פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים. מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים. הגישה מציעה ניתוח מעמיק וחסר פניות שיכול לאפשר פיתוח בדיקות אבחון, טיפולים חדשים וקידום ההבנה שלנו של תהליכי מחלה. המגוון הכימי המובנה של המטבולום יוצר אתגרים אנליטיים משמעותיים ואין גישה ניסויית אחת שיכולה לזהות את כל המטבוליטים. בנוסף, השונות הביולוגית בחילוף החומרים האישי והתלות של חילוף החומרים בגורמים סביבתיים מחייבת מספרי מדגם גדולים כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי המתאים הנדרש לפרשנות ביולוגית משמעותית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, מדריך זה מתאר זרימת עבודה אנליטית עבור פרופיל מטבוליט לא ממוקד בקנה מידה גדול של סרום על ידי UPLC-MS. הנוהל כולל הנחיות לארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליט ויאפשר רכישה אמינה של נתונים לניסויים גדולים ויספק נקודת התחלה למעבדות חדשות לפרופיל מטבוליטים לא ממוקד על ידי UPLC-MS.
מבוא
המונח "מטבולומיקה" יכול להקיף דברים רבים. לדוגמה, ניתן לבצע ניסוי מטבולומי באמצעות מגוון פלטפורמות אנליטיות כגון NMR וכרומטוגרפיה של גז ו/או נוזל יחד עם ספקטרומטריית מסה. יתר על כן, ניסויים מטבולומיים יכולים להתבצע בצורה ממוקדת או לא ממוקדת, או שילוב של שניהם. ניסוי מטבולומיקה ממוקד יכלול ניתוח מכוון של פאנל של מולקולות החשובות לשאלה הביולוגית העומדת על הפרק (למשל, מולקולות קטנות המעורבות במחזור TCA יאפשרו כימות מדויק של מסלול זה). במצב זה, ההשערה הביולוגית מכתיבה את בחירת המטבוליטים שימוקדו בניתוח והשלבים האנליטיים מותאמים לזיהוי מולקולות אלה. לחלופין, ניסוי מטבולומיקה לא ממוקד מייצר השערות. במקרה זה, הניסוי מבוצע בצורה רחבה ובלתי מוטה כדי לאפשר גילוי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ארגון לדוגמה
- כדי ליצור מפת צלחות להכנת דוגמה בגיליון אלקטרוני, בעמודה הראשונה הזן רשימה לדוגמה לפי סדר הטעינה. בעמודה שנייה הזן את מיקומי 96 לוחות הבאר באמצעות המינוח הנכון עבור תוכנת הדגימה האוטומטית שלך.
- שמור באר אחת בכל צלחת לדגימות QC.
- אם הדגימה האוטומטית של LC שלך יכולה להתמודד עם שתי צלחות בו זמנית, הפרד את רשימת הדוגמאות לקבוצות של 190 ושמור מידע זה בגליון עבודה שני.
- בתוך כל אחת מהקבוצות הללו, השתמש בפונקציה האקראית [note: "=rand()"ב- Excel] כדי לסדר את סדר ההזרקה באופן אקראי. כעת העתק והדבק את הזמנת ההזרקה שלך במערכת התוכנה לתור לדוגמה LC-MS. אקראיות צריכה להתרחש בין קבוצות, בתוך אצוות, ולהיות ייחודית על פני שכפולי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השלבים האנליטיים הבסיסיים של ניסוי לפרופיל מטבוליים לא מכוון באמצעות UPLC-MS מפורטים באיור 1. ניתן להציג את הנתונים הגולמיים עבור כל דגימה ככרומטוגרמה של שיא הבסיס (base peak chromatogram). איור 2 מציג דוגמה לכרומטוגרמה של שיא הבסיס של דגימת סרום שננתחה באמצעות אפשרות הגרדיאנט (a) במדריך. בעקבות הניתוח הסטטיסטי שתואר לעיל, מבוצע ניסיון לזיהוי מטבוליטים עבור כל המאפיינים המולקולריים המובהקים סטטיסטית. זיהוי בביטחון גבוה (רמה 1) דורש התאמה של זמן השהייה כרומטוגרפי, מסה מדויקת ותבנית פרגמנט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מדריך זה נועד לשמש כנקודת התחלה לביצוע פרופיל מטבוליט לא ממוקד בקנה מידה גדול על ידי UPLC-MS. זרימת העבודה מתמקדת במטבוליטים שניתן לחלץ עם ממס מתנול מימי, לשמור על עמודת UPLC C8 או C18, ולזהות אותם כיונים חיוביים. במצב בו אין הטיה קבועה מראש לכיוון מחלקת מטבוליט ספציפית ורצוי השערה היוצרת פרופיל גלובלי, פרוטוקול זה הוא בעל ערך מכיוון שהוא יביא לזיהוי של אחוז גדול של מטבוליטים בסרום ממגוון מחלקות כימיות (כלומר תרכובות קוטביות בינוניות עד לא קוטביות). אם התקציב והזמן מאפשרים, ניתן להרחיב בקלות את כיסוי המטבוליטים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
ההדרכה המוצגת בוצעה ופותחה במתקן הפרוטאומיקה והמטבולומיקה באוניברסיטת קולורדו סטייט, הממומן בחלקו על ידי משאבי מינהל המחקר של CSU לפרויקטים אקדמיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 96 צלחות באר - 500 μ l בארות | VWR | 40002-020 | אלה משמשים להכנת מדגם |
| 96 מחצלות צלחות באר | VWR | 89026-514 | אלה משמשים להכנת מדגם |
| 96 צלחות באר - 350 μ l בארות | תאגיד ווטרס | WAT058943 | אלה משמשים להזרקת דגימה |
| 96 שטיחי צלחת באר | תאגיד ווטרס | 186000857 | אלה משמשים להזרקת דגימה |
| אטמי חום 96 בארות | תאגיד ווטרס | 186002789 | אלה יכולים לשמש להזרקת דגימה או לאחסון לטווח ארוך |
| אוטם חום צלחת 96 באר | תאגיד ווטרס 186002786 | ||
| מתנול בדרגת LC-MS | Fluka | 34966 | |
| אצטוניטריל בדרגת LC-MS | Fluka | 34967 | |
| LC-MS כיתה aater | Fluka | 39253 | |
| חומצה פורמית בדרגת LC-MS | Fluka | 56302 | |
| פיפטור אלקטרוני רב ערוצי | VWR | 89000-674 | |
| קצות פיפט | Eclipse (נרכש דרך Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| צנטריפוגה מצוננת - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - צור קשר עם Beckman Coulter | |
| Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System | Waters Corporation | N/A - צור קשר עם Waters Corporation | |
| UPLC C8 column (אפשרות שיפוע a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| UplC T3 column (אפשרות שיפוע b) | Waters תאגיד | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF ספקטרומטר מסה | תאגיד ווטרס | N/A - צור קשר עם תאגיד |
מקורות
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
