דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

סיכום

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

תקציר

שבב רצף (Chip-אילך) שיטות להציע ישירות כיסוי הגנום כולו, שבו שילוב של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) ויכול להיות מנוצל רצף מקביל מסיבי כדי לזהות את הרפרטואר של רצפי DNA יונקים מאוגדים על ידי גורמי שעתוק in vivo. "דור הבא" טכנולוגיות רצף הגנום לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זול ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות יותר ובכך מאפשר לשיטות שבב seq כדי לספק כיסוי הגנום כולו ישירות לפרופיל יעיל של יונקים אינטראקציות חלבון ה-DNA.

למוצלחים שבב seq גישות, צריך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר רצף. התיאור מבוסס סביב ניסיון עם מוצר החלבון של הגן הכי חזק מעורבים בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, כלומר גורם שעתוק גורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2). גורם זה גם היה מעורב בסוגים שונים של סרטן.

התווה הוא איך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה הנגזרת משורת תאי קרצינומה של המעי הגס, HCT116, על מנת לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה באמצעות רצף כדי לקבוע את הגנים מאוגדים על ידי TCF7L2, נותן תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

מבוא

במשך שנים רבות יש כבר צורך מסופק לזהות הסט של גנים כפותים ומוסדרים על ידי חלבון נתון הגנום רחב, במיוחד אלה בכיתה גורם שעתוק.

אודום et al. ¹ משמש הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בשילוב עם microarrays האמרגן לזהות באופן שיטתי את הגנים שנכבשו על ידי רגולטורים תעתיק שהוגדרו מראש בכבד האנושי ואיי לבלב. כתוצאה מכך, ג'ונסון ואח'. ² פיתחה assay immunoprecipitation הכרומטין בקנה מידה גדולה המבוסס על רצף ישיר אולטרה תפוקה גבוהה DNA (שבב ואילך) על מנת למפות באופן מקיף אינטראקציות-DNA חלבון על פני הגנום כולו יונקים. כמקרה מבחן, הם מיפו in vivo המחייב של הגורם מגביל משתיק נוירון (NRSF) עד 1946 מקומות בגנום האנושי. הנתונים מוצגים ברזולוציה חדה של עמדה מחייבת (+ 50 זוגות בסיסים), שאפשרה גם ליsolation של מוטיבים וזיהוי של מוטיבים NRSF מחייבים. גם היו נתונים שבב seq אלה רגישות גבוהה וספציפיות וביטחון סטטיסטי (p ^-4 <10), תכונות שחשובות להסקת מסקנות אינטראקציות מועמד חדשה.

רוברטסון et al. ³ משמשים גם שבב ואילך על מנת למפות STAT1 מטרות באינטרפרון-γ (IFN-γ) מגורה וunstimulated תאי S3 הלה אדם in vivo. על ידי שבב ואילך, באמצעות 15.1 ו12.9 מיליון רצף ממופה ייחודי קורא, ושיעור גילוי שקר משוער של פחות מ 0.001, הם זיהו 41,582 11,004 ואזורים STAT1 מחייבים משוערת בתאי מגורה וunstimulated, בהתאמה. מ -34 הלוקוסים ידועים STAT1 ^4-8 אתרי קישור אינטרפרון מגיבים, שבב אילך מצא 24 (71%). מטרות שבב seq היו מועשרים ברצפים דומים לSTAT1 מוטיבים מחייבים ידועים. השוואות עם שני נתונים שבב ה-PCR קיימים מגדירה הציעושרגישות שבב אילך הייתה בין 70% ו 92% וסגוליות היה 95% לפחות. בנוסף, היה ברור שהשבב ואילך מציע גם מורכבות אנליטית נמוכות ורגישות שעולות עם רצף עומק.

כמו טכנולוגיות רצף הגנום כגון, "הדור הבא" לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זולה ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות ^9. שיטות שבב seq לכן ישירות לספק כיסוי הגנום כולו לאפיון יעיל של אינטראקציות-DNA חלבון ³ יונקים.

