מאמר שיטה

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

DOI:

10.3791/50362

⸱

30 ביוני 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, במקרה שלנו ה-HIV-1 NEF, לא רק שומרים על התפקוד הביולוגי שלהם, אלא גם יכולים לעכב את הפונקציה של החלבון באורך מלא באופן תחרותי. קבוצה של 20 פפטידים סריקת NEF, 20 חומצות אמינו באריכות עם כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, שתשמש לזיהוי מוטיבים בהנף אחראי לגרימת מות תאים מתוכנת שלה. פפטידים המכילים מוטיבים אפופטוטיים אלה מושרה אפופטוזיס ברמות דומות לחלבון הנף באורך מלא. הפפטיד שני, הנגזר משינוי אזור ההפרשה (SMR) של NEF, נשמרים היכולת ליצור אינטראקציה עם חלבונים תאיים המעורבים בהפרשה של הנף בexosomes (exNef). פפטיד SMRwt זה שימש כחלבון "הפיתיון" בשיתוף immunoprecipitation ניסויים כדי לבודד חלבונים תאיים הנקשרים באופן ספציפי למוטיב SMR של NEF. עיכוב transfection ונוגדן חלבון שימש לשבש את הימור האינטראקציה פיזיWeen הנף וmortalin, אחד מחלבוני SMR מחייבים המבודדים, ואת ההשפעה נמדד עם assay הפרשת exNef מבוסס פלורסנט. יכולתו של פפטיד SMRwt לגבור הנף באורך מלא לחלבונים תאיים הקושרים את מוטיב SMR, להפוך אותו למעכב הראשון של הפרשת exNef. וכך, על ידי שימוש בטכניקות שתוארו כאן, אשר מנצלים את התכונות הייחודיות של פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, ניתן להאיץ את זיהוי של מוטיבים פונקציונליים בחלבונים ופיתוח של מעכבים של פונקציות פתוגניים המבוססים על פפטיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם כניסתו של טיפול אנטי retroviral, מגיפת האיידס בעולם המערבי כבר האט, אבל לא קוצץ, ואת התפשטות האיידס ממשיכה להיות נטל בריאות גדול ברחבי העולם. למעט שולי האפקטיבי המשפט התאילנדי RV144, חיסונים נגד איידס הראו כישלון בהגנה מפני זיהום עד כה. לכן, מחקר לתוך מטרות נוספות, פוטנציאל טיפולי עדיין מוצדק.

יחד עם CD4 דלדול תאי T, הפעלה חיסונית כללית מתמשכת היא סימן היכר של ההידבקות ב-HIV. הפעלה חיסונית כרונית (CIA) מובילה לעלייה במחזור תא, subpopulations ימפוציטית הופעל ומובחן, תשישות והזדקנות תאית, והרג של תאי T ותאי B באמצעות הפעלה-induced מוות של תאים (AICD) 1,2,3, ו היא מבוססת היטב כאחד מהמנבאים החזקים של התקדמות מחלה 4,5,6,7,8,9,10,11,12. עם זאת, המנגנונים שבבסיס ה-CIA וCD4דלדול בהידבקות ב-HIV תא T להישאר להיות הובהר באופן מלא.

ראיות מהמעבדה ואחרים שלנו הובילו אותנו למודל להתקדמות מחלה (איור 1) שבו חלבון ה-HIV הניפו (פקטור רגולציה שלילי) גורם להפרשתו בexosomes מHIV-1 תאים נגועים 13,14. exosomes המכיל הנף אלה (exNef) לגרום לאפופטוזיס במספר שושלות תאי CD4 כולל נגוע T-תאי 15,16. לחלופין, במונוציטים / מקרופגים דפוסי שינה exNef ביטוי גנים, ביטוי למשל ציטוקינים, ונראה לגרום למצב של הפעלה חיסונית לא מתוכננת. גוף זה של ראיות מצביע על תפקיד חשוב עבור exNef ב- CIA ודלדול CD4 T-תאים.

הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול תאי T מסוג CD4וה-CIA שפתוגנזה כונן ה-HIV / איידס.

כדי לאסוף ראיות שהובילו למודל שלנו להתקדמות המחלה HIV / איידס ואת הנתונים הבאים שנבנו על מודל זה, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה של הפרשת exNef, ולהתחיל לקבוע את חלבונים תאיים מעורבים. בעבודה הראשונית, מצאנו כי החלבון הנף גורם לאפופטוזיס בתאים עוברים אורח והוא שוחרר מתאי extracellularly הנף-transfected ונגועים באיידס 15. פפטידים הנגזרים מ( תא סטרומה נגזר Factor-1, עם אלפא שחבור החלופי) SDF-1α כבר הראו בעבר כדי לשמור על חלק גדול מהפעילות המחייבת ואיתות של המולקולה באורך מלא 17. אנו משערים כי פפטידים של הנף אולי לשמר חלק מהפעילות אפופטוטיים של חלבון המלא, וכי הפפטידים האלה בהכרח יכילו תחום אפופטוטיים הנף (ים). לזהות פפטידים אלה, וכתוצאה מכך הנףתחום אפופטוטיים (ים), השגנו קבוצה של 20 HIV-1 פפטידים סריקה 'קערה ממחקר NIH האיידס ומגיב תכנית הפניה. פפטידים 20-AA אלה, כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, נקראים במספר חומצות אמינו האחרונה שלהם, כלומר N20 משתרע 'קערה 1-20 חומצות אמינו, חומצות N30 משתרע 11-30' קערת אמינו, וכו '16. מצאנו כי חשיפת תאי T extracellularly לפפטידים ספציפיים חופפים שני תחומים 10-AA שונים באפופטוזיס המושרה החלבון הנף באורך מלא בתאים אלה. ניתוח בדיעבד של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו אלה חשף את היכולת שלהם אינטראקציה פיזית עם קולט chemokine CXCR4 על פני השטח של תאי T, עם קינטיקה מחייבת שאפשרה פפטידים אלה כדי לעכב מחייבים תחרותיים בין CXCR4 ויגנד הטבעי שלו SDF-1α. לבסוף, האינטראקציה של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו עם CXCR4 נמצאה כדי לגרום תגובת לחץ בתאי T אלה מובילים לאפופטוזיס. עדות זו אפשרה לנו quicתחומים הפונקציונליים של קלי המפה 'הקערה; תהליך זה היה לוקח הרבה יותר זמן שימוש בטכניקות סטנדרטיות מוטגניות DNA כגון mutagenesis סריקת אלאנין. הוא גם הראה שפפטידים שמקורם בהנף קצרים אלה נשמרים הפונקציה הביולוגית של הדומיינים אפופטוטיים בחלבון באורך מלא.

לאחר שזיהיתי את תפקיד להנף תאי, כלומר אפופטוזיס של תאי T, בקשנו הבנה טובה יותר של איך הנף היה מופרש מהתאים. באמצעות סדרה של מבני 'קערה עברו מוטציה, מיפינו את מוטיבים חלבון' קערה שמורה באבולוציה באזורי N-המסוף של שניהם HIV NEF, ו מק (וירוס כשל חיסוני קופי) הנף רזוס מקוק מקביל SIV, שהם קריטיים לexNef הפרשה 13. אחד מהמוטיבים האלה, אזור שינוי ההפרשה (SMR; 66VGFPV70), היה קריטי במיוחד, כתחליף אלאנין של כל אחד מחמש חומצות אמינו גם קטינה באופן משמעותי או יבוטל הפרשת exNef. כאשר נמסרו לתאים באמצעות C של המוטיב פעילhariot המשלוח מגיב חלבון, פפטיד המכיל SMR מצורף רצף פפטיד דגל (SMRwt) נמצא לעכב את הפרשת exNef משני תאים הניפו-transfected ונגוע באיידס 18. בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו עם פפטידים, החלטנו להשתמש בפפטיד זה כדי להבהיר את המולקולות ומנגנונים העומדים בבסיס תפקידו של הנף SMR בהפרשת exNef.

