מאמר שיטה

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות

DOI:

10.3791/50251

⸱

20 במרץ 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעקב של תאים באמצעות MRI זכה לתשומת לב ראויה לציון בשנים האחרונות. פרוטוקול זה מתאר את התיוג של תאים דנדריטים עם פלואור ( 19 חלקיקי F) עשירים, ביישום vivo של תאים אלה, וניטור היקף הגירתם לימפה עם הניקוז 19 F / 1 H-MRI ו 19 F גברת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות רציפה בשיטות הדמיה בלתי פולשניות כגון הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) השתפרה מאוד היכולת שלנו ללמוד תהליכים פיסיולוגיים או פתולוגי ביצורי חיים. MRI גם הוא להוכיח להיות כלי רב ערך עבור לכידת תאים מושתלים בגוף חי. אסטרטגיות תיוג תא ראשוניות לשימוש שנעשה MRI של סוכנים בניגוד המשפיעים על זמני ההרפיה MR (T1, T2, T2 *) ולהוביל לשיפור (T1) או דלדול (T2 *) של אות שבו תאים שכותרתו הם הווה. T2 * סוכני שיפור כגון סוכני תחמוצת ברזל (ultrasmall USPIO) להיות מועסקים ללמוד נדידת תאים וחלקם גם אושרו על ידי ה-FDA ליישום קליני. חסרון של T2 * סוכנים הוא הקושי להבחין הכחדת האות שנוצרה על ידי התאים שכותרתו מחפצים אחרים, כגון קרישי דם, מדמם מיקרו או בועות אוויר. במאמר זה, אנו מתארים טכניקה המתעוררות לתאי מעקב in vivo כיהוא מבוסס על סימון התאים עם פלואור (19 F) עשירים בחלקיקים. חלקיקים אלה הוכנו על ידי emulsifying perfluorocarbon (PFC) ולאחר מכן תרכובות המשמשים לתאי תווית, אשר לאחר מכן ניתן הדמיה על ידי 19 F-MRI. יתרונות חשובים של PFCs למעקב אחר תאי in vivo כולל (ט) היעדרות של פחמן בכריכת 19 F in vivo, אשר לאחר מכן מניב תמונות ללא רקע ולהשלים תא selectivityand (ii) את האפשרות לכמת את אות התא על ידי 19 F MR ספקטרוסקופיה .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעקב של תאי in vivo הוא היבט חיוני בכמה תחומים של ביו. לשם כך, שיטות הדמיה בלתי פולשניות באופן סלקטיבי יכול למקם תאים על פני תקופה של זמן הן יקרים מאוד. לפני הפיתוח תלת ממדי התהודה מגנטית (MRI), המעקב של נדידת תאים החיסונית היה מוגבל לניתוחים מיקרוסקופים או ביופסיות רקמות. מעקב סלולרי בעזרת MRI זכה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות, לא רק לאימונולוגים לימוד התנהגות תא חיסון in vivo, אלא גם לחוקרי תאי גזע וקליניים. במהלך אמצע שנתי ה -90, המחקרים הראשונים על חלקיקי תחמוצת ברזל 1 יזם מפל של התפתחויות לתאי מעקב עם MRI. חלקיקי תחמוצת ברזל לקצר את זמן הרגיעה MR (T2 *) של התאים שכותרתו ובכך לגרום לדלדול באות תמונות MR. חלקיקי תחמוצת ברזל להיות מועסקים לתווית מקרופאגים 2, עמ 'oligodendrocyterogenitors 3 והרבה סוגי תאים אחרים. חלק מחלקיקים אלה גם אושרו קליני על ידי ה-FDA לתיוג חיסונים הסלולר בחולים מלנומה 4. מאז in vivo או תיוג vivo לשעבר של תאים עם חלקיקי תחמוצת ברזל מסתמך על קיצור של האות * T2 וזה אחרון יכול להיות גם הביא על ידי הבקשורות לרגישות T2 * השפעת vivo כגון דימומי מיקרו, מרבצי ברזל או בועות אוויר, זה עלול להיות קשה לזהות תאים שכותרתו in vivo מהרקע אחר T2 * הכחדות אות 5.

