מאמר שיטה

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

35.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50356

⸱

11 ביוני 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Application Development, Akonni Biosystems, Inc., 2Manufacturing, Akonni Biosystems, Inc., 3Engineering, Akonni Biosystems, Inc., 4Research & Development, Akonni Biosystems, Inc.

במאמר זה

סיכום

TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. כתוצאה מכך, את תבנית הכנת המדגם תואמת למכשירי טיפול הנזילים ביותר, וניתן להשתמש בו למדיום רבים ליישומים קליניים תפוקה גבוהה וסוגי מדגם.

תקציר

TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה ​​נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. הגיאומטריה של מונולית יכולה להיות מותאמת לטיפים פיפטה ספציפיים הנעים בנפח 1.0-5.0 מ"ל. הנקבוביות הגדולה של מונולית מאפשר דגימות צמיגות או מורכבות בקלות לעבור דרכו עם backpressure fluidic מינימאלי. זרימה דו כיוונית למקסימום זמן מגורים בין מונולית והמדגמת, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים להיות מעובד בתוך TruTip אחת. את הצעדים הבסיסיים, ללא קשר לנפח דגימה או הגיאומטריה TruTip, כוללים תמוגה תא, חומצות גרעין מחייבים את הנקבוביות הפנימיות של מונולית TruTip, שטיפת רכיבי מדגם מאוגד וחוצצי תמוגה, ומשחררי חומצות גרעין מטוהרים ומרוכזות במאגר מתאים. את התכונות וההתאמה של TruTip הם הפגינו בשלושה פרוטוקולי עיבוד מדגם קליניים אוטומטיים באמצעות epMotion Eppendorf 5070, המילטון STAR ורובוטים טיפול נוזל STARplus, כוללים בידוד RNA מן לשאוב אף ולוע, בידוד הדנ"א הגנומי מדם כולו, ומיצוי DNA עוברי והעשרה מכמויות גדולות של פלזמה אימהית (בהתאמה).

מבוא

טיהור חומצות גרעין היא הכרחית לאבחון המולקולרי ביותר, מחקר משתמש רק, ויישומים במדעי חיים. גישות שונות התפתחו מאז ימיו של עקירות פנול / כלורופורם, שרבים מהם מבוססים על עיקרון היסוד של חומצות גרעין מחייבים לסיליקה בנוכחות מלחי chaotropic 1. תהליך החילוץ התייעל ואוטומטי באמצעות השימוש בפורמטים מבוססי קרום חרוז ושונים, עם מסנני ספין מגנטיים, חרוזים וגישות הקשורות שולטות בתעשיית מדעי החיים (ראה דוגמאות ב2-13). אמנם יעיל, חלקיקים וקרומים ידעו מגבלות כאשר התעמתו עם מטריצות קליניות מאתגרות. לדוגמה, קרומים ועמודות מבוססות חרוז תואמים, יש לי גודל נקבובית קטן (ובכך, גב לחצים גבוהים), ודורש איזה סוג של תמיכה כדי להיות מעובד על ידי מערכת צנטריפוגות או ואקום. המאפיינים הפיסיים של קרומים ותוצאת עמודות בחרוזהתנגדות fluidic משמעותית, אשר מגבילה את הסוג של דגימות שניתן לעבד בצורה יעילה ללא סתימה מתכלה, ו / או נפח הדגימה הכולל (קלט) שיכול להיות חד כיוונית מעובד דרך נתיב הזרימה. לעומת זאת, חלקיקים מגנטיים חייבים להיות מופצים בכל רחבי המדגם על ידי תסיסה. צריך להפיץ חלקיקים מגנטיים homogenously במסגרת פתרון מגביל את נפח דגימת הקלט הכולל שיכול להיות מעובד עם חומרים מתכלים חרוז מגנטי ביותר. תכונות לדוגמה קליניות (כגון צמיגות או מורכב) יכולות להוביל לריכוז חלקיקים מגנטיים לא יעיל בצד של צינור או מוט. בנוסף, סיליקה חלקיקים זעירים יכולים לשבור את של החרוזים בתהליך החילוץ, מאבדים את המגנטיזציה שלהם ומזהמים את המדגם הסופי.

טכנולוגית TruTip פותחה כדי להתגבר על חלק מאילוצים אלה חומצות גרעין מדגם העיבוד ומגבלות 14. על ידי הטבעת מונולית נקבובית בתוךפיפטה קצה, backpressure fluidic הוא הוריד, המאפשר בקרת זרימה על ידי ואקום (כלומר שאיפת פיפטה). תכונה זו מאפשרת את תהליך החילוץ והמכשור הנדרש כדי לטהר את חומצות גרעין מסוגי מדגם קשים להיות פשוטים מאוד (איור 1). הגיאומטריה והנקבובית של מונולית מותאמת כדי למזער את סתימה, ואילו העובי של מונולית מספק קיבולת כבילה מספיק חומצות גרעין לכרכי מדגם נעים 1.0-5.0 מ"ל. זרימה דו כיוונית בזמן שאיפת מדגם והניפוק מאפשרת פעמים מגורים ממושכות בין תמצית המדגם ומונולית מחייבת להתאוששות חומצות גרעין יעילה וelution, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים יחסית לעיבוד שתעלה את קיבולת הנפח של קצה פיפטה עצמו. אנחנו דיווחו על הפיתוח והיישום של הליך TruTip ידני לטיהור RNA שפעת מדגימות אף ולוע באמצעות ראי חד או רב ערוצים בעברנין pipettor 15. יעילות מיצוי מקבילה התקבלו בין אוטומטי QIAcube ושיטות TruTip הידניות ב 10 6 עותקי גן שפעת מ"ל לשאוב לאף ולוע. מטרת המחקר הייתה להדגים כיצד מתבצע פעולות לטווח בינוניות ותפוקה גבוהה, אוטומטיות TruTip חומצות גרעין לטיהור לשאוב אף ולוע (רשות טבע וגנים) וסוגי מדגם רלוונטיים קליני אחרים, שימוש ברובוטי טיפול נוזל נמצאים בדרך כלל בהתייחסות למעבדות קליניות.