שימוש בפפטיד SMRwt כמו "חלבון הפיתיון" שלנו, אנחנו שותפים מחייבים הסלולר של SMR במשותף immunoprecipitated מlysates תא T נגוע 18. רצף פפטיד הדגל סיפק ידית נוחה ללכידת פפטיד SMRwt באמצעות שרף זיקה אנטי דגל. הממצא הקודם שלנו שואלין יחיד לאלאנין מוטציה בפפטיד SMRwt היה מספיק לביטול העיכוב של הפרשת exNef זיהה, פפטיד ספציפי מאוד שליטה נוחה (SMRmut) שהשתמשנו בו כדי לשלול חלבוני שיתוף immunoprecipitated לא ספציפיים לSMR. שימוש בפפטיד עם יםתחום pecific של עניין ולא לחלבון באורך מלא אפשר לנו לעקוף את הסינון של עשרות גורמים הסלולר אשר נקלטות על תחומים אחרים בהנף 19.

ברגע שזיהינו את השותפים SMR-מחייבים, צעד הגיוני הבא היה להראות כי בני הזוג שזוהה סלולארי הכריכה הם חשובים לתפקוד הביולוגי 18. ההליך הרגיל כדי להשיג את זה הוא באמצעות מציאה רמות חלבון מירנה יעד חלבון ספציפית או siRNA, ולאחר מכן assay ההשפעה על התפקוד הביולוגי. בצענו מציאה מירנה, אשר מעכבת תרגום של mRNA היעד, צמצום ייצור של יעד זה, במקרה זה חלבון SMR מחייב. הפחתה זו של חלבון המטרה היא השפעה עקיפה, ואולי יש לו השפעה מאוחרת על הפונקציה הביולוגית ממוקד החלבון ממלא תפקיד בו כתוצאה מכך, אנחנו גם עובדים בטכניקת עיכוב הנוגדן פחות הנפוצה כדי לקבוע אם ישירות לשבש את פעילותו שלחלבון המטרה מפחית או מבטל את הפונקציה הביולוגית. בהליך זה, נוגדנים שהועלו נגד החלבון ממוקד הם transfected לתוך התא באמצעות מגיב מרכבה, ולתקשר ישירות עם חלבון המטרה או sequestering אותו מהאתר שלה של פונקציה, או חסימת תחום המחייב הרלוונטי שלה. עיכוב של חלבון המטרה באמצעות הליך זה משבש את תפקודו באופן ישיר, ויכול להשלים את הליכי מציאה RNA על ידי המאשר את חשיבותו של חלבון המטרה נוסף לפונקציה הביולוגית.

אמנם מגיב מרכבה הוא יעיל במתן פפטידים וחלבונים לתאים; תהליך זה הוא זמן רב ומגביל את סוגי ניסויים, למשל חשיפות ממושכות או חוזרות ונשנות, ובמחקרים בבעלי החיים vivo ניתן לבצע את זה. כתוצאה מכך, הוספנו פפטיד רצף תא חודר (CPP) לפפטיד SMRwt (SMRwt-CPP) 18 ליצירת פפטיד שיכול להילקח על ידי תאים פסיבייםמתקשורת והתרבות. גרסה זו הייתה יעילה כמו לשעבר בהפרשת exNef עיכוב.