במאמר זה, אנו מתארים טכניקה למעקב אחר תאים דנדריטים (DC) in vivo על ידי העסקת נ 19/1 דימות בתהודה מגנטית H (MRI). טכנולוגיית מעקב תא זה הוצגה רק בשנת 2005 6, כמה שנים אחרי שכבר דווחו היישומים הוכרו לראשונה ל19 F-MRI ב7. אדוה אחד חשובntage של 19 F מעל תיוג תא חלקיקי תחמוצת ברזל הוא התופעה הביולוגית הנמוכה של 19 F ברקמה, זה מאפשר לעקוב אחר תאים באופן סלקטיבי מאוד עם תמונות בעצם ללא רקע. יתר על כן, זה אפשרי לכיסוי אות נ 19 MR מהתאים המושתלים שכותרתו עם תמונות אנטומיות המתקבלות מהקונבנציונלי 1H-MRI. נ 19/1 H-MRI הוא אפוא רלוונטי במידה ניכרת למחקרים חוקרים נדידת תאים בגוף חי. תאים שנבדקו בשיטה זו מסומנים עם 19 חלקיקים ה-F-עשירים. perfluorocarbons סינטטי הנגזר (PFCs) עיקרם פחמן ואטומי פלואור משמש בדרך כלל כדי להכין את החלקיקים. תרכובות אלה הן מסיסים במים וצריכים להיות emulsified לפני היישום במבחנה או בגוף חי. גודל חלקיקי PFC הרגיל שהועסקו על ידי קבוצות אחרות לin vivo 19 ניסויי מעקב ה-F-MRIנע בין 100 ננומטר ו 245 ננומטר 6,8-10. עם זאת יש לנו הראינו כי היעילות בתיוג תאים דנדריטים עם עליות חלקיקי perfluoro-15-כתר-5-אתר (PFCE) עם חלקיקים בגודל הולך וגדל (> 560 ננומטר). 11

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלי כל החיה חייבים להיות מאושרים על ידי ועדת רווחת בעלי החיים המוסדית המקומית לפני ההוצאה להורג. במהלך מדידות MR רמה נאותה של הרדמה וניטור פיסיולוגי (טמפרטורת גוף, קצב נשימה) הן דרישות הכרחיות.

1. דור של עכבר מח עצם שמקורם בתאים דנדריטים

  1. לחלץ תאי מח עצם מעכברי C57BL / 6 כפי שתוארו לעיל 12. פרוטוקול זה שתחילתה עד 1992 13 ותואר לראשונה על ידי הקבוצה של ראלף מ 'שטיינמן (1943-2011), שגילה את התאים דנדריטים 14.
  2. בקצרה, לחלץ עצמות שוק זמן קצר לאחר הקרבת עכברים. עבודה מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית (על מנת למנוע זיהום חיידקים), שטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי קטנה עם מדיום לשטוף (5% FBS, HEPES 1% פניצילין / סטרפטומיצין ושל 1% בRPMI) 12.
  3. מעבירים את ההשעיה התא דרך Stra תאINER (100 מיקרומטר גודל רשת, ניילון) לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל על מנת להסיר שאריות עצם ורקמות. לאחר כמה צעדים לשטוף ו12 צעד תמוגה, לספור את תאי קיימא באמצעות trypan הכחול וhemocytometer.
  4. תאי מח עצם Resuspend בריכוז של 400,000 תאי מ"ל -1 במדיום התרבות (RPMI בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, HEPES ו 1% L-גלוטמין 1%) המכילים 75 ng מ"ל -1 של granulocyte העכבר גורם מגרה מקרופאג'ים מושבה (MGM-CSF) המתקבל supernatants של תאי HEK 293FT transfected עם GMCSF עכבר פלסמיד. העבר את 10 מ"ל של השעיה תא (4 x 10 6 תאים) בצלחות פטרי (מ"מ x 20 מ"מ 100) ו דגירה בCO 2 באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). ביום 3, לחדש את המדיום ישן עם 10 מיליליטר מדיום חדש (שמירה על ריכוז סוף MGM-CSF ב75 ng מיליליטר -1). ביום 6, להסיר 10 מ"ל של מדיום ישן ולחדשעם מדיום טרי 10 מ"ל (ריכוז סוף MGM-CSF = 75 ng מיליליטר -1). ביום 8, להסיר 10 מ"ל של מדיום ישן ולחדש עם מדיום חדש 10 מ"ל (ריכוז סוף MGM-CSF = 150 מיליליטר ng -1).
  5. ביום 10, בוגרת DC הבדיל עם מיקרוגרם lipopolysaccharide -1 1 מ"ל (LPS) למשך 24 שעות.

