ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים החיים In vivo הדמיה לביצוע ניתוח בזמן קורס של ילודים נגועים בוירוס לוציפראז-רקומביננטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ציטומגלווירוס האנושי (או HCMV HHV-5) הוא מחולל מחל מסכנת חיים בחיסון אנשים שנפרצו. עם זיהום מולד או ילוד, הווירוס יכול להדביק ולשכפל במוח המתפתח, אשר עלול לגרום לניזק נוירולוגים חמור, כולל חירשות ופיגור שכלי. למרות החומרה הפוטנציאלית של התסמינים, האפשרויות הטיפוליות מוגבלות על ידי חוסר הזמינות של חיסון והעדר טיפול אנטי ספציפי. יתר על כן, תיאור מדויק של אירועים המולקולריים המתרחשים במהלך הזיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא עדיין חסר מאז תצפיות נובעות בעיקר מהנתיחה שלאחר המוות של ילדים נגועים. כמה מודלים של בעלי חיים, כגון CMV רזוס מקוק, פותחו וסיפק תובנה חשובות בפתוגנזה CMV של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות הקרבה האבולוציונית שלו עם בני אדם, מודל זה היה מוגבל על ידי הליך החיסון תוך גולגולתי משמש כדי להדביק את החיות וחסרונותistently לגרום לזיהום מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, שיקולים אתיים קידמו את הפיתוח של מודלים חלופיים, ביניהם זיהום בילוד של עכברי בני יומם עם עכבר ציטומגלווירוס (MCMV) הוביל לאחרונה להתקדמות משמעותית. לדוגמה, דווח כי זריקת intraperitoneal של MCMV לילודי Balb / ג מובילה לזיהום של תאי עצב ותאי גלייה באזורים מסוימים במוח. ממצאים אלו הראו כי חיסון ניסיוני של עכברים עשוי לסכם את הגירעונות הנגרמים על ידי זיהום HCMV בילדים. עם זאת, ניתוח דינמי של זיהום MCMV של ילודים הוא קשה לביצוע, כי המתודולוגיה קלסית דורשת הקרבה של מספר לא מבוטל של בעלי חיים בנקודות זמן שונים על מנת לנתח את נטל ו / או פרמטרים הקשורים לחיסון הנגיפי. כדי לעקוף את צוואר הבקבוק הזה ולאפשר לחקירות עתידיות של בעלי חיים שעברו מוטציה נדירות, אנחנו מוחלים in vivo הדמיה הטכנולוגיה כדי לבצע ניתוח בזמן קורס של Viraהפצת L במוח על הזרקה היקפית של MCMV רקומביננטי להביע לוציפראז לC57BL / 6 ילודים.
מבוא
ציטומגלווירוס האנושי (HCMV/HHV-5) הוא חבר של משפחת β-ההרפס. HCMV היא הפתוגן שכיח ביותר, אופורטוניסטי שהוא בדרך כלל שנרכש במהלך חייו המוקדמים כזיהום ללא תסמינים 1. כמו כל herpesviruses, HCMV נמשכת לאורך כל חייו של המארח שמערכת חיסון חזק שולטת שכפול נגיף. פרקים של הפעלה מחדש נגיפית בעיקר להתרחש אצל אנשים מדוכאי חיסון, כגון חולים להשתלה מקבלים תרופות למניעת דחיית שתל 2. אצל מבוגרים, HCMV גם קשורה לglioblastomas 3. בנוסף, HCMV היא הפתוגן בולט עבור תינוקות עם חסינות בשלה 4-6. הדבקה ראשונית בעובר או ילוד הפיתוח יכולה להיות השלכות חמורות. HCMV זיהום הוא הסיבה זיהומית הנפוצה ביותר של מומים מו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ההשעיה ויראלי
- השג את זן סמית לוציפראז להביע MCMV (MCMV לוק 15) ממעבדתו של אולריך Koszninowski. בזה רקומביננטי, הגן בלוציפראז מוכנס במוקד IE2 של הגנום MCMV.
