שימוש<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים

סיכום

ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים החיים In vivo הדמיה לביצוע ניתוח בזמן קורס של ילודים נגועים בוירוס לוציפראז-רקומביננטי.

תקציר

ציטומגלווירוס האנושי (או HCMV HHV-5) הוא מחולל מחל מסכנת חיים בחיסון אנשים שנפרצו. עם זיהום מולד או ילוד, הווירוס יכול להדביק ולשכפל במוח המתפתח, אשר עלול לגרום לניזק נוירולוגים חמור, כולל חירשות ופיגור שכלי. למרות החומרה הפוטנציאלית של התסמינים, האפשרויות הטיפוליות מוגבלות על ידי חוסר הזמינות של חיסון והעדר טיפול אנטי ספציפי. יתר על כן, תיאור מדויק של אירועים המולקולריים המתרחשים במהלך הזיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא עדיין חסר מאז תצפיות נובעות בעיקר מהנתיחה שלאחר המוות של ילדים נגועים. כמה מודלים של בעלי חיים, כגון CMV רזוס מקוק, פותחו וסיפק תובנה חשובות בפתוגנזה CMV של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות הקרבה האבולוציונית שלו עם בני אדם, מודל זה היה מוגבל על ידי הליך החיסון תוך גולגולתי משמש כדי להדביק את החיות וחסרונותistently לגרום לזיהום מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, שיקולים אתיים קידמו את הפיתוח של מודלים חלופיים, ביניהם זיהום בילוד של עכברי בני יומם עם עכבר ציטומגלווירוס (MCMV) הוביל לאחרונה להתקדמות משמעותית. לדוגמה, דווח כי זריקת intraperitoneal של MCMV לילודי Balb / ג מובילה לזיהום של תאי עצב ותאי גלייה באזורים מסוימים במוח. ממצאים אלו הראו כי חיסון ניסיוני של עכברים עשוי לסכם את הגירעונות הנגרמים על ידי זיהום HCMV בילדים. עם זאת, ניתוח דינמי של זיהום MCMV של ילודים הוא קשה לביצוע, כי המתודולוגיה קלסית דורשת הקרבה של מספר לא מבוטל של בעלי חיים בנקודות זמן שונים על מנת לנתח את נטל ו / או פרמטרים הקשורים לחיסון הנגיפי. כדי לעקוף את צוואר הבקבוק הזה ולאפשר לחקירות עתידיות של בעלי חיים שעברו מוטציה נדירות, אנחנו מוחלים in vivo הדמיה הטכנולוגיה כדי לבצע ניתוח בזמן קורס של Viraהפצת L במוח על הזרקה היקפית של MCMV רקומביננטי להביע לוציפראז לC57BL / 6 ילודים.

מבוא

ציטומגלווירוס האנושי (HCMV/HHV-5) הוא חבר של משפחת β-ההרפס. HCMV היא הפתוגן שכיח ביותר, אופורטוניסטי שהוא בדרך כלל שנרכש במהלך חייו המוקדמים כזיהום ללא תסמינים ^1. כמו כל herpesviruses, HCMV נמשכת לאורך כל חייו של המארח שמערכת חיסון חזק שולטת שכפול נגיף. פרקים של הפעלה מחדש נגיפית בעיקר להתרחש אצל אנשים מדוכאי חיסון, כגון חולים להשתלה מקבלים תרופות למניעת דחיית שתל ^2. אצל מבוגרים, HCMV גם קשורה לglioblastomas ^3. בנוסף, HCMV היא הפתוגן בולט עבור תינוקות עם חסינות בשלה ^4-6. הדבקה ראשונית בעובר או ילוד הפיתוח יכולה להיות השלכות חמורות. HCMV זיהום הוא הסיבה זיהומית הנפוצה ביותר של מומים מולדים מולדים והפרעות ילדות במדינות מפותחות. ההערכה היא כי השכיחות של זיהום HCMV ילוד משפיעה על 0.5-1% oF כל הלידה חי בין 5-10% שיסבלו מתסמינים חמורים כגון microcephaly או hypoplasia המוח הקטן. בנוסף, 10% מהתינוקות שנדבקו בזיהום נגיפי תת קליני יהיו מאוחר יותר לפתח sequellae מוביל לפיגור שכלי, אובדן שמיעה, ליקויים חזותיים או התקף אפילפסיה ^ו7,8.

