פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.
מבוא
כ 80% מהמשקל הטרי של פקעת תפוח אדמה הוא מים; כמעט את כל החומר היבש שנותר הוא עמילן 1. רוב העמילן (70%) מורכב מamylopectin, והשאר הוא amylose. היחס בין amylose וamylopectin הוא הנכס החשוב ביותר המשפיע על התכונות הפיסיקליות של עמילן. Amylose הוא שרשרת גלוקוז ליניארי אלפא 1-4, בעוד amylopectin היא שרשרת אלפא 1-4 ליניארי עם אלפא 1-6 ענפים 2. שיטות כגון יוד מחייבות, פער הסריקה calorimetry (DSC), כרומטוגרפיה גודל ביצועים גבוהים הדרה (HPSEC) ואינטראקציות concanavalin פותחו עבור נחישות עמילן במינים יבול שונים 3,4. כל פרוטוקול דורש מיומנויות וציוד מיוחדים, מה שהופך את זה קשה בהיקף של עד לכמת דוגמאות רבות בכל פעם. השיטה שאנו מציגים כאן היא פרוטוקול שונה מHovenkamp-Hermelink et al. 5 שהוא יוד אורך גל כפולה מחייבתשיטה מבוססת על גרגרי עמילן מוכתמים. היתרונות של שיטה זו לעומת אחרים כוללים קביעת amylose מעמילן גלם ללא מטהר אותו ואת השימוש במערכת אורך הגל הכפולה כדי להגדיל את הדיוק של 4,6 השיטה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. קביעת amylose מעמילן פקעת תפוח האדמה
- מקלפים וחותכים פקעות טריות לקוביות קטנות.
- מניחים קוביות תפוחי אדמה בשקיות חומות קטנות ולאחסן לילה בשעה -80 ° C.
- העבר את קוביות תפוחי אדמה לשקיות ניילון ולייבוש בהקפאה.
- לאחר ההקפאה יבשה, לטחון את מדגם תפוחי האדמה לאבקה באמצעות מכתש ועלי או מיל ויילי.
- בצינור 50 מיליליטר, להוסיף 20-30 מ"ג, מדגם פקעת קרקע המיובש בהקפאה.
- הכן פתרון של 45% (w / v) חומצת perchloric (לערבב 24.4 מיליליטר של 60% חומצת perchloric ו25.6 מיליליטר של מים טהורים.
- הוסף 500 μl של 45% (w / v) חומצת perchloric ולנער או לערבל אותו כדי לפזר גרגרי עמילן.
- לאחר תקופת דגירה של ארבע דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 16 מיליליטר של מים טהורים לפתרון ומערבבים על ידי vortexing.
- אחרי חומר שאינו מסיס יש התיישב לחלק התחתון של הצינור (7-10 דקות מאוחר יותר), להעביר 40 μl של הפתרון לצלחת microtiter (הימנעות pipetting של כל חלקיקים).
- הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים את המדגם על ידי pipetting.
- קראו את הספיגה ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר.
- לקבוע את אחוז amylose לאחר שהשווה את יחס amylose / amylopectin של כל דגימה (620 ספיגת nm/550 ננומטר) עם עקומת סטנדרט שנוצרה מפתרונות amylose וamylopectin בטווח של ריכוזים. הליך זה יתואר הבא. קראו (תמיסת יוד וחומצת perchloric) ריקות יחד עם דגימות הבדיקה. שימוש נמחק הנתונים לניתוחים.
2. Curve amylose / amylopectin
- בצינורות נפרדים שוקלים 12.5 מ"ג amylose ו12.5 מ"ג amylopectin.
- הוסף לכל 5 מיליליטר שפופרת של 45% (w / v) חומצת perchloric ומתמוסס לחלוטין.
- עבור כל אחד מהפתרונות (amylose וamylopectin), מביא לנפח סופי של 50 מיליליטר עם מים טהורים.
- מערבבים 6.25מיליליטר של מניית amylose מהשלב הקודם עם 18.75 מים טהורים מיליליטר. זה יהפוך את פתרון amylose 6.25 מ"ג / מיליליטר.
- חזור על התהליך עבור פתרון amylopectin.
- שימוש amylose ופתרונות סטנדרטיים amylopectin מצעדים 2.4 ו2.5, להכין את הסטנדרטים amylose אחוזים שהם amylose 0-100% (amylopectin 100-0%) לנפח סופי של 5 מיליליטר כדי ליצור עקומת הסטנדרט במרווחי 10%.
לדוגמה, כדי להכין:
0% amylose / 100% סטנדרטיים amylopectin, פיפטה 5 פתרון amylopectin מיליליטר.
10% amylose / 90% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 0.5 amylose מיליליטר ו4.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
20% amylose / 80% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.0 amylose מיליליטר ו4.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
30% amylose / 70% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.5 amylose מיליליטר ו3.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
40% amylose / 60% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
Amylose 50%/ 50% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.5 amylose מיליליטר ו2.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
60% amylose / 40% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 3.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר amylopectin, וכן הלאה). - העבר 40 μl של כל תערובת סטנדרטית לצלחת microtiter. כולל גם עם 40 μl 45% (w / v) חומצה perchloric כריקה.
- הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים כל מדגם (כולל את החסר) על ידי pipetting.
- קראו absorbances ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר ולחשב את יחס amylose / amylopectin עבור כל ריכוז.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עקומת הסטנדרט שנבנתה מנתונים נמחקו מפתרוני ריכוז amylose / amylopectin שונים מציגה יחס הספיגה משוער נע .7-1.6 (טבלה 1). קו המגמה של רגרסיה ליניארית מנתונים אלה שימש מאוחר יותר כדי להסיק מסקנת תוכן amylose בדגימות תפוחי אדמה הקפאה יבשה (איור 1).
יש סביבת ייצור צמח השפעה כלשהי על תוכן amylose בפקעת תפוח האדמה 7. קביעות תוכן amylose משוכפלים בשני מיקומי שדה נפרדים הראו ור...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תוכן amylose בפקעות תפוח אדמה בדרך כלל נע בין 20-35% 7,8. אם רוב הערכים הם מחוץ לטווח זה, שקול שגיאות אפשריות הבאות: 1) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לבניית עקומת סטנדרט amylose / amylopectin; 2) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לקביעת amylose / יחסי amylopectin מדגימות תפוחי האדמה, או 3) המים המשמשים לניתוח לא היו טהורים מספיק. שמנו לב שעל ידי שימוש במים מזוקקים ומים לא אולטרה טהורים בניתוח, הערכים שהתקבלו לא היו לשחזור. דרך קלה כדי לוודא שתמיסת יוד מו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
מימון למחקר זה מסופק בחלקו על ידי תכנית עמיתים מחקר USDA-ARS והוועדה germplasm היבול של משרד החקלאות האמריקנית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק> ריאגנטים | |||
| עמילוז | סיגמא | 859656 | |
| עמילופקטין | סיגמא | A8515 | |
| חומצה פרכלורית 60% | סיגמא | 311413 | מסוכן מאוד לעור ולעיניים |
| יוד | סיגמא | 23214TD | |
| אשלגן יודיד | סיגמא | 08625JE | |
| קורא צלחות | Bio Tek | ELx800 |
מקורות
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