בשנת 2006, קשר חזק של גרסאות בגורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2) גן עם סוכרת מהסוג 2 התגלה ^10. חוקרים אחרים כבר משוכפלים באופן עצמאי את הממצא הזה בקבוצות אתניות שונות ומעניין, מן הגנום מחקרי העמותה הרחב הראשונים של סוכרת מהסוג 2 שפורסמו בכתב עת Nature ^11,12 , מדע ^13-15 ובמקומות אחרים ^16,17, הקשר החזק ביותר אכן היה עם TCF7L2, זה נחשב כיום הממצא הגנטי המשמעותי ביותר בסוכרת מהסוג 2 עד כה ^18-20. בנוסף, TCF7L2 נקשר לסיכון לסרטן ^21,22, ואכן, הקשר הזה היה ברור יותר, כאשר מוקד 8q24 מתגלה על ידי מחקרי עמותה רחבות הגנום של מספר סוגי הסרטן, כולל קרצינומה של מעי גס, הוצג להיות בשל הזרם קיצוני אלמנט TCF7L2 מחייב נהיגה השעתוק של MYC ^23,24. ככזה, יש עניין רב בקביעת גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי גורם שעתוק זה מפתח.

בהתבסס על ניסיון של עם TCF7L2 כדוגמה למתודולוגיה, מאמר זה מתאר כיצד ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה. צ'יפ היה מתבצע בשורת תאי סרטן המעי הגס, HCT116, עבור סידור שלאחר מכן על מנת לבנות גבוה Resolמפת ution מהגנים מאוגדים על ידי TCF7L2 ²⁵ במאמץ להניב תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

פרוטוקול

1. הכרומטין חוצה קישור

1. לגדל תאים בתרבית תאי 100x20mm מנות. כמות התאים יכולה לנוע בין 1 ל -10 מיליון תאים לכל מנה בהתאם לסוג התא. כ -2 מיליון תאים מספיקים לimmunoprecipitation אחד.
2. תאי צולבות קישור בפורמלין 1% למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר עם נדנדה מדי פעם.
3. להרוות את הצלב מקשר על ידי הוספת ריכוז סופי של 125 מ"מ גליצין ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. שטוף תאים עם פוספט 1X שנאגרו מלוח (PBS) פעמיים, למזוג PBS, ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ"ל של PBS.
5. קציר תאים עם מגרד תא פלסטיק לתוך צינור microcentrifuge.
6. ספין למטה תאים ב 2000 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר תמוגה SDS (1% SDS, EDTA 10mm, 50mm טריס-HCl pH 8.1) לכל תא lysate או לשמור אותם כגלולה להפקת נשק גרעיני.
8. ניתן לשמור תאים ב -80 ° C, או אחד יכול להמשיך immediatאיליי עם sonication.

2. הכן את הגרעינים (המשך שלב 3.5 לlysate תא השלם)

1. להשלים את מאגר תמוגה סלולרי (5 מ"מ pH 8.0 צינורות, 85 מ"מ KCl, 0.5% NP-40) עם 1X אינהיביטור proteinase כל ניסוי.
2. Resuspend מופשר תא גלולה בכ 10 פעמים בנפח גלולה עם הצפת תמוגה תא.
3. Dounce-Homogenize 10 פעמים עם העלי אז לדגור על קרח במשך 10 דקות.
4. צנטריפוגה מדגם ב -4,000 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant, ולשמור גלולה גרעינית.

3. Sonication *

1. לחמם את מאגר תמוגה SDS וסכום תוספת של חיץ לשימוש עם מעכבי proteinase.
2. Resuspend גרעינית גלולה בSDS תמוגה המאגר (כ 0.5 מ"ל של חיץ ל1-10,000,000 תאים)
3. לדגור על קרח במשך 10 דקות.
4. הוסף 0.5 מ"ל aliquots של דגימות לצינורות microcentrifuge.
5. Sonicate על קרח רטוב באמצעות sonicator Misonix עם 30 שניות על 45 שניות וליד הגדרת משרעת של 2. מספר המחזורים לגודל שבר אידיאלי ניתן לקבוע על ידי ראשון שניסה את מספרים שונים (מחזור 2 שמ ', 4, 8, 12, 16, 20 או יותר ומחזורים). מותג של sonicator שונה עשוי לשמש, לעומת זאת, התנאים ישתנו. ניסויים עם מספר המחזורים ואת כמות זמן וכיבוי חייבים להתבצע על מנת לקבוע את התנאים אידיאליים.
6. אסוף 20 μl של כל דגימה כדי לבדוק את תוצאות sonication ולעשות כימות,. שאר המדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C.
7. לדלל את 20 μl של מדגם על ידי הוספת 30 μl של הצפת TE 0.1X.
8. פנק את המדגם עם μl 1 של RNase על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן להוסיף μl 1 של proteinase K ו לדגור על 62 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
9. לרוץ 20 μl של המדגם על 2% ג'ל agarose.
10. לטהר את הסכום הנותר של מדגם עם ערכת טיהור PCR QIAquick אז לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.