בניגוד לherpesviruses אדם אחר כגון הרפס סימפלקס 1 (HSV-1/HHV-1) אשר ניתן לעכברים מחוסן דרך נתיבים של הזרקה ⁹ שונים, שכפול ציטומגלווירוס הוא מינים ספציפיים. תכונה זו פגעה קשה בחקירות של פתוגנזה HCMV אשר בוצעו במודלים של בעלי חיים שונים (עכבר, חולדה, חזיר, קוף רזוס) וCMVs מארח הספציפי האמיתי שלהם. כל CMVs מפגין דמיון משמעותי בגודל הגנום וארגון, כמיהות רקמות ורגולציה של ביטוי גנים. הם גם לגרום למחלות דומות במארח שלהם, בהתאמה. למרות גיוון גנטי להיותTween HCMV וציטומגלווירוס העכבר (MCMV) (50% מORFs להציג בוירוס האנושי מזוהים בCMV העכברי), מודל העכבר הוכיח לאחרונה להיות יתרון, בעיקר משום שניתן לבדוק זנים מוטנטים ליכולת שלהם לשלוט ויראלי שכפול in vivo. זה הוביל למסך גנטי שאפשרו הערכה של מספר הגנים עכבר לידי ביטוי בשלב הבוגר המרכיבים את "resistome" לווירוס הזה ^10. בסך הכל, זה מצביע על כך MCMV עכברים נגועים מייצגים מודל אטרקטיבי לחקר אינטראקציות בין מאכסן לוירוס במבוגרים. החקירה של זיהום CMV מולד היא מורכבת יותר בגלל הבדלים בארגון שכבת שליה בין אדם ועכברים לפגוע בשידור אם לעובר של זיהום ויראלי בעכברים. לאחרונה, הזרקה ישירה של MCMV בשליה ביום 12.5 להריון אפשרה זיהום המוח של ילודים עכברים שהביאו לליקוי שמיעת ^11. עם זאת, רובnvestigations כעת להשתמש בזריקת intraperitoneal של 4-20 ילודים בני שעה כדי לספק הפצה נגיפית מערכתית שעלולים לגרום לדלקת מוח hematogenous, מודל שהוא יותר רלוונטי מזו של הזרקה תוך גולגולתי. פרוטוקול זה סיפק תובנה חשובות פתוגנזה CMV ועוד במיוחד, זה הודגם כי זיהום MCMV של תוצאות יילודים בשכפול נגיף בתאים עצביים וגליה נמצאים במוקדים דלקתיים אשר חדרו עם תאי mononuclear כמו מקרופאגים ^12. דו"ח זה גם תאר המורפוגנזה שינתה של המוח הקטן מלווה עם התפשטות פחת פרטנית נוירון והגירה והאינדוקציה של גני אינטרפרון מגורה מרובים. התפקיד החיוני של CD8 + תאי T לשליטת MCMV במערכת העצבים המרכזית שדיווח גם על ידי אותה הקבוצה ^13. היבט חשוב לשקול בעת ניתוח ההשפעה פתולוגית של חיידק הוא את הדינמיקה של להדביקיון. במקרה של MCMV, זה חיוני במיוחד כדי לחקור ולכמת את ההתקדמות של הפצת נגיף למוח המתפתח, כדי להבין ולחזות את סדר הגודל של פציעות הנוירוביולוגי בעתיד. באופן מסורתי, כימות של ההתקדמות של זיהום דורשת הקרבה הקבועה של בעלי חיים נגועים לכיילה את הפתוגן ברקמות, כגון מוח, שהם נגישים אחרים. זה סוג של פרוטוקול כעת לערער על ידי שיפור הכרחי של רווחת בעלי חיים ואת 3Rs (צמצום, מקד, החלף) ¹⁴ עקרונות. שימוש בטכנולוגיות ההדמיה vivo עשויה לאפשר הפחתה דרסטית של מספר בעלי החיים אשר נחוצות בזיהום בניסויי vivo. כאן אנו מדווחים ומתארים את ניתוח בזמן קורס של הפצה נגיפית אל תוך המוח על זריקת intraperitoneal MCMV לוק לילודי עכבר. שימוש באותם בעלי החיים, אנחנו במעקב והפיקוח in vivo האתרים של vi האינטנסיבישכפול RAL בתקופה 2 בשבוע.

