RNA polymerase המתאים, ערבבו קצרות וסובבו את תערובת התגובה בcenterY-spin-down.
  2. דגרו את תערובת התגובה למשך 1 עד 2 שעות ב-37 °C. זמן הדגירה לא יעלה על שעתיים, שכן הדבר עלול להוביל לירידה בתנובת ה-cRNA או באיכותו.
  3. הוסיפו 15 μl של תמיסת LiCl בריכוז 3 M קרה מהערכה, 15 μl של מים קרים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water), ערבבו קצרות (אין להשתמש בוורטקס), סובבו קצרות את הדגימה ב-11,000 x g למשך 10 שניות, ואחסנו ב-20 °C- למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר שקיעה של ה-cRNA.
  4. קררו מראש את הצנטריפוגה ל-4 °C וצנטריפוגו למשך 15 דקות לפחות ב-13,000 x g לאחר השקיעה.
  5. הסירו בזהירות ובשלמות את הנוזל העליון (supernatant) מהמשקע החום-בהיר בתחתית המבחנה והוסיפו 150 μl של אתנול 70% בדרגת RNA שקולל ל-20 °C-. צנטריפוגו ב-4 °C למשך 5 דקות ב-13,000 x g.
  6. הסירו את הנוזל העליון לחלוטין, ייבשו קצרות (1-2 דקות) את משקע ה-cRNA שנותר במאדה צנטריפוגלי (למשל Eppendorf Concentrator model 5301) בטמפרטורת החדר.
  7. המסו את המשקע ב-12 μl של מים קרים נקיים מנוקלאז. זהירות: יש לבצע את כל השלבים הבאים כאשר דגימת ה-cRNA נשמרת על קרח.
  8. קבעו את ריכוז ה-cRNA באמצעות ספקטרופוטומטר (למשל Eppendorf BioPhotometer).
  9. בדקו את שלמות ה-cRNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. זהירות: בדיקה צולבת זו נחוצה, שכן גם RNA שעבר דגרדציה חלקית נותן בליעת UV שאינה אפס. לאלקטרופורזה של cRNA, השתמשו בתא אלקטרופורזה שנוקה ביסודיות ומולא מחדש בתחליל TAE ובג'ל אגרוז 1% שהוכן טרי. אם קיים חשד לזיהום ב-RNAse בתא האלקטרופורזה או בתחליל, מלאו את התא ב-0.1 M HCl למשך שעה לצורך ניקוי והכינו את תחליל ה-TAE עם מים נקיים מנוקלאז.
  10. אחסנו את ה-cRNA ב-20 °C- עד לשימוש. ניתן לאחסן cRNA למשך שנה אחת לפחות ב-20 °C-.

4. השגת חומר מהשחלה של נקבות Xenopus laevis באמצעות כריתה חלקית של השחלה

פרוטוקול זה אושר על ידי הרשות הממשלתית האחראית (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, The Senate of Berlin, Germany).