פרוטוקול

שלושה פרוטוקולי חילוץ TruTip אוטומטיים מתוארים והפגינו כאן: 1) חילוץ בינוני תפוקת RNA מן רשות טבע והגנים בepMotion Eppendorf 5070, 2) מיצוי DNA גנומי תפוקה גבוהה מכמויות נמוכות של דם כולו על כוכב המילטון, ו3) בידוד סלקטיבית והעשרה של ה-DNA העוברי המקוטעת מכמויות גדולות של פלזמה אימהית על STARplus המילטון. סקריפטים אוטומטיים זמינים Akonni ורק מתארי תכנית ברמה גבוהה ניתנים כאן. החומרים הכימיים וחילוץ elution הם חילק באופן אוטומטי משקתות מגיב בתפוצה רחבה לצלחות 96, גם על ידי סקריפט האוטומטי (ים) לפני הדגימות הקליניות מעובדות.

1. הפקה אוטומטית של RNA מן לשאוב אף ולוע

שיטת TruTip הידנית שתוארה קודם לכן 15 כעת הותאמה לרוץ על רובוט טיפול נוזלי Eppendorf epMotion 5070, תוך שימוש במטריצת TruTip נקבובית גדולה משובצת ב1.0 מ"ל אפנדורף צינורטטי טיפים, צלחת עמוקה 2 מ"ל היטב (ארה"ב המדעית), חומרים כימיים חילוץ TruTip Akonni, ורשות טבע וגנים כסוג המדגם. רובוט הטיפול הנוזלי epMotion 5070 מחזיק עד 8 טיפים בו זמנית, כך שפרוטוקול אוטומטי בסיסי הוא תוארו ל8 עקירות מקבילות. עם זאת, יכולות להיות מעובד עד 24 דגימות במהלך תכנית אחת בצלחת אחת מדגם 96, גם עמוק היטב. תכנית epMotion נפרדת זמינה (וחובה) על מנת לעבד את 16 או 24 דגימות. הפרוטוקול המפורט להלן הוא עבור תסריט אוטומטי 8 מדגם.

התקנה

  1. להביא לRT דגימות אף ולוע לפני התחלת ההפקה.
  2. לוותר לשאוב 100 μl אף ולוע בתוספת 150 nuclease ללא מים μl לעמודת 1 של צלחת המדגם (איור 2 א).
  3. מניחים את הצלחת לתוך מדגם B1 העמדה על שולחן העבודה epMotion (איור 2).
  4. טיפים מקום פיפטה, TruTips ושקתות 30 מ"ל מגיב על Worktab epMotion שלהם בהתאמהעמדות le (איור 2b).
  5. פתח את תוכנת epBlue אפנדורף, בחר את קובץ הפעלה שסופק על ידי Akonni במשך 8 דגימות, ולטעון את השיטה על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה על כרטיסיית ההפעלה.
  6. תחת הגדרות חיישן רמה, בחר רמות וטיפים, ולחץ על כפתור ההפעלה.
  7. קלט נפח הדגימה לתוכנה ולחץ על הפעלה.
  8. תסריט epMotion ינחה את המשתמש להוסיף חומרים כימיים וחילוץ elution למאגרים מגיב ממוקמים בB2 העמדה על שולחן העבודה. הוסף את הכרכים המומלצים של כל אחד מגיב לשוקת, בהתאמה. במשך 8 דגימות, הכרכים מגיב המינימום הם:
מגיב נפח (מ"ל) מיקום שוקת
95% אתנול 3.5 2
שטוף הצפת D 9.0 3
שטוף E הצפת 9.0 4
Elution הצפת A2 1.3 5
תמוגה ועקידת הצפת D 11.0 6
  1. קלט הכרכים מגיב לטבלה שהוצגה על ידי תוכנת epMotion במהלך ההנחיה מהשלב 8 לעיל. ערך הקלט צריך לשקף את הנפח בפועל של חיץ לוותר על ידי משתמש לכל מאגר מגיב בהתאמה, והוא חייב להיות גדול או שווה להיקפי המינימום שצוינו לעיל. ערכי נפח שגויים עלולים לגרום לכמויות שגויות מועברות על ידי חומרת epMotion על צינור אחד או גם בצלחת 96 היטב (ים).

תכנית אוטומטית

  1. בחר הפעל כדי להתחיל בשיטה האוטומטית. סקריפט אוטומטי יעבור דרך השלבים הבאים ללא התערבות משתמש:
    תמוגה מדגם והפצה מגיב:
    1. לוותר תמוגה μl 375 הצפת D לעמודה 1 ולערבב במשך 10מחזורים (apirate + לוותר = מחזור 1). צעד זה מתחיל את תהליך הדגירה תמוגה בעוד ריאגנטים הנותרים aliquotted.
    2. לוותר על 1.6 מיליליטר שטפי הצפת D לעמודה 2.
    3. לוותר על 1.6 E הצפת לשטוף מ"ל לעמודה 3.
    4. לוותר על 50 ההצפה elution μl לעמודה 4.
    5. השהה במשך 6 דקות כדי להשלים את הדגירה מדגם 10 דקות במאגר תמוגה ד
    6. הוסף 375 אתנול μl היטב כל אחד בטור 1, ערבוב כל דגימה עם אתנול באמצעות 10 מחזורי pipetting.
    הפקה:
    1. טען 8 TruTips מ-A2 העמדה על שולחן העבודה, ולהתחיל בתהליך החילוץ שמתואר באיור 1.
    2. לשאוב ולוותר על מדגם / תערובת חיץ / אתנול תמוגה מעמודת 1 של צלחת המדגם במשך שבעה מחזורים כדי לאגד את חומצות גרעין למונולית TruTip. למרות זרימת מדגם דרך TruTip עשויה להשתנות (בשל הבדלים בצמיגות מדגם קליני), תשואת חומצות גרעין לדוגמה אלה לא הייתהלא הושפע משינוי הזרימה. אפשרויות לשיפור זרימת מדגם מתוארות בדיון.
    3. הזז TruTips למדגם עמודת צלחת 2, ומחזור כביסת הצפת D 5x על מונולית להסיר חיץ תמוגה שייר ומטריצת מדגם.
    4. הזז TruTips למדגם עמודת צלחת 3, ומחזור E הצפת לשטוף 5x על מונולית להסיר חלבונים ומזהמים אחרים מחומצות הגרעין המאוגדת.
    5. הזז TruTips לעמדה הריקה מגיב מאגר 1 (B2 במיקום שולחן עבודה) והמחזור 80x (בקצב זרימה מהיר) לייבוש מונולית. חשוב לייבש את TruTip ביסודיות, כממסים שיורית בהכנות חומצות גרעין eluted ישפיעו לרעה על אנזימים כגון רברס טרנסקריפטאז ופולימראז ה-DNA תקי.
    6. הזז TruTips למדגם 4 עמודת צלחת ומחזור 5x בא הצפת elution חומצות גרעין חילוץ וטיהר כעת במאגר elution בעמודות לדוגמה 4 בארות צלחת.
    7. הוצא TruTips לפח האשפה epMotion.
    8. כאשר התכנית תושלם, להסיר באופן ידני את צלחת הדגימה מהמכשיר ולהעביר את חומצות גרעין מטוהרת לצינורות חדשים לאחסון לטווח ארוך או לשימוש נוסף. משתמשים מתקדמים יכולים להוסיף epMotion הוראות לקובץ הפעלה כדי להעביר את דגימות eluted לתוך צינורות אחסון נפרדים או צלחות PCR, אם תרצה בכך.

