בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

סיכום

הנוזל השדרתי חדרית (CSF) רוחץ את בתאים קליפת מוח neuroepithelial ומוחות במהלך ההתפתחות המוקדמת של מוח בעובר. כאן אנו מתארים שיטה שפתחה לבודד CSF חדרית מעוברים מכרסמים בגילים שונים כדי לחקור הפונקציה הביולוגית שלה. בנוסף, אנו מדגימים נתיחתנו מוחות קליפת מוח explant וטכניקת התרבות שמאפשרת לצמיחת explant עם כמויות מינימאליות של תרבות בינונית או CSF.

תקציר

CSF הוא נוזל מורכב עם Proteome דינמי משתנה לאורך התפתחות ובבגרות. במהלך התפתחות עוברית, CSF המתהווה מבדיל ממי השפיר על סגירתו של הצינור העצבי הקדמי. נפח CSF ואז מגביר את הימים הבאים כבתאים neuroepithelial מרפדים את החדרים ודמו עין המקלעת ליצור CSF. את מגעי CSF העובריים, משטח חדרית האפיקלי של תאי גזע העצביים של המוח המתפתח וחוט שדרה. CSF מספק לחץ נוזל חיוני להרחבת המוח המתפתח ומפיצת צמיחה חשובה לקידום גורמי בתאים עצביים באופן זמני ספציפי. כדי לחקור את תפקידו של CSF, חשוב לבודד דגימות טהורות של CSF העוברי ללא זיהום מדם או רקמות telencephalic פיתוח. כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד דגימות יחסית טהורות של חדרית העוברית CSF שיכולים לשמש עבורמגוון רחב של מבחנים ניסיוניים כולל ספקטרומטריית מסה, אלקטרופורזה חלבון, ותא ותרבות explant העיקרית. אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות explants קליפת המוח על קרומי פוליקרבונט נקבוביים במטרה לגדל רקמת קליפת המוח מתפתח עם נפחים מופחתים של תקשורת או CSF. בשיטה זו, ניסויים יכולים להתבצע באמצעות CSF מגילים או מצבים שונים כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של CSF Proteome על תאי המטרה.

מבוא

CSF הוא נוזל מורכב שרוחץ neuroepithelium פיתוח ^1-6 ומספק ⁷ חיוניים לחץ וקידום צמיחת אותות למוח המתפתח ^8-12. ללמוד CSF במהלך התפתחות מוח, פתחו טכניקות לבודד CSF חדרית מלפתח עוברי חולדה או עכבר במהלך שלבים שונים של פיתוח ^6,9. שיטות קודמות של בידוד כללו שימוש בזכוכית מייקרו מחט ובידוד CSF באמצעות מייקרו הזרקת ^1,2. השיטה שלנו מנצלת כוס טפטפה מייקר נימי טיפ שכבר משך ליצור נקודת ultrafine לחדירת רקמה משופרת. הכוס טפטפה מייקר הנימים מחובר לaspirator כך ניתן לשלוט שבאוסף CSF חדרית עם שינויים עדינים בלחץ. כדי לחקור את ההשפעות של תאי הגזע של אותות CSF, אנו מחלקים explants קליפת המוח, מניחים אותם על קרומי פוליקרבונט, ולהציף אותם במ"ק המתאיםבינוני lture השלים עם דגימות CSF ^9. בעזרת טכניקה זו, נפחים נמוכים של תקשורת מספיקים לתרבות הרקמה, המאפשרים ניצול יעיל של ⁹ CSF.

פרוטוקול

1. בידוד עובר / הכנה

טכניקה זו יכולה לשמש לעכבר או חולדה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים את טכניקת אוסף CSF ונתיחת explant קורטיקלי מוחית במוח העוברי בעכבר. אנחנו נגיב על כל הבדלים חשובים לחולדות לעומת עכברים שקיימים בטכניקות הכלליות. למערכת staging הגיל העוברית, E1 מסווג כיום של התקע לחולדות, וE0.5 מסווג כיום של התקע לעכברים.