  1. אין להאכיל את הצפרדע לפחות 12 hr לפני הניתוח כדי למנוע הקאה.
  2. יש להכין תמיסה של 2 g של חומר האלחוש המקומי tricaine (MS-222) המומס ב-1 L מים, כאשר ה-pH מותאם ל-7.0 באמצעות 5 mM HEPES buffer. אזהרה: יש להשתמש בכפפות ניטריל בכל עת בעת טיפול ב-MS-222 ולהכין את התמיסה במapay מנדף כימיים.
  3. יש להטביל את הצפרדע בתמיסת ה-tricaine (מקסימום 10 min) עד שהבעל לא מראה יותר רפלקסי זקיפה. כדי לבדוק את היעדר התגובה, נסו להפוך את הצפרדע על גבה בידיכם ועקבו אחר תנועות הגנה.
  4. יש להוציא את הצפרדע מתמיסת ה-tricaine ביד ולשטוף את בעל החיים במי ברז קרים כדי להסיר את חומר האלחוש.
  5. יש להניח את הצפרדע על גבה מעל מצע קרח המכוסה במגבת נייר רטובה, כדי למנוע נזק לעור הצפרדע כתוצאה ממגע ישיר עם קרח. יש לשמור על עור בעל החיים רטוב בכל עת במהלך הניתוח כדי למנוע התייבשות. הנחה על קרח מאריכה את משך ההרדמה.
  6. יש לבצע חתך בטני קטן (באורך 8-10 mm) בעזרת מספריים חדים, בצד שמאל או ימין של קו האמצע של הצפרדע. אזהרה: יש להיזהר לא לפגוע בקו הצד (lateral line). ניתוחים עוקבים יבוצעו בצדדים לסירוגין כדי לאפשר התאוששות טובה של רקמת השחלה שמתחתיהם. בדרך כלל, יש לחדור דרך שלוש שכבות רקמה (העור החיצוני, שכבה דקה של רקמת חיבור לבנה - הפסציה - ושכבת שריר).
  7. לאחר פתיחת הבטן, יש לתפוס חלקים מאונות השחלה בעזרת פינצטה קהה ולמשוך אותם בעדינות החוצה. כהנחיה, יש להסיר כ-3-5 cm של רקמת שחלה מהשחלה באמצעות חתך. במקרה של פגיעה בכלי דם קטנים ודימום, יש להפעיל לחץ באמצעות מוט פלסטיק סטרילי או לקרר את מקום הפגיעה בקרח עד להפסקת הדימום.
  8. יש לסגור את החתך בניתוח באמצעות תפריים בודדים (interrupted suture pattern) עם 4.0 Ethicon Vicryl suture (Johnson & Johnson #V633H). יש להשתמש במכשור כירורגי לתפירה ולקשור שניים או שלושה קשרים בנפרד לאורך החתך. אזהרה: חשוב שכל קשר יתפיר את שלוש שכבות הרקמה בשלב אחד.
  9. לאחר הניתוח, יש להניח את הצפרדע באגן מים בעל שיפוע קל (30 L), המכיל מספיק מים רק כדי לכסות את תחתיתה, כך שנחיריי בעל החיים יהיו מעל מפלס המים כדי לאפשר נשימה. יש לכסות את בעל החיים במהלך תקופת ההתעוררות (כ-1-2 hr) במגבת נייר רטובה כדי למנוע התייבשות של העור הרגיש.
  10. כאשר בעל החיים פעיל שוב, יש למלא את אגן המים ולהחזיק את הצפרדע בנפרד מבעלי חיים אחרים למשך 3-4 ימים כדי לנטר את ההתאוששות והריפוי של הפצע.
  11. לאחר הניתוח, יש להמתין לפחות 3 months לפני ניתוחים עוקבים כדי לאפשר התאוששות מלאה של בעל החיים ושל רקמת השחלה שלו. כהנחיה, ניתן לבצע מקסימום 6-8 ניתוחים בכל צפרדע.

5. בידוד אנזימטי של ציטות בודדות

  1. גזרו את רקמת השחלה לחתיכות קטנות יותר בעזרת מספריים והעבירו את הרקמה לתוך Oocyte Ringer Solution without Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.4) המכיל collagenase (20 mg/ml, type 1A מ-Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) ו-trypsin inhibitor (10 mg/ml, Type III-O מחלבון ביצת תרנגולת, Sigma #T2011).
  2. נערה בעדינות את תמיסת העיכול במשך 2.5 hr בטמפרטורה של 18 °C. לאחר מכן, עקבו אחר התקדמות העיכול במרווחי זמן של 15 min עד שרוב האוציטים יופרדו מרקמת הזקיקים.
  3. שטפו את האוציטים מספר פעמים בתוך מבחנת Falcon של 50 ml עם Oocyte Ringer Solution without Ca2+ עד שהתמיסה תהיה נקייה מספיק משאריות רקמה.
  4. אחסנו את האוציטים בתוך Oocyte Ringer Solution containing Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.4) הכולל gentamycin (50 μg/ml) בטמפרטורה של 18 °C.