התכנית לכלל 16 דגימות תהיה לחזור על שלבים 10.1 10.13 באמצעות שימוש בעמודות צלחת מדגם 5-8. לתכנית 24 המדגם, על השלבים 10.1 דרך 10.13 חוזרים 2x באמצעות מדגם עמודות צלחת 5-8 ו9-12, בהתאמה.

2. הפקת הדנ"א הגנומי 96, גם מדם מלא

רובוט טיפול נוזלי המילטון STAR משמש כדי להדגים חילוץ אוטומטי של 96 דגימות בו זמנית מכל דם. המילטון STAR שונה ממערכת epMotion שבתנור אופציונלי / יחידה שייקר זמין על הסיפון, שהוא חשוב לעיכול אנזימטי של clini מסויםמטריצות cal, כגון דם כולו. כי יכולה להיות מצוידת במערכת עם ראש פיפטה 96 ערוצים, יש 96 גם צלחת ייעודית לכל אחד משלבי TruTip והחומרים הכימיים.

התקנה

  1. הפעל את מכשיר STAR ומחשב.
  2. פתח את תוכנת בקרת הפעלת המילטון.
  3. פתח את קובץ הפעלה שסופק על ידי Akonni למשך 96 דגימות.
  4. מעבדתי מקום על סיפון STAR כפי שמוצג באיור 3.
  5. לוותר ריאגנטים לשקתות המקבילות שלהם (כרכים לציין את המינימום הנדרש כדי לעבד 96 דגימות):
מגיב נפח (מ"ל) מיקום שוקת
F המאגר תמוגה ועקידה 75 5
95% אתנול 100 6
שטוף המאגר J 175 7
לשטוףחיץ K 175 8
Elution הצפת A2 12 9
Proteinase K (20 מ"ג מ"ל -1) 8 15

6. לאפשר דגימות לאזן לRT.

7. מניחים את הצינורות לדוגמה במדפי Carrier (לדוגמא עמדת סיפון 4 באיור 3). מקום 1 לדוגמה בחלקו האחורי של מוביל השמאל קיצוני ולעבור ברצף את כל אחד מהמובילים בסוף לדוגמא 96 בעמדה הקדמית הימנית.

תכנית אוטומטית

  1. בחר בלחצן לשחק בפינה השמאלית העליונה של חלון קובץ הפעלה והקלט במספר הדגימות שעובדו. לאחר מכן הסקריפט האוטומטי יעבור דרך השלבים הבאים ללא התערבות משתמש:
    תמוגה מדגם והפצה מגיב
    1. העברת 200 μl מצינור אחד מדגם לצלחת הדגירה בעמדה 14 בואטר / ייקר מודול (איור 3).
    2. לוותר על 80 K proteinase μl לכל דגימה היטב של צלחת הדגירה.
    3. לוותר על 600 F מאגר תמוגה μl לבאר כל צלחת הדגירה.
    4. מערבבים את הפתרון במשך 10 מחזורים, ולאחר מכן דגירה של 20 דקות בשעה 70 ° C ו 500 סל"ד. את 70 ° C הטמפרטורה להגדיר תוצאות ב~ 60 ° C טמפרטורת מדגם בתוך הצלחת גם העמוקה, הנמצאת בטווח של פעילות K proteinase. בעוד דגימות דוגרים, מערכת הטיפול הנוזלית ממשיכה הפעלה על ידי מחלק ריאגנטים לתוך הצלחות והבארות המקבילות שלהם:
      • 100 ההצפה elution μl לבאר כל הצלחת גם העמוקה בעמדה 13.
      • 800 אתנול μl לבאר כל הצלחת גם העמוקה בעמדה 10.
      • 1.6 K הצפת לשטוף מ"ל לבאר כל הצלחת גם העמוקה בעמדה 12.
      • 1.6 J הצפת לשטוף מ"ל לבאר כל הצלחת גם העמוקה בעמדה 11.
    5. לאחר הדגירה דקות 20, תערובת המדגם מועברת מצלחת הדגירה לצלחת גם העמוקה בעמדה 10, ומעורב עד 12 מחזורי pipetting.
    6. הוצא טיפים מגיב לפח האשפה.
      הפקה
      חלק זה של הליך gDNA הדם דומה מאוד לפרוטוקול שפעת epMotion, פרט להרכב של חומרים כימיים לשטוף ומספרי מחזור. את עצות TruTips המילטון הן שחורות, ולכן זרימת נוזלים דרך TruTip אינה נראית לעין.
    1. טען 96 TruTips מתפקיד סיפון 3.
    2. לשאוב ולוותר על המדגם / תערובת חיץ / אתנול תמוגה בתנוחה 10 במשך 10 מחזורים לנקלטים חומצות גרעין למונולית TruTip.
    3. הזז TruTips למקם 11 והמחזור J הצפת לשטוף 5x על מונולית להסיר חיץ תמוגה שייר ומטריצת מדגם.
    4. הזז TruTips למקם 12 והמחזור K הצפת לשטוף 5x להסיר חלבונים ומזהמים אחרים מחומצות הגרעין המאוגדת.
    5. מחזור TruTip 40x במהירות גבוהה לייבוש באוויר.
    6. הזז TruTips לעמדה 13 ומחזור 5x בA2 הצפת elution. חומצות גרעין חילוץ ומטוהרות נמצאת כעת במאגר elution בצלחת גם העמוקה.
    7. הוצא TruTips לפח האשפה.

כאשר התכנית תושלם, להסיר את צלחת Elution מהמכשיר ולהעביר את הדגימות תחולצנה לצינורות המתאימים לאחסון או יישומים במורד הזרם.

