מאמר שיטה

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

DOI:

10.3791/50365

⸱

15 ביוני 2013

 ,  , 
1Pediatric Diabetes Research Center, University of California, San Diego, 2Janssen Research & Development, 3Department of Medicine, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון Transcellular הם גורמים חשובים של תפקוד תא בטא בלבלב. מפורט כאן היא שיטה מותאמת ממודל של coculture synaptogenesis-לחוקר כיצד חלבוני הטרנסממברני ספציפיים להשפיע הפרשת אינסולין. HEK293 תאי transfected לבטא חלבונים של עניין; תאים בטא לא צריכים להיות transfected או אחר ישירות מוטרד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא לעזור לתאם את התפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי לבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז. זה הופך להיות יותר ויותר ברור שאינטראקציות בין חלבוני הטרנסממברני על פני השטח של תאי הבטא סמוכים הן גורמים חשובים של תפקוד תא בטא.

הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של mRNA וביטוי חלבונים, שעלול להשפיע על בריאות ו / או בתפקוד תא בטא בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של ההשפעות של אינטראקציות ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים הממוקדים ועשויות למנוע תופעות בשל אינטראקציות בין חלבונים בתוך אותו קרום התא להיות דיסtinguished מההשפעות של אינטראקציות transcellular.

הנה שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות ביכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הבטא מוצגת. שיטה זו ישימה לקווי תא בטא, כמו INS-1 תאים, ותאי בטא ראשוניים ניתק. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאי חלבונים שזוהו חשובים לנהיגת היווצרות הסינפסה. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו מנומקים שהבשלה פונקציונלית תא בטא עשויה להיות מונעת על ידי אינטראקציות transcellular דומות. פיתחנו מערכת שבו תאים בטא בתרבית על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין. במודל זה, הציטופלסמה התא בטא ללא מגע תוך interactio חלבונים תאייםNS הוא מניפולציה. למרות שאנו מתמקדים כאן בעיקר על מחקרים של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין, ניתן לנתח תהליכים אחרים, לדוגמה, שינויים בביטוי גנים, כפי שנקבעו על ידי immunoblotting או qPCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה כדי להקל על חקירות של כמה תחומים תאיים של חלבוני הטרנסממברני ספציפיים ישפיעו הפרשת אינסולין. בדיקות השיטה את ההשפעות של אינטראקציות של החלבון של עניין עם חלבונים (או אולי מולקולות אחרות) על פני התא בטא בלבלב. השיטה מאפשרת לחקירות של איך על פני קרום תא חלבונים המתבטאים על ידי תאי הבטא או על ידי תאי שכנים אחרים (למשל תאי אנדותל, נוירונים, תאי אלפא בלבלב) להשפיע על תפקוד תא בטא דרך אינטראקציות transcellular (כלומר דרך אינטראקציות עם שותפי אינטראקציה על פני צמוד תאי ביתא).

קרום הפלזמה הסלולרי מכיל מערך מורכב של חלבונים מבניים ופונקציונליים המשמשים כגשרים לסביבה תאית. על ידי יצירה של קשרי transcellular או על ידי ייזום של אירועי איתות פלסטיק, אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא יכולות לעזור לתאםתפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי הלבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 גלוקוז. כפי שנחשף, למשל, על ידי את החשיבות של תאי neuroligin-2 אינטראקציות ברגולציה של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין EphA-ephrinA ו, זה הופך להיות יותר ויותר ברור שידע מוגבר של אינטראקציות בין חלבונים תאיים המתרחשות על פני השטח של צמוד תאי הבטא יהיו חשיבות רבה להשגת הבנה מלאה של הפרשת אינסולין, התבגרות של תאי הבטא תפקודי ותחזוקה של הומאוסטזיס הגלוקוז 1-3. המטרה של השיטה המתוארת כאן היא לאפשר חקירות של ההשפעות על תפקוד תאי הבטא של אינטראקציות transcellular מעורבות הטרנסממברני מסוים או חלבונים אחרים, על פני קרום תא, קשורים. על ידי תאי הבטא במשותף עם culturing HEK293 תאי transfected עם בונה ביטוי שונה, את ההשפעות על bתפקוד תא של ETA שונים על פני קרום תא חלבונים שעברו מוטציה או גרסותיהם יכול להיות יעיל נחקר. המטרה זו מושגת מבלי transfect התאים בטא את עצמם.

הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של ה-mRNA תא בטא וביטוי חלבון, שעלול להשפיע על בריאות תא בטא ו / או פונקציה בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של את ההשפעות של אינטראקציות תאי ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים והממוקדים, בהמשך, אינה מאפשר אפקטים בשל אינטראקציות בין חלבונים באו באותו התא כדי להבחין בין ההשפעות של אינטראקציות transcellular. כאן, שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות על יכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הביתא היא described. שיטה זו ישימה לקווי אינסולין תא בטא, כמו INS-1 תאים 4, ומכרסם עיקרי ניתק או תאי ביתא אנושיים. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאים יכולים לזהות חלבונים שכונן היווצרות הסינפסה 5,6. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו סברנו כי תפקוד תא בטא והתבגרות פונקציונלית עשויים להיות מונעים על ידי אינטראקציות 7-9 דומות transcellular. כדי לחקור אינטראקציות אלה, פיתחנו את המערכת המתוארת במסמך שבו תאים בטאו cocultured על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין 10. מערכת זו מאפשרת הציטופלסמה התא בטא להישאר ללא שינוי ואילו אינטראקציות בין חלבונים תאיים הן מניפולציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection של HEK293 Layer

  1. הכן את המדיום סלולרי HEK293 על ידי הוספת 500 מ"ל של DMEM בקבוקים (עם 4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): פתרון 50 מ"ל FBS, 5 מיליליטר 100X פתרון סטרפטומיצין פניצילין /, 5 מ"ל 100x L-גלוטמין ו500 amphotericin μl ב '
  2. צלחת החוצה HEK293 תאים בצלחת 24 גם באמצעות 0.5 מ"ל של HEK293 תקשורת בכל טוב. ודא כי התאים מתחלקים באופן שווה על פני החלק התחתון של הצלחת.
  3. כאשר תאי HEK293 להגיע ל -100% confluency, transfect עם 0.8 מיקרוגרם של פלסמיד קידוד החלבון של עניין (שמותקן בוקטור ביטוי יונקים) ו2 μl של Lipofectamine 2000 על פי פרוטוקול Lipofectamine. יש לנו שבחרנו להשתמש עמוד השדרה 3.3 pcDNA המיועדת לביטוי בתאי יונקים.
  4. לחלופין, אחרי 6 שעות של דגירה, חילופי בתקשורת transfection מתוארות בפרוטוקול Lipofectamine עם HEK293 תקשורת הרגילה.
  5. כדי להעריך את הביטוי של prote transfectedב, קבוצת משנה של בארות תרבית רקמת transfected יכול לשמש לזיהוי immunofluorescent של החלבון ביטא או לניתוח כתם המערבי של ביטוי חלבונים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.

2. קיבוע אופציונלי של HEK293 תאים לבטא חלבון transfected

HEK293 תאי transfected יכולים להיות קבועים בעדינות על מנת להקל coculture בתקשורת שעלולה להזיק לחיים HEK293 תאים (למשל צעד 3.9 להלן) או כדי לאפשר הכנה היעילה מראש של צלחות במשך כמה ניסויים בבת אחת (ראה גם דיון).

  1. לבצע מחקרי טייס לקבוע את מהלך הזמן של הביטוי של החלבון בתאי HEK293.
  2. לאחר transfecting שכבת התאים HEK293, לשאוב את התקשורת מהתאים בנקודת הזמן שלאחר transfection קשורה עם הרמה הגבוהה ביותר של ביטוי. אם זה מתרחש בתוך 24 שעות הראשונה, שלא תשאף עד 24 שעות לאחר transfection.
  3. שטוף HEK293 תאים בעדינות עם D-PBS לאחר מכן להוסיף 500 paraformaldehyde 4% μl (PFA) ולדגור על RT למשך 30 דקות. (כדי להפוך את פתרון PFA 4%, להתחיל עם פתרון של 16% ב1X PBS ולדלל 01:04 עם 1X PBS).
  4. באמצעות PBS סטרילי, לשטוף בעדינות את התאים 3 פעמים ודגירה בPBS O / N ב 4 ° C.
  5. שטוף תאים 3 פעמים עם PBS סטרילית, ולאחר מכן להוסיף PBS ולהשאיר על 4 מעלות צלזיוס עד צורך (זמן אחסון מרבי עשוי להשתנות בהתאם לחלבון ביטא. אנו מאחסנים HEK293 תאי transfected להביע isoforms neuroligin עד 2 שבועות ללא שינויים משמעותיים בתופעות שנצפו על הפרשת אינסולין).

