הנוזל השדרתי חדרית (CSF) רוחץ את בתאים קליפת מוח neuroepithelial ומוחות במהלך ההתפתחות המוקדמת של מוח בעובר. כאן אנו מתארים שיטה שפתחה לבודד CSF חדרית מעוברים מכרסמים בגילים שונים כדי לחקור הפונקציה הביולוגית שלה. בנוסף, אנו מדגימים נתיחתנו מוחות קליפת מוח explant וטכניקת התרבות שמאפשרת לצמיחת explant עם כמויות מינימאליות של תרבות בינונית או CSF.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור
במאמר זה
סיכום
תקציר
CSF הוא נוזל מורכב עם Proteome דינמי משתנה לאורך התפתחות ובבגרות. במהלך התפתחות עוברית, CSF המתהווה מבדיל ממי השפיר על סגירתו של הצינור העצבי הקדמי. נפח CSF ואז מגביר את הימים הבאים כבתאים neuroepithelial מרפדים את החדרים ודמו עין המקלעת ליצור CSF. את מגעי CSF העובריים, משטח חדרית האפיקלי של תאי גזע העצביים של המוח המתפתח וחוט שדרה. CSF מספק לחץ נוזל חיוני להרחבת המוח המתפתח ומפיצת צמיחה חשובה לקידום גורמי בתאים עצביים באופן זמני ספציפי. כדי לחקור את תפקידו של CSF, חשוב לבודד דגימות טהורות של CSF העוברי ללא זיהום מדם או רקמות telencephalic פיתוח. כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד דגימות יחסית טהורות של חדרית העוברית CSF שיכולים לשמש עבורמגוון רחב של מבחנים ניסיוניים כולל ספקטרומטריית מסה, אלקטרופורזה חלבון, ותא ותרבות explant העיקרית. אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות explants קליפת המוח על קרומי פוליקרבונט נקבוביים במטרה לגדל רקמת קליפת המוח מתפתח עם נפחים מופחתים של תקשורת או CSF. בשיטה זו, ניסויים יכולים להתבצע באמצעות CSF מגילים או מצבים שונים כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של CSF Proteome על תאי המטרה.
מבוא
CSF הוא נוזל מורכב שרוחץ neuroepithelium פיתוח 1-6 ומספק 7 חיוניים לחץ וקידום צמיחת אותות למוח המתפתח 8-12. ללמוד CSF במהלך התפתחות מוח, פתחו טכניקות לבודד CSF חדרית מלפתח עוברי חולדה או עכבר במהלך שלבים שונים של פיתוח 6,9. שיטות קודמות של בידוד כללו שימוש בזכוכית מייקרו מחט ובידוד CSF באמצעות מייקרו הזרקת 1,2. השיטה שלנו מנצלת כוס טפטפה מייקר נימי טיפ שכבר משך ליצור נקודת ultrafine לחדירת רקמה משופרת. הכוס טפטפה מייקר הנימים מחובר לaspirator כך ניתן לשלוט שבאוסף CSF חדרית עם שינויים עדינים בלחץ. כדי לחקור את ההשפעות של תאי הגזע של אותות CSF, אנו מחלקים explants קליפת המוח,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בידוד עובר / הכנה
טכניקה זו יכולה לשמש לעכבר או חולדה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים את טכניקת אוסף CSF ונתיחת explant קורטיקלי מוחית במוח העוברי בעכבר. אנחנו נגיב על כל הבדלים חשובים לחולדות לעומת עכברים שקיימים בטכניקות הכלליות. למערכת staging הגיל העוברית, E1 מסווג כיום של התקע לחולדות, וE0.5 מסווג כיום של התקע לעכברים.
- הכן צלחת מייקר נתיחה עם סיליקון אלסטומר Sylgard. אלסטומר סיליקון Sylgard 184 מסופק כרכיב 2 חלק נוזלי, חלק החלק ב 'חלק א' והחלק ב 'והם מעורבי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אוסף CSF אמור להניב נוזל צלול, שקוף. לא צריך להיות שום עדות לזיהום מדם, כפי שהודגם על ידי נוזל אדמדם או צהוב בaspirate ובצינור אפנדורף. גם לא צריך להיות שום ראיות של רקמה בaspirate וצינור אפנדורף. כאשר CSF הוא centrifuged, אפשר גם להעריך את CSF מיקרוסקופי כדי להבטיח שאין זיהום. אם יש סימנים לזיהום, CSF אמור להיות מושלך. מהמלטת 1 E14.5 עכבר, ניתן לחזות איסוף CSF μl 10-15. טבלה 1 מתארת כרכים ממוצעים של CSF שנאספו מגדלי חול ממוצעים בשני העכברים וחולדות בגילים שונים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה שתוארה לאוסף CSF חדרית הניבה דגימות יחסית טהורות של CSF העוברי עם הרכב יציב חלבונים ובפעילות עקבית במספר המבחנים סלולריים 9. עם טכניקה טובה וגודל אוסף המלטה של 10 E14.5 עכברים, ניתן לצפות לאיסוף 10-15 μl של CSF, ומהמלטה של E16 חולדות, ניתן לצפות לאיסוף על 50-90 μl של CSF. טכניקה זו מקטינה אוסף זיהום מדם ורקמות, על ידי התבוננות זהירה, צנטריפוגה, והשלכה של דגימות עם כל ראיות של פסולת תאית או גוון דם. נתחנו את הנוזל מיקרוסקופי כדי להעריך למפולת סלולרית או תאים בת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו אסירי תודה לתמיכה מ-NIH (מספרי הפרס R00 NS072192 לMKL, HD029178 לAS.L., ו 2 RO1 NS032457 לCAW). MKL הוא הנמען של מלגה בבית החולים לילדים בבוסטון פיתוח קריירת המלגה / הספר לרפואת הארוורד שור ועמית פ אלפרד סלואן הקרן. CAW הוא חוקר של הווארד יוז הרפואי במכון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב / חומרים | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| Wiretrop השני מחטי נימים | דראמונד מדעי | # 5-000-2020 | |
| Sylgard | דבקי Ellsworth | # 184 SIL Elast ערכה | |
| הרכבת צינור aspirator | סיגמא | # A5177-5EA | |
| מסנן פנוי | נטורי או בית מרקחת מקומי | לא זמין | מסנן סיגריה רגיל |
| סכין opthalmic Roundstock (15 סכין לדקור את התואר) | עולם מכשירי דיוק, Inc | # 500250 | |
| צלחת תרבות 35mm זכוכית תחתית | מאטק קורפ | # P35G-1.5-14-C | |
| חוט הפלטינה אירידיום | Tritech מחקר | # PT-9010-010-3ft | |
| ממברנה Nuclepore מסלול-Etch | Whatman | # 09-300-57 | |
| תמיסת מלח מאוזנת הנקס | הפישר סיינטיפיק | # SH30031.FS | |
| מספרי Iridectomy | כלי מדע פיין | # 15000-02 |
מקורות
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