3. הפקת DNA מדגימות פלזמה נפח גדולות

מכשיר STARplus המילטון משמש כדי להדגים פרוטוקול אוטומטי לחילוץ באופן חופשי במחזור ה-DNA עוברי מ5 מ"ל של פלזמה אימהית. המערכת יכולה לתמוך STARplus שתי זרועות ערוץ פיפטה אוטומטיות, אחד עם 8 ערוצים 5 מ"ל ואחד עם 8 ערוצי x 1 מ"ל. זרועות אלה יכולות לפעול במקביל לעיבוד מעד בקבוצות של 8 דגימות כל אחד. TruTip 5 מ"ל משמש לליטר הראשוניחילוץ Arge בנפח, וTruTip 1 מ"ל משמש להפרדת גודל וריכוז נוסף של חומצות גרעין החילוץ.

ההגדרה

  1. הפעל את המכשיר ומחשב STARplus.
  2. פתח את תוכנת בקרת הפעלת המילטון.
  3. פתח את קובץ הפעלה שסופק על ידי Akonni במשך 8 דגימות פלזמה בנפח גדולות.
  4. מעבדתי מקום על סיפון STARplus כפי שמוצג באיור 4.
  5. לוותר ריאגנטים לתוך המאגרים המקבילים שלהם:
מגיב נפח (מ"ל) מיקום שוקת
CN-W1 17 5A
CN-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
Proteinase K (20 מ"ג מ"ל -1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 6C
CN-W3 5 6 ד '
CN-B2 5 6E
CN-B3 5 6F
CN-L1 52 7
CN-B1 175 8
  1. אפשר לדוגמה כדי לאזן לRT.
  2. מניחים את הצינורות לדוגמה במדפי Carrier (לדוגמא עמדת סיפון 3 באיור 4). מקום 1 לדוגמה בחלקו האחורי ולעבור ברצף לכיוון החלק הקדמי של הסיפון.

תכנית אוטומטית

בגלל נפח דגימת הקלט הגדול, יש לבצע את הפעולות תמוגה ואת המגון של מכשיר STARplus המילטון באמבט מים. צעדים הדורשים התערבות של משתמש בפרוטוקול האוטומטי מסומנים בכוכבית (*) בbeginninגרם של גזר הדין, והאותיות מודגשות.

תמוגה מדגם והפצה מגיב: מדגם מודגרות עם proteinase K ומאגר תמוגה לhomogenize המדגם ושחרר את ה-DNA.

  1. בחר בלחצן לשחק בפינה השמאלית העליונה של חלון קובץ הפעלה. הזנת מספר הדגימות בטיפול, המיקום של טיפים פיפטה על הסיפון, ואת מיקומו של TruTips על הסיפון.
  2. סקריפט אוטומטי מוסיף 615 μl proteinase K, 5 מיליליטר פלזמה, ו6.2 תמוגה מאגר CN-L1 מ"ל לכל צינור חרוטי 50 מ"ל, ולאחר מכן ישהה.
  3. * הסירו את צינורות חרוטי 50 מ"ל מסיפון המדגם, המערבולת למשך 30 שניות במהירות גבוהה, ודגירה לא מחובר למשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או גוש חום. אחרי שצינורות החרוטים יוסרו מן סיפון המילטון, לחדש את התסריט האוטומטי להמשיך מחלק ריאגנטים לתוך הצלחות והבארות (איור 4 ו4C) שלהם:
    • 2 מיליליטר CN-W1 לכל גם אחרים בעמדה 9 עמודה 1.
    • 2 מיליליטר CN-W2 לכל גם אחרים בעמדה 9 עמודה 2.
    • 2 מיליליטר CN-W4 לכל גם אחרים בעמדה 9 עמודה 3.
    • 250 EBA2 μl לכל גם אחרים בעמדה 9 עמודות 4 ו -5.
    • 495 CN-B2 μl לכל גם אחרים בעמדה 10 עמודה 1.
    • EBB 1 מ"ל לכל גם אחרים בעמדה 10 עמודה 2.
    • 500 CN-W3 μl לכל גם אחרים בעמדה 10 עמודה 3.
    • 500 CN-W4 μl לכל גם אחרים בעמדה 10 עמודה 4.
    • 50 EBA2 μl לכל גם אחרים בעמדה 10 טור 5.

בגלל 5 ערוצי מ"ל הם רחב מדי לשימוש בארות סמוכות לכל דגימה, ריאגנטים dispenses התכנית האוטומטיים לכל גם שני של הצלחת גם העמוקה בסיפון עמדה 9. הזרוע מכאנית המשמשת לערוצי 1 מ"ל גם דורשת שימוש בכל היטב אחרים בצלחות מגיב להדרה והריכוז stEPS של הפרוטוקול.

לאחר ריאגנטים מחלק, התכנית תושהה.

  1. * לאחר 30 דקות, 60 ° C דגירה, למקם את צינורות חרוטי 50 מ"ל על קרח למשך 5 דקות.
  2. * החזר את צינורות חרוטי 50 מ"ל לעמדות המקוריות שלהם בתוך ארון תקשורת נושאת המדגם בעמדת סיפון 4, ולחדש את התסריט האוטומטי.
  3. הוסף מיליליטר הצפת CN-B1 עקידת 12 על צינור אחד מדגם ומערבבים 10x.

הפקת נפח גדולה: 5 מ"ל TruTips משמש לחילוץ דנ"א המוחלט ממדגם הפלזמה lysed.

  1. תרים 5 TruTips מ"ל ממצב 2 למיצוי חומצות הגרעין בהיקפים גדול.
  2. מחזור מדגם mixture15 פעמים בצינור חרוטי 50 מ"ל, החל בחלק התחתון של הצינור ונע 3 מ"מ גבוה יותר לאחר כל מחזור pipetting. צעד זה מחייב את חומצת הגרעין הכוללת למונולית TruTip.
  3. הזז TruTips לצלחות גם העמוקות בעמדה 6 טור 1, וCYCLE 1x בהצפה לשטוף CN-W1.
  4. הזז TruTips למקם 9 עמודה 2 ומחזור 1x בשטפי CN-W2.
  5. הזז TruTips למקם 9 עמודה 3 ו2x מחזור בשטפי CN-W4.
  6. הזז TruTips למקם 4 טור 9 ומחזור 40x במהירות גבוהה לייבוש מטריצה ​​מחייבת.
  7. הזז TruTips למקם 9 טור 5 ומחזור 10x לelute את חומצות הגרעין מאוגדות מ5 TruTips מ"ל. זה elution בהיקפים גדולים # 1.
  8. הזז TruTips לעמודה 6 ולחזור על השלב עם aliquot השני של חיץ elution. זה elution # 2 בהיקפים גדולים.
  9. העבר elution # 2 לעמדת עמודה 9 5 לשלב את זה עם elution # 1, וזורקים את TruTips.