העדויות מניסויים שפורסמו אלה מדגימה את היכולת של פפטידים קטנים המכילים מוטיבים פונקציונליים ספציפיים כדי להרגיז את הפונקציה של החלבון באורך מלא באמצעות עיכוב תחרותי, וכדי לבודד את החלבונים הנקשרים מוטיבים אלה. ניתן היה לצפות כי טכניקות אלה צריכים להיות שימושיות בהרבה פרוטוקולי ניסוי. הם צריכים גם להיות יעילים במעכבי פפטיד חדשניים הנדסיים של תהליכים תאיים רבים, פונקציה שניתן לשפר עוד יותר על ידי הצמדה לרצפי CPP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. שימוש בפפטידים קצרים בניתוח ביולוגי

I.1. מיפוי מוטיבים ביולוגי תפקודיים באמצעות פפטידים

  1. טיפול בתאים עם פפטידים סריקה 'קערה
    1. לרכוש סט של פפטידים סריקת האזור של עניין. בניסויים שלנו, פפטידים 20mer, עם 10 חפיפה חומצת אמינו, פורש את החלבון הנף כולו HIV-1 (205 AA), התקבלו מהתכנית מגיב האיידס. פפטידים הם assayed בנפרד כדלקמן:
    2. הוסף 10 ng / ml של הפפטיד למדיום תרבית התאים.
    3. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבות לכל צלחת לJurkat תרביות תאים.
    4. דגירה תרבויות למשך 24 שעות ב 37 ° C.
  2. מסוף סוף assay deoxynucleotidyltransferase בתיווך dUTP ביוטין ניק התיוג (Tunel) של אפופטוזיס
    1. שטוף תאים עם 1X PBS, ולתקן למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם paraformaldehyde 4% ב1X PBS, pH 7.4.
    2. לשטוף עם 1X PBS, וpermeabilize עם 0.1% טריטון X-100 עבור 10דקות בטמפרטורת חדר.
    3. יש לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS.
    4. ספירת תאים מוכתמים על ידי epifluorescence על מערכת מיקרוסקופיה מבוקרת מחשב.

I.2. ניתוח עיכוב תחרותי באמצעות פפטידים

  1. שיתוף transfection של פפטידים באמצעות ערכה מגיב משלוח חלבון המרכבה
    1. לתערובת תגובת transfection, לדלל 1 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א wtNef-GFP ו100 ng של או פפטידים הנגזרים מwildtype תחום SMR, או פפטידים המכילים אלנין-החלפה של חומצות אמינו בודדות במוטיב SMR, לנפח סופי של 100 μl עם 1X PBS.
    2. לדלל 6 μl של דילול 1/10 של מגיב מרכבה לנפח סופי של 100 μl עם מים סטריליים, ולשלב עם תערובת ה-DNA-פפטיד בדילול מלא.
    3. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר הקמתה של ה-DNA המורכב פפטיד המרכבה /.
    4. 3 10 5 תאים גלולה x Jurkat על ידי צנטריפוגה XG ב 600 במשך 5 דקות.
    5. לשטוף את תאי פעמיים עם 1X PBS, וresuspend במתחם-פפטיד ה-DNA מרכבה /.
    6. הוסף 400 μl של מדיום סרום ללא RPMI 1640 להשעיה ודגירת התאים בתרבות צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
    7. הוסף 1 מ"ל של מדיום 1640 RPMI טרי המכיל 10% FBS לכל צלחת, ודגירת התאים למשך 48 שעות ב 37 ° C.
    8. קציר תאים ולקבוע יעילות transfection על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. הנף assay-GFP הפרשת ניאון צלחת קורא של עיכוב פפטיד
    1. לאסוף את המדיה ממוזגות ללא תא מהתאים שנקטפו, ולהעביר 100 μl לבארות בודדות של צלחת microtiter 96, גם שחורה.
    2. הקרינה מדד ה-GFP בתקשורת על fluorimeter טקאן GENEios עם עירור גל 485 ננומטר ופליטת אורך גל 515 ננומטר ביחידות ניאון יחסיים.
    3. הגדר את רמת הקרינה של ה-GFP בשליטה (מדיה מתאי שיתוף transfected עם הנף-GFP ומקושקש פפטיד) ב 100%.
    4. תשווה את זה לרמה של ה-GFP הקרינה בתקשורת מתאי שיתוף transfected עם פפטידים SMR שונים כדי להבחין בשינויים בהפרשה הנף-GFP.