2. תיוג של תאי דנדריטים עם 19 חלקיקים ה-F-עשירים

  1. במהלך שלב התבגרות 24 שעות (1.5), תווית DC עם 1 מ"מ פלואור עשיר perfluoro-15-כתר-5-אתר (PFCE) חלקיקים (500-560 ננומטר) גם למשך 24 שעות. הכן את חלקיקי פלואור שכותרתו גדולים על ידי emulsifying PFCE בPluronic ה-F-68 (סה"כ נפח 2.5 מ"ל) באמצעות טיטניום sonotrode תא לשבש והעסקת תכנית דופק רציפה (משרעת 100%, כוח = 250 וואט) למשך 60 שניות.
  2. ביצוע שלבי הדגירה לעיל, למסוק DC הבוגר ופלואור שכותרתו באמצעות תרבית רקמת תא מגרד, להעביר לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ו צנטריפוגותב500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. כדי לשטוף את כל חלקיקים ושאריות תאים מתים, להשאיר את תאים שנקטפו לדבוק במנות פולי-L-ליזין. כדי להתכונן לצעד הזה, מנות מעיל פטרי עם פולי-L-ליזין (1 מ"ג מיליליטר -1) על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לאחר מכן לשטוף את מאוגדות פולי-L-ליזין עם PBS.
  4. דגירה מעל תאים שנקטפו על הצלחות פולי-L-ליזין המצופים במדיום סרום ללא ולאפשר לתאים לדבוק (שעת 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  5. לשטוף את המדיום להשליך תאים שאינם חסיד, חלקיקים הנותרים ותאים מתים ולשטוף שלוש פעמים עם מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS.
  6. קציר תאים חסיד ידי טריפסין-EDTA טיפול (0.25% טריפסין-EDTA, דגירה 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס).
  7. בעקבות צעד צנטריפוגה לשטוף אחר, resuspend את הכמות הנדרשת של DC הבוגר בסרום ללא סטרילי PBS.
  8. כדי לקבוע אם התאים סומנו בתווית בהצלחה, מומלץ לבדוק את physicocheמאפייני יכל של התאים באמצעות cytometry הזרימה (FACS). פיזור הצידה (SSC) צריך לחשוף גרעיניות מוגברת בתאים אלה, כפי שתואר לעיל 11. זה צריך להישמר גם לזכור כי fibroblasts עלול לזהם את תרבויות DC וגם יכול לקחת עד 19 החלקיקים F במקביל. לכן טוהר DC יש לבחון (על ידי מדידת אחוז CD11c + CD11b + התאים באמצעות FACS) לפני ביישום vivo.

3. ביישום Vivo של 19 תאי דנדריטים F-שכותרתו

  1. לנהל DC (יוני 10 - יולי 10) בנפח של 50 - 100 μl intracutaneously לתוך הגפיים האחוריות של עכבר C57BL / 6 על ידי מיקום העכבר בבעל והחדרת מחט G 26 וחצי בזהירות לתוך השכבות העליונות של העור לפני היישום (שימוש 0.5 מ"ל מזרקים טוברקולין באופן קבוע עם מחטים-מצורפות כדי למזער את הנפח מת). על מנת להבטיחהיישום המתאים intracutaneous n, חשוב שהכניס חלק מהמחט באופן חלקי גלוי מתחת לעור. אם המחט אינה גלויה יותר, המחט הוכנסה עמוקה מדי לתוך שכבות העור. עבור פרט בלתי מנוסה, יישום intracutaneous יכול להיות מבוצע בהרדמה.
  2. תמונת הגפיים על ידי בפלואור vivo (19 F) / פרוטון (1 H) MRI (ראה הסעיף הבא) הזרקת 21 שעות הבאות.

4. In Vivo נ 19/1 הדמיית תהודה מגנטית H

את ההוראות המפורטות להקמת סריקות MR מתייחסות לסורק Bruker MR באמצעות שלט תוכנת Paravison (גרסה 5.1). שמות המתייחסים לספציפיות לספק פונקציות ופריטים היו מסומנים באותיות נטויות. עבור סורקי MR אחרים השלבים הבאים עשויים להיות מותאמים לפי ההנחיות של היצרנים.