6. הזרקת cRNA

  1. לביטוי של Na+,K+- או H+,K+-ATPase, יש להזריק לאוציטים 50 nl של תמיסת cRNA המכילה 25 ng של תת-יחידה α ו-5 ng של תת-יחידה β cRNA באמצעות משאבת הזרקה Nanoject II המופעלת חשמלית (Drummond Scientific Inc.), עם צינורות המטוקריט בגודל 3.5" (Drummond #3 000-203-G/X). אזהרה: כמות ה-mRNA עשויה להשתנות בהתאם לחלבון המטרה וייתכן שיהיה צורך להתאימה לצורך ביטוי מקסימלי באמצעות Western blotting.
  2. עבור כל תנאי שטף (לדוגמה, בריכוז Rb+ ספציפי), יש להזריק ל-18-22 אוציטים. מתוכם, 50% ייבדקו תחת תנאי "+flux" (לדוגמה, ריכוז Rb+ מסוים), ו-50% תחת תנאי "-flux" (לדוגמה, עם ריכוז ה-Rb+ הנבחר ומעכב ספציפי של האנזים בריכוז רווי, כגון 10 mM ouabain עבור Na+,K+-ATPase או 10 μM SCH28080 ב-pH 5.5 עבור H+,K+-ATPase).
  3. לאחר ההזרקה, יש להעביר את האוציטים בנפרד לפלטות 96-בארים הממולאות עד מחציתן בתמיסת Oocyte Ringer המכילה Ca2+ ו-50 μg/ml gentamycin בטמפרטורה של 18 °C.
  4. יש לכסות את פלטת 96-הבארים ב-Parafilm כדי למנוע אידוי מופרז.
  5. יש לדגור את האוציטים למשך 2-7 ימים (תלוי בחלבון הנבדק) בטמפרטורה של 18 °C. במידה ונדרש אחסון של האוציטים למשך יותר מ-3 ימים, מומלץ להחליף את באפר הדגירה בתוך המיקרובארים מדי 3 ימים.
  6. עבור כל סט של נתוני שטף (לדוגמה, ניסוי טיטרציה של [Rb+]), יש לבדוק כ-10 אוציטי ביקורת שלא הוזרקו (או שהוזרקו להם 50 nl של מים נקיים מנוקלאז) תחת תנאי "+flux" ו-"-flux". לפיכך, יש לדגור מספר מספיק של תאי ביקורת באותה דרך שבה דוגרו האוציטים שהוזרק להם cRNA לפני ניתוח השטף.

טיפול מקדימ באופן של ציטות המבטאות ATPase הטרולוגי

הליך טעינת Na+

עבור מדידות תפקודיות של Na+/K+-ATPase, חשוב להעלות את ריכוז ה-Na+ התוך-תאי13, באופן הבא:

  1. העבירו את הביציות לNa+ Loading Buffer (110 mM NaCl, 2.5 mM Na-citrate, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) למשך 45 דקות על קרח.
  2. לצורך התאוששות לאחר מכן, דגרו את הביציות בPost Loading Buffer "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2 ו-2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) למשך 30 דקות לפחות על קרח.
  3. שמרו את הביציות בPLB על קרח עד לשימוש.

7. חסימה מוקדמת של Na+,K+-ATPase אנדוגנית

זהירות: מכיוון שביציות של Xenopus מבטאות Na+,K+-ATPase אנדוגני, חשוב לחסום משאבה אנדוגנית זו לפני ניסויי זרימת Rb+, באופן הבא:

  1. כעת נחסום את ה-Na+,K+-ATPase האנדוגני על ידי דגירה של האוציטים ב-Post Loading Buffer המכיל 100 μM ouabain למשך 15 min בטמפרטורת החדר.