I.3. בידוד שותפים מחייבים מוטיב באמצעות פפטידים כפיתיון

  1. שיתוף immunoprecipitation עם פפטידים SMR
    1. לגדל תאי Jurkat במדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS על 37 מעלות צלזיוס בבקבוק T-75 תרבית רקמה, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. לקבוע את יעילות transfection, על ידי הצבת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ללכוד תמונות, ולאחר מכן לספור את התאים הכולל והכותרת ולקבוע את תאי שכותרתו אחוזים.
    2. Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר 1X PBS, ולהעביר אותו לצינור Eppendorf 1.5 מ"ל. Microcentrifuge XG ב 1000 דקות 1. Resuspend גלולה במאגר תמוגה α-FLAG 1 מ"ל על ידי pipetting העדין. מאגר תמוגה: מערבבים 50 מ"מ טריס • HCl pH 7.4, 150 מ"מ נתרן CHLoride [NaCl], 1 mM EDTA, ו -1% טריטון X-100, עם 1 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl [PMSF], ומעכבי פרוטאז קוקטייל μl / 10 מ"ל לשימוש עם תא יונקים ותמציות רקמות [pic; סיגמא]. הפוך מייד לפני השימוש.
    3. באופן דיפרנציאלי microcentrifuge השעיות XG ב 2000 למשך 5 דקות, וב13,000 XG במשך 10 דקות לגלולת פסולת התא וה-DNA, בהתאמה. לאסוף את supernatant (להלן '"lysate").
    4. הוסף 1 מ"ג של חלבון lysate ו1 מיקרוגרם של שני SMRwt או הפפטיד SMRmut עד 20 μl של אנטי דגל M2 הזיקה ג'ל (להלן: "שרף"; סיגמא). שים לב שגם SMRwt וSMRmut משמש כאן יש רצף תג דגל המשובץ בפפטידים. להביא את התערובת לנפח סופי של 1 מ"ל במאגר Co-IP (α-דגל תמוגה חיץ מינוס PMSF וPIC). דגירה את התערובת על 4 מעלות צלזיוס הלילה עם רוטציה קצה על קצה. כביקורת שלילית, דגירה lysate עם השרף בהעדר או פפטיד.
    5. Pelleלא על ידי שרף microcentrifugation ב 5000 - 8000 XG למשך 30 שניות. אפשר לשרף להסתפק ב2 דקות לפני הטיפול במדגם ולאחר מכן לשאוב supernatant. הסר את supernatant עם טפטפת בקצה הצר של סוף, או מזרק המילטון, נזהר שלא להעביר כל שרף. טיפים פיפטה צר-end יכולים להתבצע באמצעות מלקחיים לצבוט פתיחה של קצה פיפטה פלסטיק עד לסגירתו באופן חלקי. שטוף את השרף ארבע פעמים עם 500 μl של חיץ לשטוף (50 מ"מ טריס • HCl pH 7.4, ו 150 מ"מ NaCl). Elute את החלבונים התאיים הכרוכים עם 15 מיקרוגרם של הפפטיד דגל 3X (Sigma) ב 50 μl של חיץ לשטוף ולדגור על נדנדה / ייקר למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    6. לרכז את eluates על ידי משקעים אצטון, ואחרי הרתחה בחיץ מדגם Laemmli (ביו רד). הפרד את החלבונים על ידי-SDS על 4-20% טריס-HCl הקריטריון הטרומי ג'ל (Bio-Rad). כתם ג'ל עם Coomassie מבריק הכחול R-250 (ביו רד). הערה: בניסויי זיהוי ספקטרומטריית מסה ( איור 4 א), כל תנאי (Co-IP עם SMRwt, SMRmut, או שלא פפטיד) בוצע ארבע פעמים, ואת eluates מכל ארבע חזרות היו נקווה לפני הממטרים אצטון עבור סכום כולל של 4 מ"ג בסך הכל קלט / חלבון מצב).
  2. שיתוף immunoprecipitation עם חלבון הנף-GFP
    1. מערבבים 50 μl של חרוזים מגנטיים Dynabeads גרם חלבון (Invitrogen) עם 2 מיקרוגרם של אנטי-GFP חד שבטי עכברי ב 1 מ"ל של 1X PBS עם 0.02% Tween 20 (PBS-T). דגירה את התערובת עם סיבוב מקצה על קצה בצינור Eppendorf 1.5-מ"ל עבור שעה 1 ב 4 ° C.
    2. הפרד את חרוזים מהמאגר על ידי הנחת הצינור על סטנד 1.5-מיליליטר MagnaSphere טכנולוגיה מגנטי הפרדה (Promega קורפ, מדיסון, ויסקונסין) המאפשר הנפתח מגנטי ואחריו הסרת supernatant. שטוף את החרוזים המצופים אנטי-GFP עם 1 מ"ל של PBS-T באמצעות pipetting העדין.
    3. Lyse תאי Jurkat transfected הנף-GFP עם 1 מ"ל של 1X Ripa + חיץ על ידי pipetting העדין ודגירה עבור 15 מ 'על קרח. Ripa + חיץ: מאגר תמוגה Ripa 10X, pH 7.4 [Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס] 01:10 מדולל במים סטריליים, 0.02% נתרן אזיד [סיגמא], ונתרן גופרתי dodecyl 0.1% [SDS], עם 1 מ"מ וPMSF 10 μl / מיליליטר PIC הוסיף מייד לפני השימוש.