פרוטוקול

1. הכנת ההשעיה ויראלי

1. השג את זן סמית לוציפראז להביע MCMV (MCMV לוק ¹⁵⁾ ממעבדתו של אולריך Koszninowski. בזה רקומביננטי, הגן בלוציפראז מוכנס במוקד IE2 של הגנום MCMV.
2. כדי להגביר MCMV לוק, להדביק קו עכברי מח עצם סטרומה תא (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) עם MCMV בריבוי שונה של זיהום (משרד הפנים, 0.001 ל -1) ^16. לשם כך, להוסיף וירוס לתאים בתרבית במדיום חופשי בסרום על 37 ° C. לאחר שעה, להסיר את supernatant ולהחליף אותו עם DMEM בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS). חמישה ימים לאחר מכן, לקצור את מדיום התרבות וaliquots החנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
3. טיטרציה של ההשעיה נגיפית על ידי assay פלאק.
   1. פיצול תאי 3T3 (ATCC # CRL-1658) בצלחת גם 24 ב40,000 תאים / היטב ב1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FCS המכיל פניצילין (200 IU / מ"ל) וsteptomycin (200 מ"ג / מ"ל) ו דגירה 24 שעות ב 37 ° C.
   2. הכן דילולים סידוריים (10 ^-1 עד 10 ^-8) של aliquot של ההשעיה MCMV בDMEM ולהדביק תאי המטרה (3T3) עם 200 μl דילול לאחר הסרת מדיום תרבות תא. דגירה שעה 1 ב 37 ° C. הוסף 1 מ"ל של למעלה בינוני (DMEM FCS 3%, 2% (V / V) gentamycin, 200 IU / ml פניצילין, 200 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 8 גרם / L carboxymethyl תאית) ודגירה 5 ימים על 37 ° C.
   3. תקן את התאים על ידי הוספת 200 פורמלדהיד 10% μl (דילול של פורמלדהיד עם מים צריך להיעשות במנדף כימי, כדי למנוע אינהלציות רעילות) זה טוב, ודוגר 6 שעות בטמפרטורת חדר. סור בינוני תרבות + קיבוע על ידי pipetting את הפתרון ולהוסיף 200 מכתים תא μl (1% קריסטל סגול (W / V) ב20% אתנול). לפני השימוש, לדלל חלק 1 עם 9 חלקי מים מילי-Q. דגירה 2 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף את צלחת 3-4x על ידי שרייתו במים, שלא תתייבש ולספור את מספר השלטים עם משקפת.
4. לדלל MCMV לוק בDMEM להשיג 50 PFUs ב50 μl ולהשאיר על קרח עד לשימוש נוסף. שימוש inoculums נגיפי גבוה יותר גורם קטלני לפני הילודים להגיע 2-3 שבועות של גיל. מניסיוננו, 500 PFUs לגרום קטלני בכל 5 עד 7 ימי ילוד לאחר הזרקה.

2. הזרקה של ילודים

1. כאשר ילודים (4 עד 20 עכברים, ישנים שעות) זמינים, לתפעל את ההמלטה והצואה של הכלוב עם כפפות לפני הטיפול בזהירות את הגורים כדי למנוע זיהום עם ריחות "זרים" שידגיש את אמו ולגרום לדחייה של הגורים .
2. לבצע זריקת intraperitoneal באמצעות מזרק אינסולין (29-G) כפי שמוצג באיור 1 א. החזק את הילוד עם עור הגב. עם צד עד הגחון, להציג את המחט מתחת לרגל הקדמית ולדחוף אותו בעדינות מתחת לעור כדי להשיג חלל הצפק (קצת מתחת לטבור). בשלב זה אנו להזריק 1% מתילן הכחולים מדולל DPBS ולפקח על הישרדות לעמפרקטיקות טכניקה לפני ביצוע זיהומים ויראליים. מאז תילן כחול נראה בבירור במהלך תהליך ההזרקה, אנו ממליצים על ביצוע הזרקה זו "הכשרה" ראשון, כדי להבטיח אספקה ​​נאותה של ההשעיה נגיפית בחלל intraperitoneal.
3. לחסל את טיפות הדם הזעירות שעלולים להתעורר ואת המקום בחזרה הילוד לתוך הכלוב.