8. אלקטרופיזיולוגיה

  1. הכינו מיקרואלקטרודות על ידי מתיחת קפילריות בורוסיליקט (GB150F-8P, Science Products GmbH) באמצעות מכשיר מתיחה של מיקרופיפט בשני שלבים (Model PC-10, Narishige).
  2. מלאו את אלקטרודות הזכוכית מהחלק האחורי ב-3 M KCl. עבור ניסויי TEVC עם H+,K+-ATPase, אנו ממליצים להשתמש ב-3M NaCl במקום, דבר שהוביל להקלטות זרם יציבות יותר. התקינו את הפיפט מעל תיל ה-Ag/AgCl של מחזיקי המיקרואלקטרודות במערכת ה-two-electrode voltage-clamp.
  3. הכניסו למתאם ההקלטה (Warner Instr., model RC-10), הממולא מראש בבופר מדידה (למשל PLB עם 10 μM ouabain עבור Na+,K+-ATPase), את מיקרואלקטרודות הזכוכית ושני גשרי אגר (אלו צריכים להיות עשויים מ-NaCl/agar במקום KCl/agar הנפוץ), המחברים את אלקטרודות הייחוס Ag/AgCl לתמיסת האמבט.
  4. העבירו את מגבר ה-voltage-clamp (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany) למצב "OFF".
  5. בדקו את ההתנגדות של כל אלקטרודת זכוכית בנפרד (שתיהן צריכות להיות בטווח של 0.5-2 MΩ).
  6. בדקו את פוטנציאלי ה-offset של אלקטרודת המתח והזרם בתצוגת מגבר ה-TEVC המתאימה. במקרה של סטייה מאפס, כווננו את ה-offset באמצעות רגולטורי ה-offset המתאימים של המגבר.
  7. הניחו אווציט במרכז המתאם והחדירו בעדינות את אלקטרודת הזרם ואלקטרודת המתח דרך הממברנה.
  8. בדקו את קריאת הפוטנציאל של המגבר. הקריאה של פוטנציאל אלקטרודת המתח נותנת כעת את הערך של פוטנציאל המנוחה של התא.
  9. העבירו את המגבר למצב VC (voltage-clamp).
  10. בעזרת תוכנת pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), קבעו את התא לפוטנציאל ממברנה מוגדר מראש. זה יכול להיות ערך פוטנציאל המנוחה שנמדד קודם לכן (להקלטה בתנאים של זרם ממברנה אפס) או כל ערך פוטנציאל בדיקה רצוי. שימו לב לאמפליטודה וליציבות של זרם הדליפה (בהיעדר K+/Rb+/Li+), אשר - כקו מנחה כללי - לא יעלה על -200 nA ב- -30 mV.
  11. בצעו פרפוזיה לאווציט למשך זמן מסוים (למשל 3 min עבור Na+,K+-ATPase) עם תמיסה המכילה Rb+ (כדי להשיג זרם מקסימלי השתמשו בריכוזים רוויים ממדידות שטף בתנאים ללא clamp) והקליטו את זרם המשא באמצעות תוכנת pCLAMP במצב הקלטה רציפה. ודאו שספיגת ה-Rb+ הופסקה לחלוטין לאחר מכן על ידי ביצוע פרפוזיה לתא עם תמיסה נטולת Rb+ למשך 30 sec.
    1. הפסיקו את ניסוי ה-two-electrode voltage-clamp, הוציאו את האווציט ממתאם ההקלטה והמשיכו לשלב שטיפה 4 בפסקה "Rb+ uptake experiments" כדי לנתח את ספיגת ה-Rb+ באמצעות ספקטרופוטומטריית בליעה אטומית.
  12. בצעו חיסור זרם offset והעריכו את האינטגרל הזמני של זרם המשא באמצעות תוכנת Clampfit מחבילת pCLAMP.