הדרה וריכוז: ה-DNA המשקל המולקולרי הגבוהה יוסר מהמדגם שחולץ, ואת ה-DNA שנותר מבודד ומרוכז.

  1. הוסף eluant בשילוב מצעד 22 למצב את 10 עמודה 1 ומערבבים היטב 10x.
  2. תרים 1 מיליליטר TruTiנ.ב. מתפקיד 13 ומחזור 20x כדי לאגד את ה-DNA המשקל המולקולרי הגבוהה למונולית.
  3. הזז את TruTips למצב 2 ועמודה 10 מחזור 5x כדי לשטוף ולהסיר את ה-DNA קצה משקל המולקולרי גבוהה. את TruTips נשמרים והניח בחזרה במדף הקצה בעמדה 13.
  4. עם טיפים מגיב מעמדה 12, להוסיף 575 μl של הצפת עקידת CN-B3 לדוגמה בעמדת 10 עמודת 1 ותמהיל 10x.
  5. לאסוף את TruTips מ שלב 25, לחזור למצב את 10 טור 1, ומחזור 20x כדי לאגד את ה-DNA שנותר מהמדגם לTruTip 1 מ"ל.
  6. הזז TruTips למצב את 10 טור 4 ומחזור 1x בCN-W3 לשטוף כדי להסיר כל מעכבים הנותרים.
  7. הזז את TruTips למצב את 10 טור 5 ומחזור 1x בשטפי CN-W4 כדי לשטוף מלחים שיורית מCN-W3.
  8. לגייס TruTips מעל 10 עמודת עמדה 5 ואוויר לעבור בין 35x הטיפים לייבוש מונולית.
  9. הזז TruTips למצב את 10 עמודה 6 ומחזור 10x בEBA2 לelute מטוהר, הגודל-אין תמיכה בבחירהטד וחומצות גרעין מרוכז.
  10. בטל TruTips.
  11. להעביר את מדגם eluted 6-1.5 צינורות מ"ל עמודות בעמדה 11. דגימות שהם מוכנים לאחסון או עיבוד במורד הזרם.

תוצאות

מידע בזמן אמת PCR לשפעת RNA חילוץ מNPA מוצג באיור 5 א. יעילות מיצוי חומצות גרעין משוערת דומה לתוצאות שהושגו עם הגרסה הידנית של פרוטוקול 15. תגובה ליניארי בערכי t C הממוצע היא 10 נצפתה בין 4 ל 10 6 גן עותקי מ"ל -1 תוקנה שפעת (R 2 = 0.99 ו0.98 לשפעת A ו-B, בהתאמה), עם סטיות תקן בממוצע C t הערכים פחות מ 1 מחזור. העדר הזיהום צולב עם מערכת epMotion מודגם באיור 5, שבו 12 דגימות חיוביות NPA המכילות 10 גנים 6 עותקי מ"ל -1 רשות טבע וגנים שביניהם עם 12 כדורי סרק חיץ. T C הממוצע לבקרות החיוביות היה 30.16 ± 0.14, וכל החסר החיץ היה שלילי. סה"כ זמן עיבוד המדגם הוא 16 דקות, 28 ו -40 ל8, 16 ו -24 דגימות, בהתאמה.בגלל לשאוב או ספוגית אף ולוע קליניים טיפוסיים תכיל 10 7 עותקי גן מ"ל -1 (בהנחת 1,000 virions לTCID 50 16 ו> 10 4 TCID 50 מ"ל -1 שפעת 17), פרוטוקול epMotion האוטומטי צפוי להיות יעיל ברוב דגימות NPA קליניות.

בהינתן מגוון של בדיקות מולקולריות שבוצעו על הדנ"א הגנומי אדם, המטרה העיקרית של מיצוי חומצות גרעין מדם כולו היא לייצר דנ"א מזהם ללא, משקל מולקולרי גבוה הגנומי. הפרוטוקול האוטומטי למשך 96 דגימות הושלם בתוך שעה 1, שמהווה שיפור של מערכות אוטומטיות אחרות (למשל Promega MagneSil = 90 דקות וQiagen QIAamp DNA דם BioRobot MDX מערכת = 2.5 שעות). איור 6 א מציג את הפרופילים ספיגת UV / Vis עבור 45 דגימות דם חיוביות מעובד בו זמנית עם 45 כדורי סרק מגיב על המילטון STAR הפרוטוקול, עם ממוצע יחס 260/280 של 1.96 ויחס ממוצע 260/230 של 1.93. 260/280 יחס בין 1.7-2.0 ויחס 260/230> 1.7 הם בדרך כלל מעידים על הדנ"א טהור מאוד, ללא מלחים, חלבונים שיורית או ממסים, ומתקבל על דעת עבור יישומים במורד הזרם מולקולריים ביותר. 1% agarose ג'ל באיור 6 מראה כי gDNA המתקבל הוא של משקל מולקולרי גבוה (> 24 KB), עם גז מינימאלי. התשואה ממוצעת חומצות הגרעין מסט המלא של 45 דגימות חיוביות היא 5.26 ± 0.46 מיקרוגרם דנ"א אנושי לכל 200 דם כל μl, המבוסס על ערכת החיים Quantifiler טכנולוגיות ה-DNA אנושי כימות. מחקרי זיהום צולב דומים לאלה שמוצג באיור 5 בוצעו עם כדורי סרק חיץ בקרה שליליים וביניהם את הדגימות החיוביות והוציאו במקביל; כל החסר היו שלילי שוב על ידי PCR (לא מוצג). מטוהרים gDNA מתאים גם לניתוחים המבוססים על PCR רבים אחרים (לא מוצג).

