הערכה של ריקון קיבה בעכברים סוכרתיים ללא שימוש בשמנים [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה

סיכום

קביעת ריקון קיבה עם לא פולשנית [ ¹³ C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה לgastroparesis מעקב בעכברי NOD LtJ נשיים.

תקציר

מחקרי ריקון קיבה בעכברים היו מוגבלים על ידי חוסר היכולת לעקוב אחר שינויי ריקון קיבה באותה בעלי החיים מאז הטכניקות הנפוצות ביותר דורשות הרג של בעלי החיים וההתאוששות שלאחר מוות של ^1,2 ארוחה. גישה זו מונעת מחקרים ארוכים טווח על מנת לקבוע שינויים בהתרוקנות קיבה עם גיל והתפתחות המחלה. שימוש נפוץ ^[13 C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה לבני אדם ³ כבר שונה לשימוש בעכברים וחולדות ^{4-6 7} והראינו בעבר כי המבחן הזה הוא אמין ומגיב לשינויים בהתרוקנות קיבה בתגובה לתרופות ובמהלך התקדמות מחלה סוכרתית ^8. במצגת וידאו זה העיקרון והיישום מעשי של מבחן שונה זה הסביר. כמו במחקר הקודם, עכברי NOD LtJ משמשים, מודל מהסוג 1 ⁹ סוכרת. חלקם של עכברים אלו מפתחים תסמינים של gastroparesis, סיבוך של diabetes מאופיין על ידי עיכוב בהתרוקנות קיבה ללא חסימה מכאנית של הקיבה ^10.

מסמך זה מדגים כיצד לאמן את העכברים לבדיקה, כיצד להכין את ארוחת מבחן ולקבל נתוני 4 hr קיבה מרוקנת וכיצד לנתח את הנתונים שהתקבלו. מנתח איזוטופ פחמן השתמש במחקר הנוכחי הוא מתאים לדגימה האוטומטית של דגימות אוויר מהמרחק של עד 12 עכברים באותו הזמן. טכניקה זו מאפשרת אורך מעקב של ריקון קיבה מקבוצות גדולות של עכברים הסובלים מסוכרת או מחלות אחרות כבר שנים רבות.

מבוא

כתב יד זה מתאר את השיקולים הטכניים ומתודולוגי מעורבים במדידה לא פולשנית של ריקון קיבה בעכברים. על ידי ביצוע הפרוטוקול מתואר כאן, חוקרים יכולים לעקוב באופן מהימן וreproducibly שינויים בקיבה מרוקנת בשל התפתחות המחלה, ללמוד את ההשפעה של סוכנים תרופתיים בהתרוקנות קיבה ובצע את התגובה של ריקון קיבה לטיפול במחלות או מומי ^{6,8 בסיסיות, 11,12.} בפרסומים קודמים, היישום של ¹³ C מבחני נשימה octanoic חומצה הוצג להיות דרך יעילה למדידת ריקון קיבה בבני אדם ובעלי חי ^3,8. מאמר זה מתאר בפירוט, לצעדים הדרושים כדי להשיג נתונים אמינים על 6-8 חודשים דרושים למחקר אורך של ריקון קיבה בעכברים עם סוכרת. היתרונות של ביצוע פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות שפורסמו בעבר הם שהחוקר יכול להיות סמוך ובטוח הנתונים obtaineד יהיה אמין ושחזור. בנוסף, המערכת האוטומטית לאיסוף והניתוח של דגימות הגז שתוארה כאן מגדיל את מספר בעלי החיים שניתן בעקבותיו זמנית במחקר. בסך הכל, המטרה של מאמר זה היא לזהות את גורמי המפתח ששומרים התרגלות של העכברים לבדיקה וכי הפחתת שונות בתוצאות שהתקבלו.

למדידה בvivo של ריקון קיבה, עכברים הם צמים לילה והכניסו לתוך תאי בדיקת הפלסטיק השקופים עם זרימת אוויר קבועה. לאחר שהעכברים מקבלים מורגלים לחצוצרות, נקודת פתיחת נשף ¹³ CO ₂ רמות נחושות וזרימת אוויר בהתאם. בשלב בא, ואנחנו נותנים ארוחת מבחן המורכב מחלמון ביצה מעורבבת עם octanoic ¹³ חומצה ג שכותרתו. מאחר שהעכברים הם צמו ומאומנים, הם בדרך כלל אוכלים את ארוחת מבחן בתוך 2 דקות. octanoic החומצה מנוהלת לא נספגה בבטן, אבל תילקח בתריסריוןד יקבל חילוף חומרים בכבד ^ל13 CO _2, אשר שוחרר ונשף, וכתוצאה מהעשרה של ¹³ CO ₂ באוויר שמסביב. דגימות אוויר נאספות במרווחי זמן שנקבעו והם נותחו על ידי מנתח איזוטופ פחמן. צעד שער ההגבלה בכל התהליך הזה הוא ריקון קיבה ואת הפרשת הריאה של ¹³ CO ₂ ישירות מתכתב עם ריקון קיבה של הארוחה המסומנת.