    4. גלולה פסולת התא על ידי microcentrifugation XG ב 2000 למשך 10 דקות. לאסוף את supernatant (להלן '"lysate").
    5. הוסף 1 מ"ג של חלבון lysate את החרוזים המצופים אנטי-GFP, להביא את הנפח סופי 1 מ"ל עם 1X Ripa + חיץ, ודגירה את התערובת עם סיבוב מקצה על קצה עבור שעה 1 ב 4 ° C. הערה: למחקרי תחרות פפטיד, 1 מ"ג של חלבון lysate ניתן מראש מודגרות עם 2 מיקרוגרם של SMRwt או הפפטיד SMRmut ב 1 מ"ל של 1X Ripa + חיץ, לפני שהוסיף את החרוזים המצופים אנטי-GFP.
    6. שטוף את החרוזים באמצעות resuspension ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף (50 מ"מ טריס • HCl pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו0.1% Tween 20). דגירה עם סיבוב מקצה על קצה עבור 5 דקות ב 4 ° C. הפרד F חרוזיםROM לשטוף באמצעות עמדת ההפרדה מגנטית. שטוף את החרוזים פעם שנייה ושלישית עם מאגרים לשטוף המכילים 250 מ"מ ו 300 מ"מ NaCl, בהתאמה.
    7. Resuspend את חרוזי 200 μl של PBS, להעביר את התערובת לצינור נקי, ולהפריד את החרוזים מלשטוף על הדוכן המגנטי. מרתיחים את החרוזים ב50 μl של מדגם דקות Laemmli חיץ 5 על 95 מעלות צלזיוס, לאפשר לתערובת להתקרר במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, ואחר כך מניח את התערובת על הדוכן המגנטי עבור הפרדה, ולאסוף את supernatants ("eluates") .
    8. הפרד את החלבונים של eluate ידי-SDS על 8-16% ג'ל טריס-HCl קריטריון טרומי.
  3. ספקטרומטריית מסה
    1. בלו להקות החלבון של עניין מהג'לי Coomassie מוכתם.
    2. להפחית את הדגימות ב10 מ"מ 1,4-dithiothreitol (DTT) למשך 45 דקות ב 37 ° C.
    3. Alkylate את הדגימות בiodoacetamide 55 מ"מ עבור 45 דקות ב 25 ° C.
    4. לעכל את דגימות הלילה עם רצף לנסות כיתהpsin (Promega) בשעה 37 ° C.
    5. Desalt את הפפטידים לדוגמה עם C-18 ZipTip (Millipore). מערבבים את הפפטידים לדוגמה עם אלפא CHC מטריקס (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה), ולזהות אותם אל יעד MTP מסגרת III (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA).
    6. בצע פעם desorption / יינון לייזר מטריצה ​​בסיוע של טיסת טנדם ניתוח (MALDI-TOF/TOF) ספקטרומטריית מסה באמצעות ברוקר Daltonics UltraFlex III TOF / TOF.
    7. להשוות את נתוני MS / MS למסדי נתונים שאינם המיותרים ושויצרי-Prot צמח השדה באמצעות אלגוריתם הקמע (www.matrixscience.com).
  4. ניתוח immunoblot
    1. הפרד את דגימות חלבון על ידי-SDS על 4-20% 8-16% או טריס-HCl קריטריון טרומי ג'לי (ביו רד). העבר את להקות electrophoretically לקרום nitrocellulose.
    2. שטוף את הקרום בטריס נאגר מלוח (TBS; ביו רד) למשך 5 דקות. לחסום עם חלב דל שומן 5% בTTBS (TBS עם 0.1% Tween 20) במשך שעה 1 על ידי טלטול בטמפרטורת חדר.
    3. לעבד את הקרום לimmunoblotting באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי בחלב ללא שומן 5% עם הרעד על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטוף בTTBS במשך 20 דקות ואחריו שני נוגדני IgG HRP מצומדת (H + L) בחלב ללא שומן 5% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. שטוף בTTBS במשך 30-60 דקות.
    4. לזהות את להקות חלבון על ידי מגיב לומינול סופג מערבי (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, Inc, סנטה קרוז, קליפורניה). לחשוף את המסנן לסרט צילום. הערה: בחלק מהניסויים, מגיב הפשטה שימש להפשיט את הקרום (פירס, רוקפורד, אילינוי) עם הכלאה לאחר מכן עם נוגדן ראשוני והמשני אחר.
    5. סרוק את סרטי רנטגן לAdobe Photoshop 5.0.2. לבצע ניתוח צפיפות באמצעות תוכנת ImageJ (המכונים הלאומי לבריאות, Bethesda, MD).