תוצאות בזמן אמת משמונה דגימות לשכפל של מדגם פלזמה אימהי נקווה מעובד עם הליך TruTip בהיקפים גדולים מוצגות באיור 7. פרוטוקול המלא (כולל דגירה K proteinase מחוץ לקו) הוא סיים בכ 2.5 שעות, בדומה לQiagen המדריך למחזור ערכת חומצות גרעין (אין ערכות חילוץ אוטומטיות דומות הן זמינות עדיין). ערכי t C מעל הממוצע כל משכפל הם 34.58 ± 0.66 ו29.76 ± 0.50 לזכר העובר (Chy) וה-DNA הכולל (CH1), בהתאמה, אשר מדגים את הדירות מצוינת של שיטת החילוץ האוטומטית. הריכוז של ה-DNA העוברי בתוך בריכת DNA הכוללת (בשווה הגנום), מחושב על בסיס השוואת ניתוח נקודת התאמה לתקנים, עם ה-DNA עוברי% כתוצאה הממוצעת בכל הדגימות של 2.8%. ה-DNA עוברי% בפועל למדגם זה אינו ידוע משום שדגימות היו נקוות לפני ביצוע החילוץ. הרכב ה-DNA עוברידגימות פלזמה שבאינם אספו מופקים בשיטת TruTip הם בדרך כלל גבוהים יותר פי 1.5 בהשוואה לתוצאות עם ערכת חומצות גרעין Qiagen מחזור (לא מוצג).

figure-results-1
איור 1. תהליך חילוץ TruTip וזרימת עבודה, ללא קשר למערכת הטיפול הנוזלי. הכנת מדגם אחרת או שלבי טיפול נוזל יכולים להיות משולב בתוך שגרה אוטומטית בהתאם ליכולות של מכשיר טיפול הנוזל הספציפי ותוכנה.

figure-results-2
איור 2. (א) פריסת מדגם Eppendorf epMotion 5070 צלחת. (ב) הסדר של חומרים כימיים / consumaBles על שולחן העבודה. מדגם הצלחת יכולה להיות מוגדר לתקופה של עד 24 דגימות (1 עמודים, 5 ו -9, בהתאמה), אם כי epMotion יהיה לעבד רק עד 8 ​​דגימות בו זמנית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-3
איור 3. 2 = 1. TruTips 3 Akonni / המילטון מ"ל LPT מ"מ;; פריסת סיפון STAR המילטון לטיהור הדנ"א הגנומי מהדם כולו (שלא בקנה מידה) עמדת 1 סיפון = המילטון טיפים 1 מ"ל מסונן; 2 = 1 מ"ל המילטון טיפים שלא סונן 4 = ספקי תשומות דם מדגם (צינורות איסוף דם או צינורות microcentrifuge); 5-9 = 290 מ"ל לשקתות מגיב F מאגר תמוגה, אתנול, שטוף המאגר J, K ושטפי הצפת A2 הצפת elution, בהתאמה; 10 = 96 דצלחת גם עקידת יפ; 11 = 96 באר עמוק לשטוף J; 12 גם = 96 עמוקה לשטוף K; 13 = 96 צלחת Elution גם עמוקה; 14 = המילטון HHS2 דוד / ייקרתי עם 96 Nunc צלחת דגירה גם עמוקה; = שוקת מגיב 50 מ"ל 15 מכיל proteinase ק לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-4
איור 4. פריסת המילטון STARplus סיפון לטיהור DNA מדגימות פלזמה בנפח גדולה (לא בקנה מידה). המערכת מצוידת עם 8 ערוצי 5 מ"ל ו 8 x ערוצי 1 מ"ל (לא מוצג בפריסת הסיפון). מיקום 1 סיפון = המילטון 4 טיפים מ"ל מסוננים; 2 = 5 מ"ל TruTips Akonni / המילטון, 3 = דגימות פלזמה מקור; 4 = 50 צינורות חרוטי מ"ל; 5 = 120 מ"ל המכילים שקתות מגיב CN-W1, CN-W2 וCN-W4 ריאדNTS; 6 = שקתות בנפח נמוכה מגיב המכילות proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, גאות וCN-W3 ריאגנטים; 7 = 290 מ"ל המכילה שוקת מגיב מגיב CN-L1; 8 CN = שוקת המכיל 290 מיליליטר מגיב B1-מגיב; 9 = 96 צלחות גם עמוקות לשלב 1, 10 = 96 צלחות עמוקות גם עבור שלב 2; 11 = נושאות מדגם למטוהרים, מוצר סופי; 12 = המילטון טיפים מסוננים 1 מ"ל; 13 = Akonni / המילטון 1 מיליליטר LPT 4 TruTips מ"מ. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-5
איור 5. (). תוצאות בזמן אמת PCR ממיצוי TruTip האוטומטי של נגיף שפעת הוסיפו ללשאוב אף ולוע (רשות טבע וגנים). רשות טבע וגנים בנפח קלט = 100 μl, נפח elution = 50 μl. תוצאות הן ממוצעת של 3 דואר לשכפלxtractions מ 5 רקעים שונים NPA (n = 15) לרמת דילול ויעד שפעת. qPCR בוצע על מערכת LightCycler 480 עם תנאי assay שתוארו לעיל 15. (ב) לא זיהום צולב הוא זוהה כאשר 12 דגימות NPA חיוביות וביניהם לא שולט תבנית ובכפוף להליך המיצוי האוטומטי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-6
איור 6. תוצאות של מיצוי DNA הגנומי אנושי מדם כולו. A) עקבות-UV לעין מ1000 NanoDrop (ThermoFisher) מ 10 שנבחרו באקראי משכפל. ב ') 1% agarose ג'ל של TruTip המטוהר gDNA. M = פישר 24 KB מקסימאלי Dסולם NA. נתיבים 1 - 4 = ~ 100 ng המטוהר gDNA מארבעה נבחר באופן אקראי משכפל. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-results-7
איור 7. תוצאות בזמן אמת PCR משמונה עקירות TruTip לשכפל מחזור של ה-DNA באופן חופשי מפלזמה. דוגמאות המסומנות בכוכביות (* או **) שהוצאו בימים נפרדים. Chy מכמת-DNA של עובר הזכר וCH1 מכמת הווה DNA כולל (עוברי ואימהי). qPCR בוצע על מערכת LightCycler 480 (רוש) עם מבחני שפורסמו בעבר מיקוד Chy וCH1 18.