איור 1. סכמטי של מנגנון ריקון קיבה. לאחר צום בן לילה, עכברים ממוקמים בתאים שקופים המאפשרים להם לנוע ולהפוך באופן חופשי. צינור יניקה מאפשר זרימת אוויר צחה ומתמדת ושקע מוביל למנתח איזוטופ למדוד ¹³ C-ל- ¹²יחס C בנשיפה. הקאמרי יש גם יציאה מרכזית למשלוח של מזון המכיל ^[13 C]-octanoic חומצה.

פרוטוקול

1. הדרכה והרגלה של העכברים

1. לפני הניתוח, שם את כל העכברים בתאי הבדיקה עבור 2-4 שעות עם זרימת אוויר קבועה כדי להרגיל אותם לתנאי הבדיקה. זה משמעותי מפחית את רמות לחץ שעלול לגרום לזיהוי חריג של עיכוב בהתרוקנות קיבה. פנק את העכברים באותו אופן כאילו ניסוי ריקון הקיבה היה פועל. הכן את חלמון ביצה (ראה עוד) מבלי להוסיף octanoic חומצה ולהאכיל 0.2 גרם לכל עכבר.
2. חזור על תהליך זה עד לעכברים מאומנים במידה מספקת (בדרך כלל 2-3 פעמים). העכברים בדרך כלל הם מורגלים בקלות, כל עוד התנאים הסביבתיים נשמרים אותו הדבר.

הערה: עכברים ללא מורגלים ימשיכו לנוע סביב כ 1 שעות לאחר העברה לתא, ולחרבן ולהשתין בתדירות גבוהה, ואילו עכברים מורגלים להסתפק במהירות בסביבה החדשה שלהם והמנוחה בשקט.

לאטה: במהלך הניסוי: בעלי חיים לפקח על סימנים של אובדן של התרגלות כגון הטלת שתן עודפת, עשיית צרכימים, חוסר העניין באכילת הביצה. אם זה מקרה לשקול מחדש הרגלה במחסנית ריקה לפני 1-2 פעמים לקבלת נתוני התרוקנות קיבה. עקביות היא חשובה מאוד בזמן ביצוע ניסוי זה. לעשות דברים באותו אופן בדיוק בכל פעם שהיא הדרך היחידה להשיג תוצאות מהימנות ושחזור. זה כולל מתן טיפול (למשל אינסולין) בכל יום באותו הזמן, ולא להפריד את העכברים מ- חבריהם לכלוב שלהם אלא אם כן הכרחית, צום העכברים ותחילת בדיקת ריקון הקיבה באותו הזמן, וטיפול בעכברים באותה הדרך.

2. הכנת ארוחה המכיל איזוטופ מבחן

1. התחל עם המשקל מתוך 5 גרמו חלמון ביצה בצינור 50 מ"ל בז. חזור על שלבים אלה בכל יום ניסיוני להכין ארוחת מבחן טריה.
2. הוסף 10 μl של octanoic חומצה עם concentration של 2 μl / g לצינור המכיל 50 המ"ל הבז ביצה ומערבב נמרצות ל1 דקות עם מרית בצינור הבז.
3. אז הביצה מועברת לכוס זכוכית ומחוממת מעל מבער בונזן עד שcoagulates והעקביות שלו היא מתאימה כדי להפוך את כדורים קטנים. זה בדרך כלל לוקח בערך 30 שניות.

הערה: כדורי חלמון ביצה צריכים לשקול 0.2 גרמו לעכבר. זה חשוב כדי לשמור על המינון מצטבר מתמיד בכל העכברים.

3. החל הניסוי

1. אחרי הכשרה ומוכן לריקון קיבה, מהיר עכברי הלילה (12 שעות) על "רשת בתחתית" מדף צום מתכת כדי למנוע אכילת צואה. ודא שיש להם גישה חופשיה למי שתייה. מאז עכברים סוכרתיים נמצאים בשימוש בניסוי הנוכחי, הם לא צריכים להיות צמו במשך יותר מ 16 שעות.
2. התחל על ידי הקמת תאי התרוקנות הקיבה. השתמש בתאים נקיים וכיסויים שהיו באוויר יבש. כמו כן, כלצינורות המחברים את התאים למנתח או אספקת אוויר CO ₂ צריכים להיות לחות חופשיות; מים יכולים להפריע לאות לקרוא על ידי המנתח
3. חבור את התאים לצינורות היניקה המספקים זרימת אוויר קבועה. ואז לחבר את הצינורות העודפים מהתאים למכונה. סגור את הצינורות ולהפעיל את זרימת האוויר.

הערה: למרוח כמות קטנה מאוד של וזלין בסוף מכסי הכיסוי אז הם סוגרים בקלות ובאופן מאובטח האטומים. חותם חזק זה נחוץ כדי לאסוף את כל הפחמן הדו חמצני המיוצר על ידי העכברים.