השני. שימוש בנוגדן עיכוב בניתוח פונקציונלי

II.1. שיתוף transfection של Antibodies באמצעות ערכה מגיב משלוח חלבון המרכבה

  1. לתערובת תגובת transfection, לדלל 1 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א wtNef-GFP ו1 מיקרוגרם של שני נוגדנים נגד mortalin או טובולין אנטי α נוגדן, לנפח סופי של 100 μl עם 1X PBS. הערה: זה היה בעבר מצא כי שיתוף transfection של הנוגדן אנטי-α טובולין אין כל השפעה לגילוי על הפרשת exNef, ובכך, היא משמשת שלילית שליטה אפקטיבית בניסויים אלה.
  2. לדלל 6 μl של מגיב מרכבה חי לנפח סופי של 100 μl עם מים סטריליים, ולשלב עם תערובת ה-DNA נוגדן בדילול מלא.
  3. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר היווצרות של קומפלקס ה-DNA נוגדן המרכבה /.
  4. 3 10 5 תאים גלולה x Jurkat על ידי צנטריפוגה XG ב 600 במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את תאי פעמיים עם 1X PBS, וresuspend במתחם-DNA נוגדן המרכבה /.
  6. הוסף 400 μl של מדיום סרום ללא RPMI 1640 להשעיה ודגירת גאמות בתרבות צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
  7. הוסף 1 מ"ל של מדיום 1640 RPMI טרי המכיל 10% FBS לכל צלחת, ודגירת התאים למשך 48 שעות ב 37 ° C.