3. שיתוף culturing של INS-1 תאים בטא עם HEK293 תאים

  1. הכן INS-1 תקשורת על ידי הוספת 500 מ"ל RPMI 1640 (עם גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): 50 מ"ל FBS, 5 מ"ל 100X פניצילין / סטרפטומיצין, פתרון 5 מ"ל 100X L-גלוטמין, 5 פירובט נתרן מ"ל, 500 amphotericin μl ב ', 500 בטא mercaptoethanol μl (זה כמעט זהה לMediאום משמש בדרך כלל לתרבות איון העיקרית, פרט לתוספת של בטא mercaptoethanol).
  2. שימוש בסלולרי, חשפנית (או מסיר תא אחר שאינם האנזימטית), INS-1 קציר תאים בכ 70-80% confluency את החלק התחתון של בקבוק תרבות T75. כל בקבוק יספק בערך מספיק תאים במשך 48 בארות.
  3. לאחר שצנח בתאי צנטריפוגות במשך 3 דקות ב -1,200 סל"ד, resuspend בתמהיל של 50/50 INS-1 ומדיה HEK. לבקבוק 70-80% ומחוברות של INS-1 תאים, resuspend בכ 25 מ"ל של טכניקה מעורבת.
  4. אם אתם משתמשים בHEK293 תאים שתוקנו בparaformaldehyde במקום HEK293 תאי חיים, resuspend תאי INS-1 ב 100% INS-1 תקשורת ולא בטכניקה מעורבת.
  5. בעזרת פיפטה 10 מ"ל, לסלק את התאים מהגלולה כדי להפוך את השעיה תא הומוגנית.
  6. לשאוב להסיר את המדיה על HEK293 תאים.
  7. בעזרת פיפטה P1000, בעדינות להוסיף 500 μl של אח"י-1 השעיה תא על גבי שכבת תאי HEK לאורך הצדדים of כן. אחרי כל 6 בארות, השתמש פיפטה 10 מ"ל לresuspend תאי INS-1 שוב כדי להבטיח השעיה תא הומוגנית. התכנית הכוללת של הגדרת coculture מתוארת באיור 1.
  8. דגירה התאים עבור 24-48 שעות, בהתאם לפרוטוקול הניסוי.
  9. אם נדרש יותר מ 48 שעות coculture תקופה, להשתמש בשלבים אופציונליים בסעיף 2 לעיל כדי לתקן את HEK293 תאים.
  10. אם אתם משתמשים במכרסם ניתק ראשוני או איונים אדם [ר 'לדוגמא פרוטוקולים קודמים ביופיטר 11-15], להבטיח שתקשורת מתאימה כגון RPMI עם 5 מיליליטר עט / סטרפטוקוקוס, 5 מיליליטר L-שפע, 0.5 מ"ל amphotericin-B משמשת במקום INS-1 תקשורת. למרות שניתן להשתמש בתאי איון ניתק בצלחת גם 24, בפועל, בגלל המספר הגדול של איונים פוטנציאל הדרושים, מומלץ שהתמורה תינתן לשינוי קנה מידה למטה לצלחת גם 48 (שחייב איון תאים פחות לכל טוב). על צלחת 48 היטב, להוסיף כ -100 איים בשווי של dissociaטד תאים לכל צלחת להתחיל. בהתאם ליעילות של ניתוק ושיטה, פחות איים ייתכן שיידרשו.

4. גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין

  1. Preincubate תאים ב250 μl של גלוקוז 2.5 מ"מ בKRB (חיץ יקרבונט קרבס-רינגר) למינימום של שעה 1. לpreincubate, להסיר בינונית coculture ולהחליף באופן מיידי עם KRB. מטבע זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם, כדי לצמצם את החשיפה של תאי INS-1 לחמצן סביבתי. לשאוב עם יד אחת בזמן pipetting KRB הנמוך גלוקוז (2.5 מ"מ) עם האחר.
  2. KRB preincubation Exchange כדי μl 250 של או 2.5 מ"מ או 20 מ"מ גלוקוז בKRB חיץ אחד טוב בכל פעם.
  3. אם מתאים לניסוי הספציפי, secretagogues נוסף כגון IBMX מיקרומטר 100 ניתן להוסיף כדי לייצר תגובת הפרשת אינסולין חזקה יותר מגורה. תאים בטא איון עיקריים ניתקים בפרט הם גרועים מגיבים לגדלו אלון ריכוזי גלוקוזדואר, אז הנה במיוחד תוספת של IBMX או אחר secretagogues צריך להיחשב 16,17.
  4. לאחר שעה 1 של דגירה, להעביר תקשורת לmicrofuge צינורות וספין 1,500 XG במשך 5 דקות.
  5. הסר 200 μl של supernatant ולהשתמש בזה לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA.
  6. כדי להכין lysate תא, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא Ripa (150 מ"מ NaCl, 1.0% IGEPALCA-630 או Nonidet P-40, deoxycholate נתרן 0.5%, 0.1% SDS, 50 מ"מ טריס, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז ל צלחת מייד לאחר הסרת תקשורת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  7. ספין למטה lysate במשך 15 דקות ב10,000 XG ולהסיר 50 μl של supernatant לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בשיטה המתוארת כאן, יש לנו בדקנו את ההשפעה של גרסאות של neuroligin החלבון על הפרשת אינסולין שונות. זה משלים את העבודה שלנו פרסמה חוקרת את ההשפעה של neuroligin-2 על תפקוד תא בטא 10. איור 2, למשל, מתאר את התוצאות שהתקבלו מINS-1 coculturing תאים בטא עם HEK293 תאי transfected להביע איזופורם neuroligin המכונה כאן NL- X. ניסוי זה נועד לבדוק את ההשערה כי NL-X עוסק באינטראקציות transcellular המגבירים את הפרשת אינסולין. באיור 2 א, ניתן לראו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת coculture המתוארת כאן מספקת דרך יעילה כדי לקבוע את החשיבות הפיזיולוגית של חלבונים בטא על פני קרום תא, הטרנסממברני ספציפיים, ובמיוחד של תחומים תאיים שלהם. על ידי תאי הבטא culturing או תאי insulinoma (כגון תאי INS-1 המועסקים כאן) במגע עם תאי HEK293 מוצגות חלבון של עניין על פני התא, יכולים להיות מתוכננים ניסויים כדי לקבוע את ההשפעות של אינטראקציות בין חלבונים תאיים בלי להפריע ישירות הסביבה תאית של התאים. מאחר שהחלבונים של העניין באים לידי ביטוי על ידי HEK293 תאים, כל השפעות על ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענק R01DK080971 וJuvenile Diabetes Research Foundation מענק 37-2009-44. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה שקיבל ממרכז מחקר UCSD הילדים הסוכרת (PDRC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pcDNA 3.3 וקטור / עמוד שדרהInvitrogenK830001
Lipofectamine 2000Invitrogen18324012
DMEMMediatech45001-312
פתרון עט / סטרפטוקוקוסMediatech45001-652-1
Amphotericin BMediatech45001-808-1 / 30
RPMI-1640Mediatech45001-404
D-PBSMediatech45001-434
נתרן פירובטMediatech45001-710-1
2-Mercapt– תנולInvitrogen21985023
חשפנית תאיםMediatech45000-668
T75 בקבוקBD1368065
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50980487
10x PBSMediatech45001-130
סרום בקר עובריMediatech MT35010CV
IBMXSigmaI5879-100MG
RIPA מאגר ליזהSigmaR0278

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  2. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
  3. Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).
  4. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
  5. Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
  6. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  7. Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
  8. Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
  9. Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
  10. Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
  11. Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
  12. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).
  13. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255(2007).
  15. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
  16. Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
  17. Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
  18. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
  19. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
  20. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HEK293Radioimmunoassay

מאמרים קשורים