9. מדידות ספיגת Rb+

  1. גזרו והמיסו טיפ צהוב של פפיטה של 200 μl לקוטר של כ-2 mm. שימוש בטיפים כאלה מבטיח העברה מינימלית של תמיסה כאשר מעבירים את הביציות בין כלי דגירה או שטיפה. המיסו בקצרה את קצה הטיפ באמצעות להבה של מצית כיס. שלב ליטוש זה מונע פגיעה בביציות.
  2. הכינו עבור כל ביצית שתימדד מבחנת Eppendorf של 1.5 ml מלאה ב-1 ml Millipore water. הכינו שלוש צלחות פטרי עם בופר שטיפה נטול Rb+ (למשל PLB) ואחת עם Millipore water.
  3. העבירו חמש ביציות שעברו דגירה מוקדמת בו-זמנית לצלוחית פטרי של 3.5 cm מלאה בבופר של זרם Rb+ (ריכוזים של 0 עד 15 mM Rb+) ודגרו למשך 3 min (עבור Na+,K+-ATPase) או 15 min (עבור H+,K+-ATPase) תחת בקרת טמפרטורה (למשל 21 °C בחדר ממוזג או על פלטת חימום).
  4. העבירו את הביציות בו-זמנית לצלחת הראשונה עם בופר שטיפה נטול Rb+ (במקרה של Na+,K+-ATPase ניתן להשתמש ב-PLB). חובה לשמור על סטיות של פחות מ-5 sec בין זמני הדגירה. שטפו בעדינות.
  5. העבירו את הביציות לצלחת השנייה והשלישית עם בופר שטיפה נטול Rb+, ושטפו בעדינות.
  6. העבירו את הביציות לצלחת עם Millipore water, ושטפו בעדינות.
  7. העבירו כל ביצית בנפרד לאחת ממבחנות ה-Eppendorf שהוכנו והמלאו ב-1 ml Millipore water.
  8. בצעו הומוגניזציה לביצית על ידי שאיבה ושחרור חוזר (pipetting up and down) עם טיפ פפיטה של 200 μl עד שהתמיסה תהיה עכורה באופן הומוגני.

10. הכנת ה-AAnalyst 800 באמצעות מערכת כבש THGA

  1. פתח את השסתום של הגז האינרטי הדרוש (ארגון) והכנס נורת קתודה חלולה מתאימה (נורות HCL של יסוד בודד עבור Li+ או Rb+; Photron, מלבורן, אוסטרליה) במיקום שקע שרירותי.
  2. הפעל את תוכנת הבקרה WinLab32 (של Perkin Elmer) והדלק את נורת הקתודה החלולה המתאימה. נורות קתודה חלולה מסוג Perkin Elmer Lumina מזוהות באופן אוטומטי ומופיעות ברשימת הבחירה. נורות קתודה חלולה שאינן תואמות דורשות הזנה ידנית.
  3. יש להמתין זמן חימום של כ-10–15 דקות כדי לאפשר התייצבות של הנורות.
  4. וודאו כי צינור ה-THGA (צינור אטומיזציה מגרפיט המחומם לרוחבו, Perkin Elmer, #B3000641) תקין באמצעות בדיקה ויזואלית. יש להחליף תנורי THGA בכל 300 מדידות (אורך החיים הממוצע שצוין על ידי היצרן), אך ייתכן שיחזיקו מעמד למספר דגימות גדול יותר.
  5. בחר בטכניקה "THGA furnace" בתוכנת WinLab32.
  6. הכינו לפחות חמישה דגימות כיול עם Rb+/Li+ ריכוזים שבין 10 ל- 50 μg/L (למשל על ידי דילול מתאים מתמיסת RbCl או LiCl בריכוז 1 M) וגשושית אחת ריקה המכילה מים מזוקקים של Millipore בלבד. הערה: המלחים צריכים להיות בדרגת הטוהר הגבוהה ביותר הזמינה ("puriss." או מתוכני כיול זמינים מסחרית למטרות AAS).
  7. בחרו את קובץ האתחול המתאים (המכונה קובץ "שיטה" [method], המספק הפניה לפרמטרי כיול וטוען את הגדרות המכשיר, למשל אורך הגל לגילוי ב-AAS, אורכי הגל עבור Rb+ ו-Li+ (הם 780 ננומטר ו-670.8 ננומטר, בהתאמה), לאחר מכן הזן את המיקומים והריכוזים של דגימות הכיול. לצורך כך, בחר את הדוגם האוטומטי המתאים (מגש דגימות עם 88 או 148 מיקומי דגימה עבור מכשיר ה-AAnalyst 800).
  8. מדידת עקומת כיול.
  9. כעת העבירו כל הומוגנאט של אווציט לכוסות דגימה נפרדות מפוליפרופילן בנפח 1.2 מ"ל (Perkin Elmer, #B0510397) והניחו מבחנות אלו במגש הדגימה האוטומטי (autosampler tray).
  10. צור קובץ מידע לדוגמה לזיהוי הפרובים במיקומי הדוגם האוטומטי, ולאחר מכן התאם את נפח הדגימה ל- 20 μl, והפעל את המכשיר.
  11. לאחר השלמת ההרצה (או במהלך בדיקה חזותית מדי שעה עבור סדרות דגימות ארוכות), יש לבדוק אם קיימות גששים שבהם הכמות הנמדדת של Rb+ עולה על המקסימום של עקומת הכיול. במידה וכן, יש לדלל את הדגימות הרלוונטיות באופן מתאים ולמדוד אותן שוב.

