תאיים Ca 2 + דינמיקה הן חשובה מאוד בפיזיולוגיה של זרע וCa 2 + רגישים צבעי ניאון מהווים כלי תכליתי ללמוד אותם. ניסויי אוכלוסייה (fluorometry ועצר fluorometry זרימה) וניסויים תא בודדים (cytometry זרימה והדמיה תא יחידה) נמצאים בשימוש כדי לעקוב אחר מרחב ובזמן [Ca 2 +] שינויים בתאי זרע אנושיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי זרע הם תאי הרבייה של גבר שתוכננו במיוחד כדי להגיע אליו, להכיר ופתיל עם הביצה. כדי לבצע משימות אלה, חייבים להיות מוכנים להתמודד עם תאי זרע סביבה משתנה כל הזמן ולהתגבר על כמה מחסומים פיסיים. להיות במהות התעתיק וtranslationally השקט, ניעתי התאים הללו מסתמכים עמוקות על מנגנוני איתות מגוונים להתמצא ולשחות באופן מכוון, ולהתמודד עם תנאי סביבה מאתגר במהלך מסעם למצוא את הביצה. בפרט, Ca 2 + איתות בתיווך היא מרכזית עבור מספר פונקציות זרע: הפעלה של תנועתיות, capacitation (תהליך מורכב שמכין את הזרע לתגובת acrosome) ותגובת acrosome (אירוע exocytotic המאפשר היתוך זרע ביצית). השימוש בצבעי ניאון כדי לעקוב אחר תנודות תאיות של יון זה הוא בעל חשיבות יוצאת דופן בשל קלות יישום, רגישותם, ורבגוניות של Detection. שימוש בפרוטוקול לצבוע טעינה אחת בודד אנו מנצלים ארבע טכניקות שונות כדי לעקוב אחר fluorometric זרע Ca 2 + דינמיקה. כל טכניקה מספקת מידע ייחודי המאפשר רזולוציה מרחבית ו / או זמנית, שהניבו נתונים הן בתא בודד ורמות אוכלוסיית תא.
מבוא
Ca 2 + הוא שליח שני אוניברסלי של מסלולי העברת אותות בתאים אוקריוטים. תאיים Ca 2 + (Ca 2 + I) משתתף בוויסות של תהליכים פיסיולוגיים בסיסיים רבים בתאים גם להתרגש ולא להתרגש. את החשיבות ואת האוניברסליות של Ca 2 + כשליח שני במהלך אירועי העברת אותות נגזרת מרבגוניות מרחב ובזמנה בהעברת המידע בתוך התא. בעוד Ca 2 + לא יכול להיות מסונתז דה נובו או מושפל בתוך התא, הריכוז תאי שלו ([Ca 2 +] i) נשמר בגבולות מאוד נוקשים באמצעות מנגנונים שונים הסלולר כי ברציפות חיץ, לעקל, למדר, ו / או לצבור Ca 2 +. שינויים בריכוז של יון זה יכול להתרחש באז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במאמר זה אנו מדווחים על השימוש בארבע הטכניקות למדידה הנ"ל [Ca 2 +] אני שינויים בתאי זרע אנושיים. אנחנו השתמשנו פרוגסטרון כדי לעורר Ca 2 + תגובה, כפי שהיא מבוססת היטב כי זה מייצר סטרואידים חולפים [Ca 2 +] אני מגדיל בתאי הזרע. במיוחד, בזרע אנושי, פרוגסטרון ישירות מפעיל Ca 2 + ערוץ (כלומר CatSper) הביע באופן בלעדי בקרום הפלזמה של תאי זרע 10,11. כמו כן, אנו נמדדים במנוחה [Ca 2 +] אני לפני ואחרי capacitation בהתחשב בעובדה שהוא גם מקובל כי עלייה ב[ Ca 2 +] אני מתרחש במהלך capacitation. לטכניקות הדורשות שליטה חיובית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1. תרשים סכמטי של פרוטוקול הניסוי להכנת דגימת זרע בשיטה בברכה. את השלבים העיקריים להפרדת הזרע נעימה ולהתאמה של הריכוז שלהם באים לידי ביטוי. שלב הדגירה האחרון מתבצע רק כאשר נדרש capacitation.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
האיתות תאית חיונית לפעילות הסלולר ביותר, Ca 2 + הוא שליח בכל מקום שמלווה את תאי יונקים לאורך כל תוחלת החיים שלהם, ממוצאם בהפריה, לסוף מחזור החיים שלהם. בתגובה לגירויים שונים, [Ca 2 +] אני מגביר, oscillates וקטן עם הקודיפיקציה מרחב ובזמן, ובהתאם, תהליכים מגוונים מופעלים, מווסת או הופסק על ידי Ca 2 + הודעות מקודדות. תאיים Ca 2 + דינמיקה הן חשובה מאוד בפיזיולוגיה של זרע, כיון זה הוא מעורב בתזמור מורכב של תהליכי העברת אותות. ידיעה כזו Ca
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
המחברים מודים חוזה לואיס דה לה וגה, אריקה Melchy וד"ר טאקויה Nishigaki לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-מקסיקו) (99,333 128,566 ולCT); Dirección גנרל דה Asuntos דל האישי Académico / האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של דה מקסיקו (IN202212-3 לCT).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ham's F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| בקר סרום אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A-7906 | |
| סידן כלוריד דיהידראט כ. 99% | סיגמא-אולדריץ' | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 בקבוקונים/50 μ גרם כל |
| אחד יונומיצין | אלומון | I-700 | |
| פרוגסטרון | סיגמא-אולדריץ' | P0130 | |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | S-9888 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P-3911 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| נתרן ביקרבונט | JT בייקר | 3506 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| מגנזיום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | M-2670 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| סידן כלוריד נטול מים | סיגמא-אולדריץ' | C-1016 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| D-גלוקוז | JT Baker | 1906-01 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי מדיום (HSM) |
| נתרן פירובט | סיגמא-אולדריץ' | P-2256 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| נתרן L-לקטט (כ-99%) | סיגמא-אולדריץ' | L-7022 | ריאגנטים למדיום זרע אנושי (HSM) |
| פרופידיום יודיד | Invitrogen | L-7011 | רכיב B |
| טריטון X-100 (t-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול) | תמיסת סיגמא-אולדריץ' | X-100 | 2.4 מ"מ במים |
| כיסוי עגול | VWR | 48380 080 | קוטר 25 מ"מ |
| תמיסת פולי-L-ליזין | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| מנגן כלוריד | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; תא תאים, למיקרוסקופיה | טכנולוגיות חיים | A-7816 | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | D2650 | 5x5 מ"ל |
מקורות
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