1. הכן צלחת מייקר נתיחה עם סיליקון אלסטומר Sylgard. אלסטומר סיליקון Sylgard 184 מסופק כרכיב 2 חלק נוזלי, חלק החלק ב 'חלק א' והחלק ב 'והם מעורבים ב10:01 יחס לפי משקל או נפח. לאחר המרכיבים נוזלים מעורבים, יוצק אלסטומר sylgard לצלחת פטרי כדי לכסות את כל פני השטח של המנה. כמה בועות אוויר יכולות להיות נוכחת שיתפוגגו במהלך תהליך הריפוי. הנח את המכסה בצלחת הפטר ולאפשר elastomאה לרפא. אלסטומר ניתן לרפא בטמפרטורת חדר למשך 24 שעות, או בטמפרטורות גבוהות יותר (למשל 37 מעלות צלזיוס) לריפוי מהיר יותר. ברגע שהרכיבים הנוזליים לחזק, מנת הנתיחה תהיה מוכנה לשימוש. המנה יכולה לשמש שוב ושוב לניסויים מרובים, בתנאי שהוא ניקה היטב לאחר ההליך.
2. הכנת פיפטה מייקר הנימים (מחט). pipettes מייקר נימים שהוכנו על ידי הפעלת חום ולמשוך באמצעות חולץ Narishige PC-10 אנכי micropipette עם ההגדרות הבאות: משיכת צעד אחד; 100 גרם במשקל משיכה; # 2 מוגדרים 58 מחמם. טיפ הקנס של micropipette הוא כיבה בזהירות באמצעות # 55 מלקחיים עדינים. הקוטר הפנימי הממוצע התוצאה של המחט הוא 85 מיקרומטר.
3. הכן את הרכבת aspirator לשאיפת CSF. הכנס מייקר בוכנה מסופקת עם pipettes מייקר נימים לתוך מחט הנימים. לחלופין, לצרף מסנן פלסטיק חד פעמי לסוף הרכבת צינור aspirator שקשורה to פיפטה מייקר הנימים. לדחוף את המחט דרך האטם למקומו בקצה השני של הרכבת aspirator.
4. חזרת עוברים מבודדים מהמלטה לצלחת נתיחת מייקרו מוכן עם Sylgard.
5. הסר את קרומי חוץ עובריים ורקמות, כך שהעובר חשוף באופן ברור. כל רקמת שכבת 1 דופן רחם ולאחר מכן decidua-ניתן גזור באמצעות מספרי iridectomy עדינים (כלי מדע פיין כלומר # 15000-02). בכל אתר השתלה, תחילה על דופן הרחם, אז decidua ניתן חרותה מקבילה לציר הארוך של הרחם, ואז החתך ניתן לפתוח נוסף באמצעות מלקחיים עדינים. Decidua ניתן להסיר לאחר חתך דומה, חושף את הקרומים העובריים. הטיפול צריך להיות למימוש כך שקרום העובר אינו חרות או נקב.
6. לשטוף עם תמיסה סטרילית הנקס מאוזנת מלח (HBSS) ולהסיר עודפי נוזלים מהעובר מקיף באמצעות פיפטה כמו גם kimwipe או מסנןנייר חתוך למשולשים.