11. הערות למדידת מספר דגימות גדול (מעל 50)

  • להפעלה של המכשיר לאורך הלילה, מומלץ למלא את מאגר הדגימה האוטומטי (autosampler) במים מזוקקים מסוג Millipore כדי למנוע התאיידות של ההומוגנאטים במבחנות הבדיקה.
  • מומלץ להניח מבחנה המכילה 2% HNO3 בין כל 20 דגימות, כדי למנוע סתימה של קפילרת ההזרקה של הדגימה האוטומטית.

פרוטוקול טמפרטורה מומלץ ל-THGA-AAS עבור רובידיום

שלבטמפרטורה (°C)זמן עלייה (sec)זמן השהיה (sec)ספיקת גז ארגון (ml/min)
ייבוש 1110120250
ייבוש 2130530250
פירוליזה300-6001020250
אטומיזציה1700-1800050
ניקוי240012250

פרוטוקול טמפרטורה מומלץ ל-THGA-AAS עבור ליתיום

שלבטמפרטורה (°C)זמן עלייה (שניות)זמן השהייה (שניות)זרימת גז ארגון (ml/min)
ייבוש 1110130250
ייבוש 21301530250
פירוליזה9001020250
אטומיזציה2200050
ניקוי245013250

ניתוח נתונים

  1. עבור כל תנאי מדידה, חשב את ממוצע ספיגת ה-Rb+. הספקטרופוטומטר מסוג AAS מספק ערכים ב-μg/L, אותם יש להמיר ל-pmol/oocyte/min.
  2. עבור ניתוחים קינטיים (ערכי KM גלויים), הפחית את ספיגת ה-Rb+ ברקע, שנקבעה מאוציטות ביקורת שלא הוזרקו מאותה סדרה בריכוז RbCl הנתון.
  3. בצע גרף באמצעות תוכנת Origin, והחל התאמה של פונקציית Hill נוסחת משוואת היל; תרשים קינטיקה ביוכימית; ניתוח זיקה לקשירה; אנזים ומצע. או פונקציית Michaelis-Menten משוואת קינטיקה של אנזימים; נוסחה A = Amax[S]/(K0.5 + [S]); מושג בביוכימיה. לנתונים. במשוואות אלה, [S] הוא ריכוז המצע, nH הוא מקדם היל, ו-K0.5 הוא ריכוז המצע הדרוש להפעלה חצית-מקסיםלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כימות ספיגת Rb+ על ידי P-type ATPases המבצעות countertransport של K+ (או Rb+) על ידי AAS במערכת ביטוי של ציותות Xenopus מאפשר קביעה מהימנה של פרמטרים קינטיים של האנזים.