- כדי להגביר MCMV לוק, להדביק קו עכברי מח עצם סטרומה תא (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) עם MCMV בריבוי שונה של זיהום (משרד הפנים, 0.001 ל -1) 16. לשם כך, להוסיף וירוס לתאים בתרבית במדיום חופשי בסרום על 37 ° C. לאחר שעה, להסיר את supernatant ולהחליף אותו עם DMEM בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS). חמישה ימים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניסוי נציג מודגם באיור 1. על זריקת intraperitoneal של 50 PFUs של MCMV לוק (לוח מראה זריקה דומה הופיעה עם מתילן הכחול כדי להמחיש את המסלול תת עורית של המחט), ילודים היו מורדמים וקיבל בו זמנית 0.3 מ"ג של מצע לוציפראז (Luciferin, קליפר). רבע שעה לאחר מכן, בעלי החיים הונחו צד הגחון בחדר רכישת IVIS 50 (במערכת הדמית vivo, קליפר) והאור הנפלט ע"י כל בעלי החיים נתפס במהלך חשיפת שנייה 10. לוח ב 'מציג תמונת מצב תמונות שצולמו בימי 7, 9, 11 ו -14 עם התוכנה (חיים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שימוש בטכנולוגיית ההדמיה vivo כדי לפקח על הפצת MCMV לוק בילודים עכברים, היינו מסוגלים להתבונן התפשטות נגיף למוח של בעלי חיים שעברו מוטציה, בניגוד לטבע מהסוג. נתיחה נוספת של בעלי החיים וההדמיה vivo לשעבר של המוח אישר את נוכחותו של וירוס זורח במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, אנחנו גם ביצע אימונוהיסטוכימיה (לא מוצג) בסעיפים דקים מוח עם נוגדנים ספציפיים לחלבון מוקדם MCMV E1 וציינו כי אכן, MCMV נמצא באותם אזורים כמו אלה שבם הארה התגלתה, ובכך מצביעים על כך שההדמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.
הצהרת אתיקה
בעלי חיים הוחזקו בתנאי הפתוגן ללא במתקן הטיפול בבעלי החיים של מכון d'et d'Immunologie Hématologie. טיפול בעכברים ונהלי ניסוי נערכו בהתאם לחוק הצרפתי להגנה על חיות מעבדה. הנוהל אושר על ידי שירות véterinaire דה לה פריפקטורה du Bas-Rhin (צרפת) תחת מספר האישור-67-345.
תודות
אנו מודים לי Tuddenham (IBMC, שטרסבורג) להגברה וtitrating MCMV לוק ותומס Baumert (INSERM U748, שטרסבורג) לאישור להשתמש במתקן בעלי החיים של המכון לווירולוגיה. תמיכה כספית מINSERM, אוניברסיטת דה שטרסבורג וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR-08-הבעה-005-01) היא הודתה. ההשתתפות הראשונית של סוניה Beroud והלטישה Lelieur במהלך פרויקט הורים שלהם היא גם הודתה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מגיב / חומר< / חזק> | |||
| DMEM | פישר סיינטיפיק | W3523A | |
| מתילן כחול | סיגמא אולדריץ' | 319112 | |
| מחטי אינסולין | VWR | 613-4897 | |
| קטמין | CentraVet | Ket 201 | |
| קסילזין/וטרנל | סיגמא אולדריץ' | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| קליפר לוציפרין | 760504 | ||
| גנטמיצין | סיגמא אולדריץ' | G1272 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | גיבקו | 15070 | |
| קרבוקסימתיל צלולוז | סיגמא אולדריץ' | C4888 | |
| פורמלדהיד | סיגמא אולדריץ' | F8775 | |
| קריסטל סגול | סיגמא אולדריץ' | C3886 | |
| <חזק>ציוד | |||
| IVIS 50 | קליפר/פרקין אלמר |
מקורות
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cy....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