2. אוסף CSF חדרית

1. דמיינו עובר מתחת למיקרוסקופ הנתיחה: לעכבר, העובר צריך להיות מונח בצד שלה, כך שכל אחת יש השקפת sagittal של העובר המתפתח. עם עוברי חולדות E16 ומעלה, תציב את העובר בעמוד השדרה הגבה שלה, לאורך הממד מישוריים הארוך ביותר שלה, מגולגולת לכיוון זנב, כאילו עובר שוכב על גבה. באופן זה ניתן לאסוף CSF מחדר לב לרוחב מימין ומשמאל.
2. בהתמדה להכניס את פיפטה מייקר הנימים לתוך חדר הלב לרוחב, חדר לב mesencephalic, או Cisterna magna, מנסה לא ליצור קשר עם תאי neuroepithelial פעם פיפטה הוכנסה. לעוברי עכברים E14.5 או מבוגר יותר, CSF עלול להישאף מהחדר הימני ולאחר מכן הוציאה את המחט ונוספת לחדר השמאלי. בגלל patency של חדרים והצינור העצבי בעוברים הצעירים מן E14.5,נפח CSF כל לעתים קרובות עלול להישאף מחדרי הלב הרוחביים עם החדרת מחט אחת. עם זאת, זה לא תמיד המקרה כפעמים וpatency ההתפתחותיים של חדרי לב החיבור עשויות להשתנות מעט, ולכן, פיפטה מייקר הנימים יכולה גם להיות מוכנסת לתוך Cisterna magna לאסוף נפח CSF המקסימאלי.
3. ברגע פיפטה מייקר הנימים מוכנסת לתוך חדר הלב לרוחב, חדר לב mesencephalic, או Cisterna Magna, בזהירות ובעדינות להתחיל aspirating CSF לתוך פיפטה, תוך השימוש ב-בוכנת מייקרו כדי ליצור לחץ שלילי ולשאוב CSF, או על ידי מתן לחץ שלילי עדין שנוצר על ידי פה כזה שמתחיל בעדינות CSF לזרום לתוך פיפטה מייקר הנימים בצורה איטית ומבוקרת. אנו ממליצים שהצופה בודקת עם הפקידים המקומיים שלהם לגבי מדיניות מוסדית בגישות אלה.
4. המשך להפעיל לחץ שלילי ולאסוף CSF לתוך פיפטה מייקר הנימים.בשני עוברי עכברים ועכברושים של E16.5/E17 או צעיר יותר, ניתן לצפות לקריסת חדר לב במקצת על ידי הופעתו של divot להרכיב על הצד של הראש שפיפטה מייקר הנימים היא פנימה בעוברים מבוגרים, בשל הגודל גדול יותר של המוח, זה לא יכול להיות אפשרי כדי להביט בראש מתמוטט.
5. תפסיק להפעיל לחץ ועדינות להסיר את פיפטה מייקר נימים מאת החדר הצדדי.
6. עדינות לגרש מדגם CSF לתוך צינור אפנדורף שכבר צנן על קרח.
7. המשך איסוף CSF מכל המלטה של ​​בעלי חיים וברכה את הדגימות לאותו הצינור.
8. צנטריפוגה ב -10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר את כל תאים מזהמים.
9. נתח את הדגימות לסימנים של זיהום תאי neuroepithelial או תאי דם אדומים. סימנים של זיהום המופיעים בדרך כלל על ידי הנוזל מופיע מעונן או אדום / ורוד, או הנוכחות של גלולה עם כתם דם נגוע. לאחר צנטריפוגה, CSF ניתן לנתח כל ראיה מיקרוסקופית של תאים או פסולת תאית. אם יש סימנים לזיהום הנוזל אמור להיות מושלך. כבקרה נוספת, תוכן הגלולה עשוי גם להיות מוכתם לתאים. מדגם CSF נקי יכול לשמש לתרבית תאים, תרבות קליפת המוח, ספקטרומטריית, כתם מערבי, ELISA, ומבחנים אחרים. CSF הברור צריך להיות מועבר לצינור אפנדורף סטרילית חדש. המדגם כעת יכול לשמש לניתוח, מסוכם עם דוגמאות אחרות, או צמד קפוא בחנקן נוזלי ואוחסן ב -80 ° C. ההקפאה והפשרה של דגימות קטנות של נוזלים עלולה לגרום לירידת נפח קטן ושינויים בריכוז חלבון. זה יכול להימנע על ידי הקפאת ייבוש הדגימות.