  1. סדר גישה לייעודיקטן סורק MR בעלי חיים. לקבלת איכות תמונה מספקת, מערכת עם כוח שדה מגנטי של 9.4 טסלה או יותר וסלילים מותאמים לתדרי רדיו (למשל 1 H / F 19 סליל כפול מתכונן נפח RF, קוטר פנימי 35 מ"מ, אורך 50 מ"מ; ראפיד ביומד, וורצבורג, גרמניה) מומלצות.
  2. לפני MRI, להכין תוכנית ההתקנה של סורק ה-MRI להרדמה וניטור פיסיולוגי. ודא שמסכת הנשימה של המיטה / בעל החיים מחוברת למערכת isoflurane וכי הבדיקה הטמפרטורה וכרית נשימה מחוברות למערכת ניטור חיה מרחוק (למשל דגם 1025, SA מכשירים בע"מ, ניו יורק, ארצות הברית). האחרונים משמש כדי לפקח על פרמטרים של בעלי החיים החיוניים כגון טמפרטורת גוף ונשימה.
  3. הרדימי עכברים על ידי הרדמת משאיפת באמצעות תא עכבר מחובר למערכת isoflurane. התאם את קצב זרימת אוויר ולO 2 ב 0.2 דקות L -1 ו -0.1 ל -1 דקות, בהתאמהוהוא הגיע 3% isoflurane (מנוכה ממאדה) לכ -2 דקות עד לרמה הנדרשת של הרדמה (ללא קמצוץ הבוהן הבא תגובה). ספיקות אופטימליות עשויות להשתנות בהתאם להגדרה שבשימוש. להיות מודע לכך שספיקות גבוהות עלולות לגרום להתייבשות. ניטור קפדני של תנאיהם של בעלי החיים נדרש בכל העת כאמור לעיל.
  4. מקם את העכבר שרועה על המיטה / בעל של העכבר הקטן החיה MR הסורק (איור 1).
  5. תוך שמירה על קצב הזרימה מתמיד לאוויר וO 2, להתאים אידוי isoflurane ל 0.8 - 1.5% עד שיגיע לדפוס נשימה אופטימלי. קצב נשימה של 50 - 70 נשימות לדקה מומלץ.
  6. שמור על טמפרטורת הגוף על 36-37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי על ידי שימוש במערכת זרימת מים חמים (או לחלופין אוויר חם).
  7. שמור על העיניים לחות עכבר עם משחת סיכה העין סטרילי במהלך המדידה.
  8. לאחר הבטחת בעלי החייםעל בעל ההדמיה ואת החיבורים למערכת הניטור, הזז את בעל למרכז של H 1/19 F סליל RF (שממוקם בisocenter של מגנט סורק בעלי החיים).
  9. להגדיר את המיקום של העכבר כך שהברך נמצאת בתוך isocenter של המגנט, או עם שיטה אוטומטית (למשל באמצעות לייזר מיצוב בשילוב עם בעל חיים מונע במנוע) או באופן ידני על ידי חישוב מרחק בעל צריך להתרגש למגנט להגיע isocenter.
  10. למאשר את המיקום הנכון של בעלי החיים בסורק ובהמשך התכנון של הגיאומטריה פרוסה התמונה (כלומר גודל, מיקום וסיבוב במרחב), לרכוש תמונות לסייר בשלוש האוריינטציות סטנדרטיות (צירי, העטרה, sagittal) באמצעות תמונה ברזולוציה נמוכה ומהירה שיטות רכישה (למשל TriPilot פרוטוקול, אשר משתמש ברצף דופק פלאש).
  11. לכוון את סליל RF לתדר התהודה H 1 (לדוגמה. MHz עבור 9.4 T 400.1) ולתדר התהודה 19 F (למשל 376.3 MHz עבור 9.4 T) ולהתאים את העכבה האופיינית של הסליל עד 50 אוהם משתמשים בצג הכוונון של סורק MRI של בעלי החיים. כוונון והתאמה הוא הכרחי כדי להשיג את התנאים האופטימליים לשידור וקליטת אות.
  12. בצע את הגדרות המערכת האוטומטיות הנדרשים לרבות shimming כדי לכוונן את ההומוגניות של השדה המגנטי (למשל ADJ_SHIM), התאמות תדר מערכת כדי לכוון את תדר RF לLamor של העכבר (למשל ADJ_SF) ורווח התייחסות להתאים את המשרעת RF ( למשל ADJ_REFG). כל ההגדרות האלה חשובים להפוך שדות סטטיים והמגנטיות משתנים (B 0, 1 ב ') באזור של עניין כהומוגנית ככל האפשר.
  13. לרכוש סט שני של תמונות הסקאוט (כאמור לעיל), יחד שלושת הכיוונים מאונך, לאחר שהתאים את שדה ראייה (FOV), כך ששני גפיים התחתונים ARדואר גלוי מאגן ועד כף רגל (= LxWxH 50x25x25 מ"מ). תמונות אלה ישמשו לתכנן את האוריינטציות של H 1/19 סריקות הסופיות F 3D.
