מאמר שיטה

18.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50332

⸱

12 ביוני 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

במאמר זה

סיכום

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש במבחנה מודל ליצירת תאים אלה. השימוש בצנטריפוגה שיפוע, בידוד חרוז שלילי ותנאי תרבות תאים מסוימים, יכולים להיות שנוצרו מקרופאגים מונוציטים הנגזרות ללימודים פנוטיפי ופונקציונליים.

תקציר

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים סוג תא חשוב של מערכת החיסון המולדת. מודלים עכבר הלומדים ביולוגיה מקרופאג סובלים מההבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מקרופאגים מונוציטים הנגזרות Murine והאנושיים. לכן, לנו כאן לתאר במודל חוץ גופית כדי ליצור וללמוד מקרופאגים האנושיים העיקריים. בקצרה, לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות של דם היקפי נמשך מוריד בזרוע, מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear באמצעות בידוד חרוז מגנטי שלילי. מונוציטים אלה בתרבית, במשך שישה ימים בתנאים מסוימים לגרום לסוגים שונים של בידול מקרופאג או קיטוב. המודל הוא קל לשימוש ועוקף את הבעיות שנגרמו על ידי הבדלים בין מינים ספציפי עכבר ואדם. יתר על כן, הוא קרוב יותר לתנאים בvivo מאשר השימוש בשורות תאים הונצחו. לסיכום, המודל שתואר כאן הוא מתאים ללמוד macrophagביולוגיה דואר, לזהות מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשניות. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

מבוא

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים מרכיב תאי חשוב של מערכת החיסון המולדת ולתרום לתהליכים דלקתיים רבים 1 אקוטיים או כרוניים. המקרופאגים משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים רבות או סרטן 2. המקרופאגים מראים רמה גבוהה של גמישות והם מסוגלים להניח פנוטיפים שונים בהתאם לmicromilieu המקומי 3. לפיכך, לומד בידול מקרופאג וההטרוגניות הוא חיוני להגדלת הידע של הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות שלנו ועל מנת לאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים.

במקרים רבים, מודלים Murine משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד ביולוגיה מקרופאג באמצעות מודלים עכבר מלווה בכמה חסרונות: (1) חלקם של מספרי קבוצת משנה ויקוציטים (מונוציטים וגרנולוציטים כלומר) בperipדם heral של עכברים או בני אדם שונה באופן משמעותי המצביע על תפקידים שונים של מונוציטים בפתופיזיולוגיה עכברית ואנושית. (2) יש הבדלים משמעותיים בביטוי גנים בין מונוציטים בדם היקפיים Murine והאנושיים המצביעים על הבדלים משמעותיים בתפקודם במהלך מחלה ובריאות 4. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים ומקרופגים (F4/80, LYC, וכו '.) עכבריים אינה קיימים בתאי מיאלואידית אדם, מה שהופך את העברת ממצאים במודלים של עכבר למצב האנושי קשה למדי.

לכן, על מנת להגביר את ההבנה של בידול מקרופאג וההטרוגניות במחלה אנושית שלנו, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלים שעובדים עם מקרופאגים אדם. לכן, לנו כאן לתאר מודל של דור מקרופאג העיקרי אדם כי הוא קל לשימוש ומאפשר לימוד של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות אדם במבחנה בתנאים שונים וכתוצאה מכך שונה מקרופאג פוסוגי larization. במספר מחקרים, יש לנו להשתמש במודל חוץ גופית של מקרופאגים האנושיים העיקריים מונוציטים הנגזרות לנתח ביולוגיה מקרופאג ואת הרלוונטיות שלה לטרשת עורקת פוטנציאל אנושית 5-7.

למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פרוטוקול

  1. הכן חוצצים כדלקמן:
    1. הכן את החיץ לבידוד PBMC: "לשטוף חיץ" = 0.02% EDTA ב PBS (שימוש 0.5 M EDTA).
    2. הכן את החיץ לבידוד מונוציטים: "חיץ שטיפת מקינטוש" = 0.5% BSA (250 מ"ג) + 2 מ"מ EDTA (200 μl) + PBS (50 מ"ל). דגה החיץ.
    3. הכן את החיץ מכתים FACS ואחסון של תאים: "FACS חיץ" = 10% FCS ב PBS ו" חיץ קיבעון "= 1% PFA ב PBS.
  2. צייר דם כל 30 מ"ל מוריד בזרוע. השתמש EDTA כנוגד קרישה.
  3. לבודד PBMC (Histopaque) כדלקמן:
    1. הכן שני צינורות 50 מ"ל סטרילי (לא פולי-סטירן).
    2. לדלל דם משלב 2 עם PBS 1:1.
    3. הוסף מיליליטר Histopaque 25 + 25 מיליליטר דם מלא / PBS לכל צינור. ודא כי Histopaque ודם לא מתערבבים.
    4. צנטריפוגה ב XG 400 עבור 30 דקות ב RT, לא בלם.
    5. לשאוב פלזמה וזורקת.
    6. לשאוב ממשק אטום וטפטף לתוך אמבטיה הנקי 50 מ"לדואר.
    7. הוסף 20 מ"ל של 0.02% EDTA ב-PBS.
    8. צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. בטל supernatant.
    10. הוסף 10 מ"ל של 0.02% EDTA ב-PBS.
  4. ספירת תאים באופן הבא:
    1. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 10 שניות.
    2. קח 200 השעיה μl תא + 300 μl 0.02% EDTA ב PBS + 500 μl של Trypan כחול (200-500 cells/10 ריבועים, אחרת לשנות גורם לדילול).
  5. לבצע בידוד שלילי של מונוציטים כדלקמן:
    1. צנטריפוגה תאים המתקבלים בשלב 3.10 עבור 10 דקות, 120 x גרם. בטל supernatant.
    2. שטוף תא גלולה 2x על ידי הוספת 10 מ"ל של PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם.
    3. הוסף 9 מיליליטר מים סטריליים ל3 שניות, להוסיף 1 מ"ל PBS 10X.
    4. לשטוף פעם נוספת עם PBS + 0.02% EDTA וצנטריפוגות 10 דקות, 120 x גרם.
    5. לסמוך במהלך צנטריפוגה.
    6. לדלל במאגר EasySep ב5 x 10 7 / מ"ל.
    7. הוסף 50 זין העשרת מונוציטים μl / מ"לזנב.
    8. דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    9. חרוזים מערבולת למשך 30 שניות.
    10. הוסף 50 חרוזים μl / מ"ל.
    11. דגירה במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    12. להתמלא בחיץ EasySep כדי להשלים נפח של 2.5 מ"ל. הפתרון עכשיו מופיע חום.
    13. הכניס לתוך מגנט.
    14. חכה 2.5 דקות ב RT. במהלך הזמן הזה התאים שאינם monocytic המאוגדים חרוז המגנטי יעברו לקיר הצינור ולתקוע שם.
    15. יוצקים חיץ עם מונוציטים בלתי מחייבים לתוך צינור סטרילי טרי. פתרון זה נראה לבנבן.
    16. שטפי פעם עם PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם.
  6. פלייט תאים בצלחת פלסטיק או multiwall צלחת בצפיפות של 0.5 x 10 6/2 ס"מ. הוסף 1 מ"ל של תקשורת בתרבות / 1 x 10 6 תאים.
  7. תרבות תאים בתנאים של ריבית עבור 6-14 ימים.
  8. שינוי תקשורת לאחר 3 ימים על ידי החלפת 50% מהתקשורת עם תקשורת טרי (ראה טבלת מס '1 לפרטים נוספים).
  9. לאחר שישה ימים לתאי קציר בידוד mRNA, cytometry הזרימה, מערבי סופג, וכו '.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, באופן שגרתי אנחנו להשיג 25.1 דם x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 מ"ל (שגיאה ממוצעת ± סטנדרטי מ -26 ניסויים בלתי תלויים, איור 1 א). טוהר מונוציטים כפי שנקבע על ידי צביעת תזרים cytometric לCD14 הוא באופן שגרתי יותר מ -95% (97.1 ± 0.4%, סטיית תקן ממוצעת ± מ -3 ניסויים בלתי תלויים, איור 1). כדאיות תא של מונוציטים מבודדים טרי, כפי שנקבע על ידי צביעת trypan הכחולה היא באופן שגרתי יותר מ -95% (נתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים את סוג התא המרכזי של מערכת החיסון המולדת. הם משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות רבות, כולל טרשת עורקים או סרטן 2. לפיכך, לומד ביולוגיה מקרופאג הוא חיוני להעמקת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות ולאפשר פיתוח של טיפולים חדשניים.

מחקרים רבים ליישם מודלים של עכבר overexpressing או חסרי גנים מסוימים של עניין. במקרה של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות, זה נראה לא הדרך הטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא צריכים לחשוף כל ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים Wambsganss נאדין לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם Forschungsgemeinschaft דויטשה (GL599/1-1) ובחלקו על ידי מענק מקרן חדשנות הגבול (אוניברסיטת היידלברג) לחטיבה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
50 מ"ל צינור צנטריפוגה (סטרילי)פישר055398
D-PBS (1X), נוזל (ללא סידן או מגנזיום)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep ערכת העשרת מונוציטים אנושייםStemCell Technologies19059
EasySep מגנטStemCell Technologies18000
צינורות FACSפישר352008
מקרופאג'-SFM (1X)Invitrogen12065-074
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP-4458
נוטרידומה-SPרוש11011375001
אנושי M-CSF 10 μ gPeprotech300-25
צלחות תרבית תאים 6 בארותפישר07-200-80

מקורות

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRLDLM1 M2

מאמרים קשורים