קביעת הסטוכיומטריה של ההובלה של ה-Na+/K+-ATPase

עבור ה-Na האלקטרוגני+/K+ATPase-, Rb+ ניתן לקבוע שטפי זרם בניסויי clamp-מתח בעלי שתי אלקטרודות, שמטרתם לבחון את המתאם בין הובלת מטען נטו (אינטגרל הזמן של זרם המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת למדידת כמות ה-Rb+ (או Li+) שנלקחה לביציות Xenopus בודדות המבטאות Na+,K+- או H+,K+-ATPase הוכיחה את עצמה כטכניקה רב-תכליתית, גמישה ומדויקת לקביעת הפרמטרים הקינטיים או התרמודינמיים של הובלה עבור ATPases מסוג P נגד קטיון1,4,5,7,8. זוהי אלטרנטיבה בטוחה ואמינה לבדיקות שטף עוקב רדיואקטיבי, ומאפשרת לענות על היקף גדול של שאלות ניסיוניות תוך זמן קצר משמעותית. בהתאם, רק נתונים מוגבלים מאוד נרכשו עם עוקבי רדיו24-27. שיטת A...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לארנסט במברג (מכון מקס פלאנק לביופיזיקה, פרנקפורט, גרמניה) על תמיכתם הנדיבה בשלב הראשוני של פיתוח השיטה, לקזוהירו אבה (אוניברסיטת קיוטו, יפן) על דיונים פוריים רבים ולד"ר מיכאל קוהל (Analytik-Service, וולטרסדורף, גרמניה) על התמיכה הטכנית. המחברים מודים בהכרת תודה למימון של קרן המחקר הגרמנית DFG (אשכול המצוינות "איחוד מושגים בקטליזה"), שמימנה גם את מנגנון Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4.0 חומר תפר Ethicon Vicrylג'ונסון ג'ונסוןV633H
קולגנאז מסוג 1A מ-Clostridium hystolyticumSigma AldrichC9891
ערכת טיהור מוצר PCR טהור גבוהרוש מדע יישומי11732676001
מים ללא נוקלאזאמביוןAM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7Ambion1340, 1344
Ouabain octahydrateSigma AldrichO3125
Tricain (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)Sigma AldrichA5040
מעכב טריפסין מסוג III-O מחלבון ביצת עוףSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800פרקין אלמר0993-5256
WinLab32TMפרקין אלמר
ביופוטומטראפנדורף6131 000.012
נימים בורוסיליקטמוצרי מדעGB150F-8P
צינורות המטוקריט 3.5 אינץ'דראמונד סיינטיפיק3 000-203-G/X
מנורת קתודה חלולה ליתיוםפוטרוןP929LL
מנורת קתודה חלולה RubidiumPhotronP945
חולץ מיקרופיפטה Narishigeדגם PC-10
תא הקלטת ביציות RC-10Warner Instr.W4 64-0306
Nanoject II משאבת הזרקהDrummond Scientific3-000-204
pCLAMP תוכנהמולקולריים
דגימה פוליפרופילן (1.2 מ"ל)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - רכז דגם 5301Eppendorf5301 000.210
צינור THGAPerkin ElmerB3000641
מגבר טורבו TEC-10CXNPI אלקטרוניקהTEC-10CX
מכשירים

מקורות

  1. Tavraz, N. N., et al. Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine. Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).
  2. Castillo, J. P., et al. Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).
  3. Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump. Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).
  4. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase. J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).
  5. Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions. J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).
  6. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes. Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).
  7. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes. PLoS One. 7, e33645(2012).
  8. Tavraz, N. N., et al. Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2. J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).
  9. Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).
  10. Koenderink, J. B., et al. Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation. Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).
  11. Price, E. M. J., Lingrel, B. Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme. Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).
  12. Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).
  13. Lafaire, A. V., Schwarz, W. Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis. J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).
  14. Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature. 450, 1043-1049 (2007).
  15. Toustrup-Jensen, M. S., et al. The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935. J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).
  16. Morth, J. P., et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).
  17. Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).
  18. Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit. J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).
  19. Vedovato, N., Gadsby, D. C. The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions. J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).
  20. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J. Vis. Exp. (16), e758(2008).
  21. Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).
  22. Koenderink, J. B., et al. Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket. J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).
  23. Gottardi, C. J., Caplan, M. J. Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly. J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).
  24. Mathews, P. M., et al. Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase. Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).
  25. Horisberger, J. D., et al. The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps. J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).
  26. Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase. J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).
  27. Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קיבוע מתח בעל שתי אלקטרודותספיגת רובידיוםאטומיזטור גרפיט המחומם לרוחבבקרת פוטנציאל ממбраנהסטוכיומטריה של הובלה
מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.