  14. הגדר את פרוטוקול TurboRARE 3D עבור H-סריקת 1: TR / TE = 1500/53 אלפיות השנייה, FOV = 50x25x25 מ"מ, מטריקס = 400x200x200 פקטור, נדיר = 16 (. כ זמן סריקה 60 דקות). התאם FOV בעזרת דימויי סקאוט, להתחיל בסריקה (רמזור).
  15. טען דופק יחיד FID-רצף עם TR של לפחות 1,000 אלפיות שנייה. פתח סריקה לערוך ולהגדיר גרעין ל19 פ השתמש בהגדרות ידניות על ידי ביטול הבחירה ברווח רווח ההפניה האוטומטי בשיטת עריכה של ארגז הכלים.
  16. התחל מדידה ללא הקלטת נתונים כדי להציג אות MR בזמן אמת באמצעות GSP (ללכת התקנה). אם אות הרפאים 19 F בתוך חלון הרכישה היא נמוכה מדי, להוסיף עוד ממוצעים בשיטת עריכה ו / או לווסת מחליש הדופק (TX0 או מחוון SP0) עד סיgnal נראה בבירור. התאם את התדר הבסיסי כדי למרכז את שיא הרפאים 19 F ב 0 הרץ בחלון הרכישה. החל תדר בסיסי ועצירת עיתונות. שים לב שisoflurane משמש כהרדמה עלול ליצור אות רקע. ב9.4 טסלה MRI השינוי הכימי בין החלקיקים המכילים 19-F ואת isoflurane הוא כ 1,800 הרץ. ודא שרוחב פס העירור הוא קטן יותר מאשר 3,600 הרץ, כדי למנוע יחד isoflurane המרגש עם 19 תאים או חלקיקי ה-F-שכותרתו. התדר הבסיסי צריך להיות מוגדר בצורה נכונה על האות שנוצרה על ידי תאי ה-F-19 שכותרתו. לחלופין, שיטה אחרת של הרדמה יכולה לשמש כניסוי ראות עיניו.
  17. שיבוט (לשכפל) פרוטוקול TurboRARE 3D מהקודם H סריקת 1. ללכת כדי לערוך את השיטה ובטל את רווח ההפניה האוטומטי (כאמור לעיל). הגדרת גרעין נ 19 מעריכת סריקה. שנה את המטריצה ​​ל128x64x64ונדיר פקטור ללפחות 40 (עד 64). לTR / TE 1000/6 אלפיות שני ו64 ממוצעים, זמן הסריקה הוא כ -70 דקות. קבע את הרווח למקלט 101 (ארגז כלים) ולהתחיל את הסריקה ללא כל התאמות נוספות באמצעות הרפובליקנים (ללכת צינור).
  18. כאשר הסריקות שתסיים לחזור בעל העכבר מהסורק MRI. נתק את העכבר בזהירות מהמחזיק. אם העכבר לא הקריב לניתוח vivo לשעבר (למשל היסטולוגיה או ספקטרוסקופיה, ראה להלן) ישירות לאחר מדידות MR, לעקוב מקרוב עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. ויסות טמפרטורת גוף מושפעת מההרדמה, ולכן במהלך תהליך ההחלמה, לשים את העכבר בכלוב נפרד הממוקם על משטח טמפרטורה מוסדר חם. ברגע שהעכבר התאושש לגמרי מהרדמה, להחזיר אותו לכלוב והחזקתה לחדר של בעלי החיים.
  19. כדי כיסוי את תמונות 19 F עד 1 H תמונות, השתמש בתפריט הצג option על אותה התוכנה (Paravison). ניתן למצוא את הפונקציה ביסוד תחת מיתאם. שמור ביסוד, לטעון את התמונה החדשה ולסמן את שכבת F 19 על ידי הגדרת צבע חדש מלהסתכל למעלה טבלה. להפלות בין 19 F ו 1 H הסריקות, לשנות את הסף לצבע הנבחר (לחתוך תראה את שולחן), כך שאות F 19 תהיה הצבע הנבחר ואת תמונת רקע 1 H יישאר בגוונים אפור. תוכניות עיבוד פוסט אחרות (למשל ImageJ) זמינות כדי ליצור את / 19 שכבות של תמונות F H 1.
  20. צריך בכימות vivo של אות F 19 שיהיו צורך, בצע את פרוטוקול הכמותי פשוטה כפי שתואר לעיל 15,16. בקיצור, כימות יכול להיעשות על ידי הנחת צינור התייחסות עם ריכוז ידוע של PFCE אמולסיה בתוך FOV ליד העכבר. לאחר שרכש את תמונות MR, קוואןתצדיק את העוצמות של אותות 19 F באמצעות אזור של ריבית ניתוח (ROI) ולהשוות בעקומת כיול חוץ גופית כפי שמוצג באיור 2.

5. ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית לימפה צומת (MRS)

  1. לאחר להקריב את העכבר, להסיר את הבלוטות לימפה popliteal ומקום בצינור תמ"ג 5 מ"מ קטן ולהוסיף 100 μl של 2% PFA.
  2. התקן 19 סליל ספקטרוסקופיה F (למשל סליל טבעתי) שבו יש פתיחה של לפחות 5 מ"מ להחזקת צינור NMR המכיל בלוטות לימפה.
  3. מניחים את צינור התמ"ג בתוך הסליל ולהזיז את הסליל לisocenter של המגנט.
  4. לכוון את סליל RF לתדר התהודה F 19 (לדוגמא 376.3 MHz עבור 9.4 T) ולהתאים את העכבה האופיינית של הסליל עד 50 אוהם משתמשים בצג הכוונון של סורק MRI של בעלי החיים. כוונון והתאמה הוא הכרחי כדי להשיג את התנאים האופטימליים לשידור ואותקבלת הפנים.
  5. להגדיר את כל הפרמטרים שים בתוך ארגז הכלים shimming ל0 ולחץ על להחיל. בדרך כלל זה לא הכרחי ליישם שיטות shimming מאז היקף המדגם קטן יחסית. אם אות F 19 מספיק זמינה, בשיטות אוטומטיות עשויות להיות מיושמת לshimming, תדירות מערכת ועלייה במקלט, כמתואר לעיל.
  6. טען רצף FID דופק יחיד עם TR של לפחות 1,000 אלפיות שנייה. פתח ערוך סריקה ולהגדיר את הגרעין ל19 פ השתמש בהגדרות ידניות על ידי ביטול הבחירה ברווח רווח ההפניה האוטומטי בשיטת עריכה של ארגז הכלים. הגדר את מספר הממוצע ל -1.
  7. התחל את הרצף באמצעות GSP. אם אות הרפאים 19 F בתוך חלון הרכישה היא נמוכה מדי, להוסיף עוד ממוצעים בשיטת עריכה ו / או לווסת מחליש הדופק (TX0 או מחוון SP0) עד אות נראה בבירור. התאם את התדר הבסיסי, כך שSPE F 19שיא ctral הוא במרכזו של החלון ברכישה 0 הרץ ולהחיל את תדר בסיסי. התאם מחליש הדופק שוב כדי למקסם את האות, כדי להגיע לעירור של 90 מעלות. כאשר אות היא בעצור לחצו מרבי.
  8. הגדר את הממוצעים בשיטת עריכה שבין 64 ו 256 (או יותר במידת צורך, בהתאם לאות) ולהתחיל את הרכישה באמצעות הרפובליקנים. אות המזוהה בקורלציה ליניארית עם מספר הממוצעים. במהלך כימות יש לזכור כי האות זוהתה צריכה להיות מנורמלות ממוצע אחת. יתר על כן, רמת ריכוז ידוע או עקומת כיול כיול יש צורך לחשב את מספר תאים מאת אות F 19 המנורמלת (איור 2).
  9. לאחר הסריקה הוא סיים, הסר את המדגם, הנח את הדוגמא הבאה ולהמשיך בשלב 5.3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שמונה עשר לעשרים ואחת שעות לאחר יישום intracutaneous, 19 תאים דנדריטים F-שכותרתו (DC) להעביר לימפה popliteal ניקוז. התנועה של DC דרך הצינורות הלימפה לבלוטה לימפה politeal ניקוז יכולה להיות מוערכת על ידי כיסה את התמונות אנטומיות H 1 עם 19 תמונות DC F (איור 2 א). יש לנו דיווח בעבר על ההגירה של תאים אלה in vivo, כמו גם את ההשפעה של גודל ה-F-19 חלקיק על DC Immunobiology, כולל יעילות ספיגת 11. על מנת לכמת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו של העסקת נ 19/1 H MRI כדי לעקוב אחר התנועה של DC לימפה נותנת את ההזדמנות ללמוד את דפוסי הנדידה של תאי מערכת חיסון בגוף חי. תאים הדנדריטים הם דוגמאות מצוינות של מהירות העברת תאים חיסוניים כי הם מסוגלים לתמרן דרך מבנים תלת ממדיים ללא חוזקה הקפדה על מצעים ספציפיים 17. למרות שהרזולוציה מרחבית הנמוכה (טווח מיקרומטר) של הטכניקה המתוארת היא לא ניתן להשוות ברזולוציה הגבוהה (טווח ננומטר) שניתן להשיג עם מיקרוסקופיה multiphoton, עם טכניקה זו עדיין אפשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה לSW (DFG WA 2804) ומענק לאוניברסיטת SW מהמרכז למחקר הניסויי וקליני, שיתוף פעולה של מקס Delbrück מרכז לרפואה מולקולרית ופקולטה לרפואת Charité בברלין. היו הממנים שום תפקיד בתכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנה של כתב היד. אנו מודים למר רוברט Westphal לקבלת תמיכה טכנית בתקופת ההתמחות שלו במעבדה שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