4. פרוצדורות

1. התחל על ידי שקילה כל עכבר. משקל גוף הוא מדד לבריאות הטובה המתמשכת שלהם. ואז למקם כל עכבר בתא המתאים. זה כמובן חשוב שהאוויר זורם לתוך התאים בשלב זה.
2. כדי להתחיל את המדידה, לאפשר לעכברים להסתגל לתאים להסתגל לפניing רמות האוויר.
3. ברגע שהעכברים להיראות רגועים, שעשוי לקחת כמה דקות, להתאים את קצב זרימת אוויר לכל אחד מתאי עכבר. זה עשוי להיות שונה עבור כל עכבר. בדרך כלל, את זרימת האוויר מותאמת בתחילת הניסוי, כדי לוודא שנשף CO ₂ מגיע לרמות ניתנות לזיהוי על ידי כל ציוד נמצא בשימוש, וכדי לוודא שהרמה נשארת נמוכה מספיק כדי להבטיח תחלופת אוויר בריאה. אנו משתמשים ₂ רמות CO ראשוניות בין 1000 ו 1500 חלקים למ'.
4. אם נתקל בקשיים עם התאמות, לבדוק דליפות אוויר. ואז לחזור על התהליך עבור כל אחד מהתאים ולצפות לעוד סיבוב של מדידות כדי לראות אם התאמות שבוצעו לזרימת אוויר תקנו את רמת ₂ CO. חשוב לקבל בסיס יציב לקרוא לפני האכלת העכברים. אנו משתמשים במכונה עם תכונת כיול עצמית. אם זה לא מקרה הכיול צריך להיות מסומן.
5. כאשר זו מושגת, לנהל את ארוחת ביצהלעכבר ולרשומה הראשון הזמן כל עכבר מקבל את המזון.
6. אנו מפעילים נוהל 4 שעות כדי להשיג מספיק ערכים להתאמה עקומת ¹³ CO ₂ העשרה לכל עכבר. בדקו על עכברים בכל 30-60 דקות כדי לוודא שאת ₂ רמות CO עדיין בטוחות לעכברים.
7. הכן את התיבות חדשות המכילות מזון לפני סוף המבחן, כך שהעכברים יכולים להתחיל לאכול מייד אחרי הבדיקה היא למעלה.

תוצאות

נתונים יציגים נקבעו משלושה עכברים שונים מוצגים באיור 2. הגרף השחור מייצג את נקודתי נתונים מעכבר עם התרוקנות קיבה תקינה. זה מראה את החלק היחסי של ¹³ C שהוא התאושש באוויר הננשף המבוטאים כאחוז של המינון מנוהל לשעה הביע כפונקציה של זמן. העקומה הכחולה היא מעכבר עם קיבה מואצת רוקן עם ערך 1/2 T של 40 דקות והעקומה האדומה הוא מעכבר עם ריקון קיבה מעוכבת בשווי 1/2 T של 168 דקות. כפי שנקבע במחקר קודם ^ב7 המעבדה שלנו, במחצית זמן הקיבה הרגילה לרוקן גיל עכבר...

דיון

הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת חוזר ובלתי פולשנית למדידת vivo של ריקון קיבה המוצקה בעכברים. במערכת זו יש יתרון בכך שבעלי החיים אינם מרוסנים בתא המדידה, המאפשרת להם לנוע בחופשיות ולהפוך. מכיוון שזו סביבה לא מוכרת, העכברים עדיין צריכים להיות מאומנים ומורגל לתאי הבדיקות כדי למנוע תופעות של לחץ בהתרוקנות קיבה. באופן כללי, אנו מניחים את נתוני ריקון הקיבה הם אמינים אם שונות התוך העכבר בין בדיקות רצופות קיבה מרוקנת הן פחות מ 10%.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם	חברה	מספר CAT	תגובות
מקור לאספקת אוויר, זרימה מתמדת, כמו גם הרכב	אספקת אוויר המרכזי במתקן המחקר
קאמרי דגימת מ"ל 130 שיש אוויר בכניסה, אוויר לשקע, ופתיחת ממשל מזון צינורות פלסטיק לאספקת אוויר	בבית שנבנה
Octanoic חומצה	קיימברידג' איזוטופ מעבדות (אנדובר, תואר שני)	CLM-293-1
כדי להכין את ארוחת ביצה: ספל קטן צינור 50 מיליליטר פלסטיק בונזן מבער ביצה מרית	כל ספק		נסהלהיות עקבי עם ספק הביצה שכן תוכן והטעם הערב לחך התזונתי של הביצים יכולים להשפיע על התרוקנות קיבה ובליעה של הארוחה
איזוטופ פחמן דו חמצני מנתח	לוס גאטוס מחקר בע"מ (Mountain View, קליפורניה)