3. Dissection Explant קורטיקלי

1. העברת E14.5 העובר המבודד מהאלונקה אל צלחת נתיחת מייקר מוכן עם Sylgard.
2. הסר עובר מקרומי חוץ עובריים ורקמות כפי שמתואר בשלב 1.5.
3. לשטוף עם תמיסה סטרילית הנקס המאוזן מלח (HBSS) ולהסיר עודפי נוזלים מהעובר מקיף באמצעות פיפטה.
4. לנתח דרך אזור צוואר רחם הפרדת הראש משאר העובר (איור 1 א).
5. שימוש באזמל דק (סכין העינים), לצמצם את קו האמצע של הקרקפת. לתפוס כל צד של חתך זה עם מלקחיים עדינים ולהסיר את העור. בשלב הבא, להשתמש במספרי iridectomy לעשות חתך המפעיל את אורכו של קו אמצע של גולגולת הפיתוח. כתוצאה מכך, להפוך את שני חתכים נוספים, כ 1/3 מהמרחק מהקצוות הקדמיים ואחוריים של גולגולת הפיתוח. השתמש במלקחיים עדינים לתפוס את "כנפיים" של גולגולת שנגרם מחלק זה של הנתיחה, ולהסיר את רקמת גולגולת פיתוח, החושף את קליפת המוח (האיור 1B).
6. שימוש לחצות אזמל המוח לאורך קו האמצע באמצע המטוס sagital, הפרדת ההמיספרות הימנית ושמאלית בקליפת המוח (תרשימים1B, C). פיא והארכניאיד נשארים צמודים לקליפה, והדורה היא הסיר יחד עם גולגולת הפיתוח.
7. הכן את אונה כל קליפת מוח בנפרד. הנח את הצד המדיאלי האונה, כך שאתה יכול לראות את רוממות ganglionic וקליפת המוח המתפתח (איורים 1 ג, ד).
8. שימוש באזמל, עושה חתך בעטרת neuroepithelium הזנב לנורת חוש הריח מתפתח קליפת המוח. חתך זה צריך להתחיל בגבול הקדמי של יואיל הוד ganglionic הרוחבי והמדיאלי, ולהאריך דרך אזור cingulate הקדמי של קליפת מוח גמד פיתוח (האיור 1E).
9. לעשות עוד חתך רק זנב לגבול האחורי של רוממות ganglionic הרוחבית (האיור 1F) עטרה. חתך זה צריך גם להרחיב מהגבול הלטרלי של רוממות ganglionic לקיר המדיאלי של גמד קליפת המוח המתפתח.
10. לחזור בי Crea קליפת המוח "הדש" טד על ידי שני החתכים שנעשו בשלבים 3.7 ו -3.8, באמצעות לחץ אזמל או עדין מזרם של HBSS נמסר עם pipettor μl 200, כדי למנוע ניזק מכאני לקליפת המוח. ואז עושה חתך רוחבי לאורך הגבול המפריד בין רוממות ganglionic רוחב מקליפת המוח המתפתחת (התרשימים 1G, ח). לאחר מכן, לנתח את ההתפתחות ההיפוקמפוס ושולי קליפת מוח של telencephalon המדיאלי, בקודקודו של הניאוקורטקס בי משטח קליפת המוח לרוחב פוגש את קיר interhemispheric.
11. לעשות חתך רוחבי לאורך הגבול המפריד בין רוממות ganglionic רוחב מקליפת המוח המתפתחת (איור 1H).
12. הסר את כל רקמה גזורה נוספת שהיא על צלחת Sylgard מexplant קורטיקלי הגזור. אפשר להשתמש pipetting העדין עם חיץ HBSS טרי לפיפטה את כל רקמה גזורה נוספת. הקליפה הגזורה היא עכשיו עם צד meningeal פונה כלפי מטה (איור 1 ט).