C57BL/6 עכבריםצ'ארלס ריבר, ברלין
RPMIGibco21875-091
FBS SuperiorBiochrom AGS 0615
HEPESGibco-Invitrogen15630-056
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
L-גלוטמיןGibco25030-024
Dulbecco's PBSSigma AldrichD8662
PFASanta Cruzsc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur391-1996
Pluronic F-68 Sigma AldrichP5556
צלחות פטרי (35 x 10 מ"מ)VWR, גרמניה391-1996
27 ו-frac12; מזרקי GVWR, גרמניה612-0151
מסנני תאי ניילון (100 μ m mesh) VWR, גרמניה734-0004
צינורות NMR VWR, גרמניה634-0461
<חזק>ציוד
>כלי דיסקציהFST
CO2 חממה קלסר
מערכת MR לבעלי חיים קטניםBruker Biospin9.4T BioSpec 94/20 USR, תוכנת רכישה ועיבוד ParaVision
1H/19F סליל RF בנפח כפול מתכוונן Rapid Biomed, Wü rzburg, גרמניהקוטר פנימי 35 מ"מ, אורך 50 מ"מ
19F סליל ספקטרוסקופיה סליללולאת כוונון/התאמה פנימית, 4 סיבובים, קוטר פנימי 5 מ"מ, אורך 10 מ"מ, שני קבלים לכוונון והתאמה
hr Medical Instruments GmbH
מערכת ניטור בעלי חיים דגם 1025SA Instruments Inc., ניו יורק, ארה"ב
של מערכת אינהלציה איזופלורן Fö

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
  3. Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
  4. de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  5. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
  6. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
  7. Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
  8. Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
  9. Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
  10. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
  11. Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981(2011).
  12. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773(2008).
  13. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  14. Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
  15. Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
  16. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
  17. Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  18. Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
  19. Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
  20. Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
  21. Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
  22. Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
  23. Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).
  24. Haacke, E. M. Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , John Wiley & Sons. (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MRIMRIMR

מאמרים קשורים