* לצ'י המקוריP, עיכול nuclease microccocal ניתן להשתמש לחלופין גזירת ה-DNA.

4. חרוזים agarose לחסום *

1. אם חרוזים כבר חסומים, המשך לשלב 5.1.
2. השתמש בחלבון או חלבון G agarose. במשך 5 immunoprecipitations (IPS), השתמש ב600 μl של 50% חרוז תרחיף (300 μl חרוז גלולה)
3. כדי לשטוף את החרוזים, לסובב אותם ב 800 סל"ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. הוסף מעט יותר מ -2 חיץ דילול שבב מ"ל (0.01% SDS, EDTA 1.2 מ"מ, 167 מ"מ NaCl, 1.1% טריטון X-100, 16.7 מ"מ טריס-HCl pH 8.1) ומערבב על ידי לאט צינור היפוך 10X. ספין למטה שוב ב800 סל"ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. חזור על לשטוף פי 2 יותר.
4. חסום את חרוזים על ידי סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחסימת פתרון. עיין בטבלה 1 למתכון של פתרון החסימה.

5. הכרומטין מראש ברור

1. הפשירו sonicated הכרומטין על קרח.
2. ספין למטה בסל"ד ו 12,000או 10 דקות ב 4 ° C ואז לשים על קרח מייד כדי להסיר SDS (לבן גלולה).
3. איסוף supernatant, להשליך גלולה, ולשלב דוגמאות במידת צורך.
4. להוציא את הסכומים דרושים לצורך הניסוי המבוסס על חישובים (1-10 UG של הכרומטין ל-IP).
5. לדלל הכרומטין 10X בחיץ דילול שבב בתוספת מעכב proteinase.
6. הוסף 100 μl של חרוזים חסומים ל-IP.
7. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.

6. Immunoprecipitation

1. ספין למטה דגימות ב 800 סל"ד דקות 1 ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
2. ספין למטה supernatant ב 800 סל"ד דקות 1 והעברה לצינור נקי אחר.
3. לחסוך 20 μl של supernatant, לשמש כשליטת קלט, ב -20 ° C.
4. Aliquot הכרומטין למספר כתובות IP שצריך לעשות בניסוי.
5. הוסף 2 UG של נוגדן לUG 1-10 של הכרומטין לכל דגימה.
6. דגירה הלילה 4 ° C עם רוטציה.
7. הוסף 100 μl של חרוזים חסומים לכל דגימת ה-IP.
8. דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
9. גלולה החרוזים על ידי שצנח ב 800 סל"ד דקות 1 ולבטל כמה שיותר את supernatant ככל האפשר.
10. לשטוף חרוזים פעם עם חיץ לשטוף קומפלקס חיסוני דל מלח. הוסף 1 מ"ל של חיץ לכל צינור, לסובב בטמפרטורת חדר למשך 5-8 דקות, ספין למטה בסל"ד 800 דקות 1, ולאחר מכן להשליך supernatant. חזור על לשטוף פעם עם חיץ גבוה מלח חיסוני קומפלקס לשטוף ולשטוף חיץ קומפלקס חיסוני LiCl ופעמים עם חיץ TE עבור סכום כולל של 5 כביסות (טבלה 2).