3. בשנת vivo ההדמיה

1. ביום 7, לטפל בילודים עם אותו מזהיר כאמור. הזרק intraperitoneally תערובת של חומרי הרדמה (4 מ"ג / מיליליטר קטמין, 0.8 מ"ג / מיליליטר xylazine) וluciferin (0.15 משקל גוף מ"ג / גר ') ב50 μl בכל חיה. משקל גוף ממוצע של בעלי החיים הוא 1-2 גרם ומינון של חומרי הרדמה לבעלי חיים הוא: 40 מיקרוגרם קטמין, מיקרוגרם xylazine 8 חכה 12-15 דקות עד שמגיע למקסימום של luciferin פליטה שלה. זה צריך להיקבע מראש ותלוי במערכת ההדמיה משמשת הספק וluciferin.
2. בעוד הגורים הם anesthetiZed, לתייג אותם לזיהוי בעתיד ולקצור פיסה קטנה של רקמה שלאחר מכן ניתן להשתמש עבור genotyping עתיד אם נמצאים בשימוש בעלי חיים שעברו מוטציה.
3. מניחים את הגורים במערכת ההדמיה ולבצע רכישה של האור הנפלט ע"י הגוף כולו. שבעה ימים לאחר הדבקה, הווירוס משוכפל לעותקים רבים באיברי המטרה כגון כבד, כליות, ריאות ובלוטות רוק, ולכן משך חשיפה צריך להיות קצר. במקרה שלנו, שאנו מבצעים את הרכישה עבור 10 עד 20 שניות (איור 1). הפלטפורמה בתא רכישת מכשיר ההדמיה צריכה להיות מחוממת כדי למנוע קירור יתר של טמפרטורת הגוף של בעלי חיים מורדמים. בנוסף, כדאי לקבל תמונות ברזולוציה נמוכות של כמה בעלי חיים בסיבוב רכישה אחד ולאחר מכן לעבור, עד הפלטפורמה קרובה יותר לעדשת המצלמה כדי להתמקד בחלק אחד של בעלי חיים מסוימים או איבר מבודד בעקבות נתיחה. התוכנה צריכה לאפשר שינויים מהיריםאחד מהפרמטרים (זמן חשיפה, מדגם מרחק / עדשה, רגישות), כימות של אזורים מוגדרים של עניין ויצוא עתידי של תמונות תמונת מצב.
4. לרכישת אות אור מהראש בלבד, לכסות את הגוף של הילודים שוכבים רוחבי עם נייר עבה, כהה שמסתיר את הפוטונים הנפלטים ברמה של האיברים שבו שכפול נגיפי גבוה מתרחש (בכבד, ריאות, בלוטות רוק) ולבצע רכישה במשך 5 עד 10 דקות (איור 1 ג). לבצע רכישה של צד הניגוד של החיה באותם תנאים.
5. לחדש את הגורים לכלוב ולמקם את מנורת חימום על גבי כדי למנוע קירור יתר של הילודים הרדימו. באופן קבוע לפקח על התאוששות לאחר ההרדמה. עם מינון המצוין, הרדמה כיום נמשכת 30 דקות.
6. חזור על אותו ההליך בימים 9, 11 ו -14. בימי 11 ו -14, לשנות את המינון של חומרי הרדמה (6 מ"ג / מיליליטר קטמין, 1.2 מ"ג / מיליליטר xylazine).

תוצאות

ניסוי נציג מודגם באיור 1. על זריקת intraperitoneal של 50 PFUs של MCMV לוק (לוח מראה זריקה דומה הופיעה עם מתילן הכחול כדי להמחיש את המסלול תת עורית של המחט), ילודים היו מורדמים וקיבל בו זמנית 0.3 מ"ג של מצע לוציפראז (Luciferin, קליפר). רבע שעה לאחר מכן, בעלי החיים הונחו צד הגחון בחדר רכישת IVIS 50 (במערכת הדמית vivo, קליפר) והאור הנפלט ע"י כל בעלי החיים נתפס במהלך חשיפת שנייה 10. לוח ב 'מציג תמונת מצב תמונות שצולמו בימי 7, 9, 11 ו -14 עם התוכנה (חיים ...

דיון

שימוש בטכנולוגיית ההדמיה vivo כדי לפקח על הפצת MCMV לוק בילודים עכברים, היינו מסוגלים להתבונן התפשטות נגיף למוח של בעלי חיים שעברו מוטציה, בניגוד לטבע מהסוג. נתיחה נוספת של בעלי החיים וההדמיה vivo לשעבר של המוח אישר את נוכחותו של וירוס זורח במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, אנחנו גם ביצע אימונוהיסטוכימיה (לא מוצג) בסעיפים דקים מוח עם נוגדנים ספציפיים לחלבון מוקדם MCMV E1 וציינו כי אכן, MCMV נמצא באותם אזורים כמו אלה שבם הארה התגלתה, ובכך מצביעים על כך שההדמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>מגיב / חומר< / חזק>
DMEM	פישר סיינטיפיק	W3523A
מתילן כחול	סיגמא אולדריץ'	319112
מחטי אינסולין	VWR	613-4897
קטמין	CentraVet	Ket 201
קסילזין/וטרנל	סיגמא אולדריץ'	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
קליפר לוציפרין		760504
גנטמיצין	סיגמא אולדריץ'	G1272
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15070
קרבוקסימתיל צלולוז	סיגמא אולדריץ'	C4888
פורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	F8775
קריסטל סגול	סיגמא אולדריץ'	C3886
<חזק>ציוד
IVIS 50	קליפר/פרקין אלמר