ss = "jove_title"> 4. העברה של Explant קליפת המוח

1. הכן לולאת חוט פלטינה מחוברת לכוס טפטפה. מחמם הכוס טפטפה עם חוט פלטינה מקופלת הוכנס בסוף הכוס טפטפה. על ידי סיבוב סוף לולאת חוט הפלטינה, בגודל של הלולאה ניתן להגדיל או להקטין, והלולאה יכולה להיות בצורה שתתאים לגודל של explant הרצוי. (זה יכול להיות מוכן מראש ושימוש חוזר.)
2. מחמם את קצה חוט הפלטינה לעקר את הלולאה.
3. מבודד explant קורטיקלי הגזור ולהסיר את המדיה HBSS הנוספת על ידי pipetting העדין, משאיר כמות קטנה לשימוש עם לולאת התיל.
4. הנח קרום פוליקרבונט 1 סנטימטר בקוטר 4 סנטימטר צלחת הדמיה.
5. שימוש בצד של לולאת חוט הפלטינה, בעדינות להעיף את הקליפה, כך שצד meningeal פונה כלפי מעלה.
6. הרם explant קליפת המוח את המנה לנתיחה, על ידי נחת explant באמצע הלולאה ושימוש בכוחות הפנימיים להידרוסטטילהרים explant על מישור שטוח.
7. מניח בעדינות את explant על קרום פוליקרבונט, ולהרים את לולאת חוט הפלטינה כזה שexplant נותר על הקרום במישור שטוח עם משטח חדרית יצירת קשר עם הממברנה.
8. רם בעדינות את הקרום ופיפטה μl 50 של CSF או כל מדיה אחרת בקרום.
9. מכסה את תבנית ההדמיה, למקם אותו במכל משני humidified, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 5% ₂ עבור 24 שעות כדי לתמוך בהמשך שגשוג של תאים וצמיחת explant. איור 2 מתאר סכמטי של הכנת התבשיל הסופית קורטיקלי explant.

תוצאות

אוסף CSF אמור להניב נוזל צלול, שקוף. לא צריך להיות שום עדות לזיהום מדם, כפי שהודגם על ידי נוזל אדמדם או צהוב בaspirate ובצינור אפנדורף. גם לא צריך להיות שום ראיות של רקמה בaspirate וצינור אפנדורף. כאשר CSF הוא centrifuged, אפשר גם להעריך את CSF מיקרוסקופי כדי להבטיח שאין זיהום. אם יש סימנים לזיהום, CSF אמור להיות מושלך. מהמלטת 1 E14.5 עכבר, ניתן לחזות איסוף CSF μl 10-15. טבלה 1 מתארת ​​כרכים ממוצעים של CSF שנאספו מגדלי חול ממוצעים בשני העכברים וחולדות בגילים שונים...

דיון

השיטה שתוארה לאוסף CSF חדרית הניבה דגימות יחסית טהורות של CSF העוברי עם הרכב יציב חלבונים ובפעילות עקבית במספר המבחנים סלולריים ^9. עם טכניקה טובה וגודל אוסף המלטה של ​​10 E14.5 עכברים, ניתן לצפות לאיסוף 10-15 μl של CSF, ומהמלטה של ​​E16 חולדות, ניתן לצפות לאיסוף על 50-90 μl של CSF. טכניקה זו מקטינה אוסף זיהום מדם ורקמות, על ידי התבוננות זהירה, צנטריפוגה, והשלכה של דגימות עם כל ראיות של פסולת תאית או גוון דם. נתחנו את הנוזל מיקרוסקופי כדי להעריך למפולת סלולרית או תאים בת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Wiretrop השני מחטי נימים	דראמונד מדעי	# 5-000-2020
Sylgard	דבקי Ellsworth	# 184 SIL Elast ערכה
הרכבת צינור aspirator	סיגמא	# A5177-5EA
מסנן פנוי	נטורי או בית מרקחת מקומי	לא זמין	מסנן סיגריה רגיל
סכין opthalmic Roundstock (15 סכין לדקור את התואר)	עולם מכשירי דיוק, Inc	# 500250
צלחת תרבות 35mm זכוכית תחתית	מאטק קורפ	# P35G-1.5-14-C
חוט הפלטינה אירידיום	Tritech מחקר	# PT-9010-010-3ft
ממברנה Nuclepore מסלול-Etch	Whatman	# 09-300-57
תמיסת מלח מאוזנת הנקס	הפישר סיינטיפיק	# SH30031.FS
מספרי Iridectomy	כלי מדע פיין	# 15000-02