II.2. Assay הנף-GFP הפרשת פלורסנט צלחת הקורא של עיכוב נוגדן

  1. לאסוף את המדיה ממוזגות ללא תא מהתאים שנקטפו, ולהעביר 100 μl לבארות בודדות של צלחת microtiter 96, גם שחורה.
  2. הקרינה מדד ה-GFP בתקשורת על fluorimeter טקאן GENEios עם עירור גל 485 ננומטר ופליטת אורך גל 515 ננומטר ביחידות ניאון יחסיים.
  3. הגדר את רמת הקרינה של ה-GFP בשליטה (מדיה מתאי שיתוף transfected עם הנף-GFP ו-טובולין α נגד נוגדנים) ב 100%.
  4. תשווה את זה לרמה של ה-GFP הקרינה בתקשורת מתאי שיתוף transfected עם נוגדן אנטי mortalin כדי להבחין בשינויים בהפרשה הנף-GFP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיפוי מוטיבים ביולוגי תפקודיים באמצעות פפטידים. שני אזורים זוהו על חלבונים ש'הקערה לגרום לאפופטוזיס. אפופטוזיס פפטיד מונחה נצפה (איור 2) עם תחילת הפפטיד N50 (aa30-50), הגיע לשיא של N60 (aa40-60) וN70 (aa50-70), והולך ופוחת לרמות רקע בפפטיד N100 (aa80-100). המוטיב המרכזי 1 (M1) לשיא, שבמרכז aa50-60, גורם ל> 80% מהרמות אפופטוטיים של החלבון הנף באורך מלא. שיא שני, קטן יותר אפופטוטיים נצפה פורש פפטידים N180 (aa160-180) וN190 (aa170-190). מוטיב זה ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול CD4 תא T וה-CIA שכונן ה-HIV / איידס פתוגנזה. למען מטרה זו, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה של הפרשת exNef, ולהתחיל לקבוע את החלבונים התאיים מעורבים. גישה זו גם הובילה לפיתוח של מעכבי ראשון למקד את הפרשת exNef, פפטיד SMRwt ישירות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIGMS / MBRS (58,268 גרנט), NIH / NCRR / RCMI (גרנט G12-RR03034), מחקר גאורגיה לברית מימון מענק GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA מענק F31AI091484, אמורי CFAR מענק P30 A1050409. חקירה זו נערכה במתקן בנוי עם תמיכה ממחקר שיפור מתקני גרנט # C06 RR18386 מNIH / NCRR. תאי Jurkat, הקבוצה של 20 HIV-1 פפטידים NEF, כמו גם הארנב נגד HIV-1 הנף נסיוב התקבל מ-NIH איידס המחקר והתכנית מגיב הפניה (רוקוויל, מרילנד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סט פפטידים 20mer עם חפיפה של 10 חומצות אמינוNIH AIDS מחקר ותוכנית ריאגנטים4641
TUNEL AssayRoche11 684 809 910
מגיב לאספקת חלבון מרכבהמוטיב פעיל30100
Tecan GENEios fluorimeter(Tecan Group, שוויץ)
צלחת מיקרוטיטר שחורה 96 בארותקורנינג3792
anti-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Dynabeads חלבון G חרוזים מגנטיים Invitrogen100.03D
MagnaSphere Technology מעמד הפרדה מגנטית (שני מצבים)Promega Corp., Madison, WIZ5332
C-18 ZipTip MilliporeZTC18S096שרף C18 (0.6 μ l או 0.2 μ l נפחי מיטה). אוליגונוקלאוטידים או קטנים (< 50 kDa) חלבונים/פפטידים בתמיסה מימית
MALDI TOF/TOFBruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60(2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Peptide ScanningApoptosis AssayCo immunoprecipitationFluorescent MicroscopyFlow CytometryHIV 1 NefSecretion Modification RegionExosome SecretionMortalin BindingPeptide Inhibitors

מאמרים קשורים