דיון

הפשטות של מושג TruTip וזרימת העבודה (איור 1) להפוך אותו להתאים בקלות, אוטומטי, יעיל ואפקטיבי למספר מטריצות קליניות לדוגמה, כרכי מדגם קלט, ומערכות טיפול נוזל. יש להכיר בכך, עם זאת, כי בכל דגימה קלינית היא ייחודית, ומשתנה אחד למשנהו בצמיגות, חלקיקים, ליחה, משטח מזהמים, חיידקים, ו / או רקע גנטי אנושי. בהתחשב וריאציות צפויות בהרכב מדגם קליני ושימושים מיועדים של פרוטוקול הכנת מדגם TruTip אוטומטי, זה עשוי להיות לכן, יש לשנות את שלבים מסוימים בהליך TruTip על מנת להשיג תוצאות רצויות עבור סוג מדגם מסוים. ללא קשר לסוג המדגם, לעומת זאת, TruTip פרמטרים שיש להם השפעה המשמעותית ביותר על טוהר חומצות גרעין ו / או התאוששות כוללים בדרך כלל:

  1. לדוגמא ערבוב וhomogenization עם מאגר תמוגה (ואלכוהול). אמנם יש לי TruTips מחדשגודל latively גדול נקבובית, homogenization המדגם ועיבוי חשוב מאוד לתמוגה תא יעילה, ומחייבים צעדים הבאים למונולית TruTip. עם lysate הומוגנית והמעובה היטב, דגימות יכולות לעבור TruTip עם ספיקות גבוהות יותר, אשר מפחיתה את זמן עיבוד הדגימה הכולל. הנפח הגדול הפלזמה הפרוטוקול מדגים את הפוטנציאל למשתמשים homogenize יסודיות ונזל דגימות קשות (on-line או off-line), למרות נפח דגימת הקלט הגדול.
  2. ספיקות. ספיקות איטיות יותר במהלך מחייבים חומצות גרעין או elution בדרך כלל לגרום לתשואות גבוהות יותר חומצות גרעין, אם כי על חשבון זמן עיבוד כולל. ספיקות איטיות יותר עשויות גם להפחית את היקף גז ה-DNA.
  3. מספרי מחזור. המספר האופטימלי של שאיפה ולוותר מחזורים תלוי בסוג המדגם, כלל מדגם נפח, וספיקות. שלב 1 באיור 1 הוא בדרך כלל הנקודה שבה המחזור numbeRS (וספיקות) עשוי לדרוש אופטימיזציה אמפירית, עם דגימות כגון לשאוב אף ולוע (איור 5) המייצג את אחד מlysates המאתגרים יותר כדי לייעל בשל מגוון של צמיגויות NPA מחולים שונים.
  4. ייבוש. ייבוש מלא של מונולית TruTip הוא הכרחי כדי למנוע ממסים אורגניים שיורית משיתוף עם משחררי מדגם מטוהר חומצות הגרעין ותהליכים במורד הזרם עיכוב או בדיקות. בגלל TruTip לא התייבש באמצעות צנטריפוגה או סינון ואקום, חשוב על מנת למקסם את שניהם קצב הזרימה ומספרי מחזור במהלך שלב הייבוש. לפעמים יש טיפת שייר של פתרון לשטוף בתחנה הסופית של TruTip לאחר מחזורי הייבוש הושלמו. יש המילטון הרובוט את היכולת לבצע "מגע קצה" בצד של הבאר לשחרר הטיפה, ובכך להבטיח elution חופשי ממס. מערכת epMotion אין תכונה זו, אך לפני שטיפה של התחנה הסופית TruTip באלחיץ ution ניתן לתכנת כדי להשיג את אותו האפקט.

בגלל הגיאומטריה, חומר קצה פיפטה, ושיטת ההצמדה לזרועות רובוטיות הם הערוץ ייחודיים לכל יצרן מכשיר, מבנה TruTip שונה נדרש עבור כל מערכת טיפול נוזלית. ממדי מונולית TruTip (קוטר, עובי וגודל נקבובית) אין לתאם עם יכולת קשירת חומצות גרעין (ויעילות elution), כצפוי לכל טכניקת מיצוי שלב מוצקה. אמנם עבה (> 4 מ"מ) מטריצות עשויות להיות מוטבעים TruTip 1 מ"ל להגדלת קיבולת מחייב חומצות גרעין לדגימות גדול בנפח ו / או להשוות את יכולת הקשירה על פני פורמטי TruTip ספציפיים, יש איזון בין עובי TruTip וספיקות במהלך הצעד המחייב הראשוני (בנוכחות lysates הגולמי). לכן, זה לפעמים יתרון להטביע פסלים גדול בקוטר לטיפי פיפטה בנפח גדול יותר לצעדים הראשונים של פרוטוקול אוטומטי, (לדוגמה: </ Em> 5 מ"ל TruTips המילטון / Akonni לעקירות בהיקפים גדולים). בהתחשב בתצורות TruTip הספציפיות המוכתבות על ידי היצרנים של רובוטים טיפול נוזל, לעומת זאת, אנחנו לא מצפים בהכרח תשואות חומצות גרעין TruTip להיות זהות על פני פלטפורמות טיפול נוזל מיצרנים שונים, או על פני גדלי TruTip שונים.

דגימות קליניות (על פי הגדרה) יכילו כמויות משמעותיות של הדנ"א הגנומי אדם אלא אם כן הם נרכשו מבדרך כלל אתרים סטריליים (נוזל השדרה מוחין לדוגמה). לפעמים הדנ"א הגנומי האדם הוא רצוי (כמו באיור 6), ואילו ביישומים אחרים ה-DNA האנושי מייצגת רקע גנטי לא רצוי (כמו לאיור 5). נוכחותו של ה-DNA הרקע היא בדרך כלל לא בעייתית, כל עוד הסכום הכולל של חומצות גרעין במדגם אינו עולה על יכולת הקשירה של מונולית, ואת ה-DNA הרקע יכול לשמש כספק אם גרעין היעד הרצויחומצה מצויה בכמויות זעירות. המטרה של פרוטוקול חילוץ הפלזמה בנפח גבוה (איור 7) היא לבודד (מקוטע) ה-DNA העוברי בנוכחות עודפת של פי 10-20 של ה-DNA האימהי, שהוא דומה למדגם האובייקטיבי הכנת בדיקות מחלות זיהומיות פרט לכך הרצפים חופפים מאוד וניתן להבחין רק על ידי בדיקה ספציפית מאוד מולקולרית ו / או אפליה גודל. במקרה זה, ה-DNA במחזור הכוללת היא מבודדת באמצעות 5 מ"ל TruTip, וה-DNA העוברי במשקל מולקולרי גבוהה ונמוכה מולקולרי הבא מופרדים באמצעות כבילה שלאחר מכן וelution לTruTip מיליליטר 1 על ידי שינוי תנאי המאגר המחייבים. הפרדת גודל סלקטיבית והעשרה של חומצות גרעין המבוססות על יעד מחייבם ומאפייני elution למונולית סיליקה היא מצב שונה באופן מהותי מפעולה מושגת על ידי קרום או עמודות ספין גודל הרחקה. הפרדה והעשרה של גודל ה-DNA של חיידקים מהדנ"א הגנומי אדם עשויה להיותccomplished ביישומים עתידיים באמצעות התאמה אישית מחייב TruTip ומאגרי elution.