7. Elution

1. דגימות קלט להפשיר מהיום קודם לכן כדי להיות מעובד עם eluants.
2. הפוך Elution הצפת טרי (טבלה 3).
3. הפוך את תערובת הורים של ההצפה elution מספיק נחוצה לשב"ס ודגימות בקרת קלט בתוספת 1-2 דוגמאות נוספות.
4. הוסף 100 ההצפה elution μl לכל דגימת ה-IP ולדגור על טמפ 'החדר למשך 15 מ'בעם סיבוב.
5. ספין למטה בסל"ד 800 דקות 1 ולהוסיף supernatant לצינור טרי.
6. הוסף 100 μl נוסף של הצפת elution על צינור אחד של חרוזים ולדגור על טמפ 'החדר במשך 15 דקות עם רוטציה.
7. וורטקס במשך 15 שניות לאחר דגירה; ספין למטה ב 5000 סל"ד דקות 1, ולאחר מכן לשלב את supernatant עם supernatant מelution הראשון. (ודא שאין חרוזים שנשארו בsupernatants. אם אינך בטוח, ספין למטה supernatant שוב ב 5000 סל"ד דקות 1 ולאסוף את supernatant בצינור חדש.
8. הוסף 180 μl של ההצפה elution ל20 μl של דגימות בקרת קלט.

8. היפוך חוצה קישור

1. לμl 200 של eluants ובקרות קלט, להוסיף 8 μl של 5 M NaCl.
2. צינורות חותם עם parafilm ודגירה באמבט מים ב 65 ° C במשך הלילה.

9. טיהור ה-DNA

1. טיפול בכל דגימה עם μl 1 של RNase עבור שעה 1 ב 37 ° C.
2. הוסף 4 μl של 0.5 M EDTA, 8 1M μl טריס-HCl, לערבב, ואז להוסיף μl 1 של proteinase K לכל דגימה ולדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
3. לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR QIAquick. ניתן לשמור את הדגימות ב -20 ° C ו-PCR בדיקה יכולה להיעשות במועד מאוחר יותר.

* לחלופין, חרוזים מגנטיים שבב כיתה ניתן להשתמש במקום של agarose עבור חלק immunoprecipitation.

10. סימון ה-PCR

1. לבדיקת PCR, השתמש פריימרים לאזורים ידועים להיות מחויבים לחלבון של עניין. כמו כן, השתמש פריימרים לאזורים בלתי מחייבים כביקורת שלילית.
2. מערבבים את חומרים כימיים לתגובה. לדלל מדגם קלט ב1:100 (טבלה 3).
3. הפעל תגובה. תכנית ה-PCR:

שלב 1: 94 ° C 3 דקות

שלב 2: 94 מעלות צלזיוס 20 שניות
59 ° C 30 שניות
72 ° C 30 שניות
(חזור על שלב 2 עבור לפחות 30 cycles)

שלב 3: 72 מעלות צלזיוס 2 דקות

4. הפעל דוגמאות על 1% agarose ג'ל.
5. העשרה גם ניתן לקבוע כמותית עם PCR בזמן אמת.

תוצאות

ברגע שהכרומטין כבר sonicated וטופל עם RNase וproteinase, הדגימות לרוץ על 2% ג'ל agarose צריכה להציג למרוח עם חלק הארי של ה-DNA בגודל הרצוי. אם מספר מחזורים שונים נבדקים, ירידה הדרגתית בגודלו יש לראות במספר מחזורי הגידול (איור 2).

לאחר שסיים את חלק immunoprecipitation של הפרוטוקול או ניתן לבדוק את ההעשרה על ידי PCR או PCR בזמן אמת. לקבלת דוגמיות PCR לרוץ על ג'ל agarose צריכה להיות בלהקות ה...

דיון

עכשיו זה אפשרי לבצע את פרופיל הגנום של עמותת אינטראקציות חלבון דנ"א באמצעות שבב ואילך, כפי שהודגם לאחרונה עם גורמי שעתוק אחרים ^2,3. המפתח לתוצאה מוצלחת הוא רצף של דור תבנית immunoprecipitation הכרומטין באיכות גבוהה ה-DNA.

ברגע שתבנית ה-DNA כבר נוצר והוברר להיות מועשרים במידה מספקת, ואז אחד יכול לקחת את זה בספריית הכנה עבור סידור שלאחר מכן. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול ספריית הרצף מסופק על ידי הספ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
QIAquick PCR טיהור ערכת	Qiagen	28104
EZ-ChIP ערכת	Millipore	17-371
GoTaq התחלה חמה פולימראז	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר	Thermo-Scientific
<רצפי פריימר בקרה חיוביים >TCF7L2-1) קדימה- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' הפוך- 5'-GCTCACCCTCTGTATCTTCG-3' <רצפי פריימר בקרה שליליים > (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGTGATGGGAAC-3' הפוך- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTCTGG-3'