הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופיה Immunoelectron היא כלי רב עצמה כדי לחקור מולקולות ביולוגיות ברמת subcellular. נוגדנים מצמידים את סמני אלקטרונים צפופים כגון זהב colloidal יכולים לחשוף את הלוקליזציה וההפצה של אנטיגנים ספציפיים ברקמות שונות 1. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר הן-הטבעה של לפני או אחרי הטבעת טכניקות. במיקרוסקופיה טכניקות הטבעה מראש immunogold אלקטרונים (EM), הרקמה יש permeabilized כדי לאפשר חדיר נוגדן לפני שהוא משובץ. טכניקות אלה הן אידיאליות לשימור מבנים, אך חדירה נמוכה של הנוגדנים (לעתים קרובות רק כמה מיקרומטרים 1) היא חסרון ניכר 2. שיטות התיוג לאחר ההטבעה יכולות להימנע מבעיה זו, כי התיוג מתרחש בחלקים של רקמות קבועות בי אנטיגנים הם יותר נגישה בקלות. במהלך השנים מספר השינויים שפרו את השיטות שלאחר ההטבעה כדי לשפר immunoreactivity ולשמר ultrastructure קיבעון רקמה הוא חלק חיוני של לימודיהם. Fixatives כימי Crosslink מקרומולקולות לנעול את מבני רקמות במקום. הבחירה מקבעת משפיעה לא רק על שימור מבנים, אלא גם antigenicity וניגוד. tetroxide אוסמיום (אוסו 4), פורמלדהיד, וglutaraldehyde כבר את fixatives הרגיל במשך עשרות שנים, כוללים למערכת עצבים מרכזיות (CNS) רקמות הנוטות במיוחד לניזק מבני במהלך עיבוד כימי ופיזי. למרבה הצער, אוסו 4 הוא מאוד תגובתי והוכח כדי להסוות אנטיגנים 6, וכתוצאה מהתיוג גרוע ובלתי מספק. גישות חלופיות כדי למנוע קיבוע כימי כוללות הקפאת הרקמות. אבל טכניקות אלה הן קשות לביצוע ודורש מכשור יקר. כדי לענות על חלק מהבעיות הללו ולשפר את תיוג רקמות מערכת עצבים מרכזיים, Phend et al. החליף Oso 4 עם תצטט uranyl (UA) וACI טאניד (ת"א), והציג שינויים נוספים בהצלחה כדי לשפר את הרגישות של זיהוי אנטיגן ושימור מבנים במוח וברקמות בעמוד שדרת 7. אנחנו אמצנו שיטת אוסמיום זה ללא לאחר ההטבעה לרקמת מוח חולדה ואופטימיזציה טכניקת התיוג immunogold לזהות וללמוד חלבונים סינפטיים.
אנו מציגים כאן שיטה כדי לקבוע את הלוקליזציה של חלבונים סינפטיים ultrastructural בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה. אנו משתמשים בפרוסות תרבית היפוקמפוס organotypic. פרוסות אלה לשמור מעגלי trisynaptic של ההיפוקמפוס, ולכן הם יעילים במיוחד לחקירת פלסטיות הסינפטית, מנגנון מקובל לראות בבסיס למידה וזיכרון. פרוסות ביפוקמפוס Organotypic מיום 5 ו 6 גורים לאחר לידת עכבר / עכברוש יכולות להיות מוכנות כפי שתואר לעיל 8, ושימושיים במיוחד לחריפות מציאה או חלבונים אקסוגניים overexpress. יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה בעבר לפרקaracterize neurogranin (נג), חלבון נוירון ספציפי עם תפקיד קריטי בויסות תפקוד הסינפטי 8,9. יש לנו גם השתמשנו בו כדי לאפיין את הלוקליזציה של ultrastructural calmodulin (רמ"א) וCa 2 + חלבון / CAM תלוי קינאז השני (CaMKII) 10. כפי שמודגם בתוצאות, פרוטוקול זה מאפשר שימור ultrastructural טוב של קוצים הדנדריטים ותיוג יעיל של נג לעזור לאפיין ההפצה שלה בעמוד השדרה של 8. יתר על כן, התהליך המתואר כאן יכול להיות תחולה רחבה בחקר חלבונים רבים אחרים שהיו מעורבים בפונקציות עצביות.
פרוטוקול
1. קבעון
Fixatives הם מסרטנים; ללבוש כפפות ולטפל בfixatives במנדף. אלא אם צוין אחרת, כל incubations נעשה על קרח ואת כל הפתרונים צריכים להיות מסוננים לפני השימוש. השתמש ריאגנטים אלקטרונים מיקרוסקופים בדרגה.
יום 1
- אחרי תנאי ניסוי (למשל הזרקה נגיפית, טיפול תרופתי), הצב את הקרום עם פרוסות ביפוקמפוס organotypic ב60 x 15 מ"מ צלחת פטרי קלקר המכילה 0.1 מ 'פוספט חיץ קר כקרח (חיץ פו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התרשים 2B מראה דוגמה של ההפצה של מולקולות נג אנדוגניים בקוצים הדנדריטים של נוירונים CA1 פירמידליים היפוקמפוס. רשתות עם ניקל (60 ננומטר) המכילות רקמות Ultrathin CA1 אזור של ההיפוקמפוס (כפי שניתן לראות באיור 2 א) היו מכוסות ב1% T / PB, 50 mM גליצין, אז חסמה עם BSA 2.5% ו -2.5% בסרום לפני הדגירה עם אנטי נג-נוגדן. לאחר שטיפה עם T / PB, רשתות היו אז מכוסות בנוגדנים משניים נגד הארנב מצמידים זהב ננומטר 10. לבסוף, רשתות נשטפו עם T / PB וpostfixed עם gluta.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מאמצים את שיטת Phend ויינברג למוח ורקמות בעמוד שדרה כדי ללמוד קוצים הדנדריטים בתרבויות פרוסות ביפוקמפוס חולדה. קוצים הדנדריטים באזור היפוקמפוס CA3-CA1 הם מבנים עדינים המכילים מגוון עצום של חלבונים שממלאים תפקידים חשובים בויסות תפקודים עצביים. השיטה הוצגה מספקת גישה מאוזנת להשגת antigenicity המשופר, תוך שמירה על שימור ultrastructural טוב (איור 2 א), ומאפשר יעילות תיוג סבירה ושחזור שימושי לאפיון ההפצה של אנטיגנים ספציפיים בתוך עמוד השדרה טוב. הנה, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
המחברים מבקשים להודות למתיו פירנצה להכנה של התרבויות הפרוסות ביפוקמפוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להזדקנות בארה"ב ואיגוד האלצהיימר לNZG.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 60 x 15 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן | פלקון | 351007 | |
| אזמל חד פעמי | EXELINT | 29552 | |
| מוסיף תרבית תאים | Millipore | PICM03050 | |
| 10 ננומטר עיזים-אנטי-ארנב זהב | מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי | 25108 | |
| נוגדן נגד נוירוגרנין | Millipore | AB5620 | |
| 100% חומצה פיקרית | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 19550 | |
| 96% פרפורמלדהיד | אקרוס אורגני | AC41678-0030 | |
| 25% גלוטראלדהיד (דרגת EM) | סיגמא | G5882 | |
| אורניל אצטט | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 22400 | |
| p-פנילאנדיאמין | סיגמא | P6001 | |
| פלטינום (IV) כלוריד | סיגמא | 379840 | |
| חומצה טאנית | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 21710 |
מקורות
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. His....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