הפרוטוקולים האוטומטיים הפגינו כאן מדגישים את התועלת של מונולית TruTip עצמו לעיבוד דגימות קליניות שונות, ואיך זה יכול להיות מותאם לכמויות גדולות ורובוטים טיפול נוזל ספציפיים. השיטות יעילה בדרך כלל לגרום לפרוטוקולי חילוץ מהירים יותר בהשוואה למערכות אוטומטיות אחרות. הפשטות של טכנולוגית TruTip, לעומת זאת, גם מעניקה כמה יתרונות עלות למי שמעוניין ברכישת מערכת חדשה, אוטומטי טיהור חומצות גרעין, משום שהחומרה העיקרית הנדרשת למיכון תהליכי TruTip היא זרוע פיפטה הערוץ עצמו ולא מוטות מגנטיות, מערכות ואקום , או על לוח צנטריפוגות. ניצול צלחות מגיב מראש מלאות יכול גם להפחית את השטח ומתכלה נדרשים, ולהכפיל את התפוקה לכל טווח. צמצום שטח סיפון עם פרוטוקולי TruTip גם מאפשר למשתמשים מתקדמים לשילוב במעלה הזרם או דתהליכים אוטומטיים ownstream עם TruTip. לדוגמא פתרון easyBlood של המילטון לדם כל fractionate יכול להיות משולב עם שיטת חילוץ TruTip האוטומטית, אשר הייתי לייעל באופן משמעותי את התהליכים ביו בנקאיים. תהליכים שלאחר המיצוי כגון quantitation חומצות גרעין, נורמליזציה, PCR ההגדרה, או רצפי DNA גם משולבים בקלות עם TruTip על פלטפורמות טיפול נוזל הגדולות יותר.

גילויים

הכותבים הם עובדים של Akonni Biosystems, Inc המייצרים חומרים המשמשים במאמר זה.

הגישה החופשית ולהפקתו של מאמר זה היא בחסות Akonni Biosystems, Inc

תודות

חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) במסגרת המענק R 44 AI072784. אנו מודים לד"ר קירסטן סנט ג'ורג', שרה ב 'Griesemer, דריל Lamson ואיימי דיקן המעבדה למחלות ויראליות, Wadsworth Center, מחלקת מדינת ניו יורק בריאות לשפעת virions לכמת וגישה קלינית לתוקף שפעת בזמן אמת מבחני ה-PCR.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנט/חומר
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)figure-materials-1 Akonni Biosystems, Inc.300-11120
95% EthanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
99% AcetoneSigma-Aldrich270725-4L
מים שעברו טיפול ב-DEPCLife TechnologiesAM9906
מאגר ריאגנטים, 30 mlEppendorf960050100
פלטת בארות עמוקות 96/2,000 μlUSA Scientific30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μlEppendorf960050100
ציוד
מערכת epMotion 5070Eppendorf5070 000.000
כלי חלוקה TM1000-8960001061
מתאם למאגר960002148
טבלה 1. ריאגנטים וציוד להפקה אוטומטית של RNA מ-NPA.
ריאגנט/חומר
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)figure-materials-2 Akonni Biosystems, Inc.300-20341
95% ethanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
Proteinase KAMRESCO LLCE195
מתאם טיפים מסוננים Hamilton CO-RE 96, 1 mlHamilton Robotics, Inc.235905
מתאם טיפים לא מסוננים Hamilton CO-RE 96, 1 mlHamilton Robotics, Inc.235904
אמבט ריאגנטים 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
פלטת בארות עמוקות 2 mlUSA Scientific1896-2800
Nunc 96 DWP-2 mlThermofisher27874
אמבט ריאגנטיםFisher14-222-412
ציוד
מערכת Hamilton STARHamilton Robotics, Inc.173027
ערוצי פיפט עצמאיים 1 ml / זרוע מודולריתHamilton Robotics, Inc.173081/173050
ראש 96 ערוצים, 1 mlHamilton Robotics, Inc.199090
נשאי טיפיםHamilton Robotics, Inc.182085
נשאי/מתאמי דגימותHamilton Robotics, Inc.173400/182238
נשאי פלטותHamilton Robotics, Inc.182090
נשאי MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
יחידת HHS2 Heater ShakerHamilton Robotics, Inc.199033
נשאי מתאמיםHamilton Robotics, Inc.188047
טבלה 2. ריאגנטים וציוד להפקת DNA גנומי מדם מלא ב-96 בארות.
ריאגנט/חומר
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)figure-materials-3 Akonni Biosystems, Inc.פנה לבירור
100% ethanolSigma-Aldrich459828-1L
IsopropanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC327270010
Proteinase KAMRESCO LLCE195
טיפים מסוננים 4 mlHamilton Robotics, Inc.184022
טיפים לא מסוננים 1 mlHamilton Robotics, Inc.235939
פלטות 96-Deep WellUSA Scientific1896-2800
מבחנות קוניות 50 mlCorning/ThermoFisher Scientific05-526B
אמבטי ריאגנטים 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
אמבטי ריאגנטים 120 mlHamilton Robotics, Inc.182703
אמבטי ריאגנטים 96-מיקומים לנפח גדולThermoFisher Scientific14-222-412
ציוד
בסיס תחנת עבודה STARplus Autoload / מודול סיפוןHamilton Robotics, Inc.173025/190012
ערוצי פיפט עצמאיים 1 ml / זרועHamilton Robotics, Inc.173081/173052
ערוץ עצמאי 5 ml / זרוע מודולריתHamilton Robotics, Inc.184090/173050
נשאי פלטותHamilton Robotics, Inc.182090
נשאי MultiflexHamilton Robotics, Inc.188039
נשאי מתאמים לאמבטי ריאגנטים 50 mlHamilton Robotics, Inc.188047
נשאי אמבטי ריאגנטים 120 mlHamilton Robotics, Inc.185290
נשאי טיפיםHamilton Robotics, Inc.182085
נשאי מבחנות 50 mlHamilton Robotics, Inc.182245
נשאי דגימות 24 מיקומיםHamilton Robotics, Inc.173400
נשאי דגימות 32 מיקומיםHamilton Robotics, Inc.173410
טבלה 3. ריאגנטים וציוד להפקת DNA בנפח גדול מפלסמה.

מקורות

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  2. Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
  3. Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
  4. Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32(2002).
  5. Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
  6. Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
  7. Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
  8. Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
  9. Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
  10. Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
  11. Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
  12. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
  13. Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
  14. Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , US7759112 (2010).
  15. Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
  16. Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
  17. Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
  18. Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNARNAHamilton StarDNA

מאמרים קשורים