מאמר שיטה

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

DOI:

10.3791/50429

⸱

28 ביוני 2013

 ,  , 
1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לחקור את אירועי נהיגה לב ופיתוח כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המובילים למחלות שריר הלב בבני אדם, זה חיוני ראשון ליצירת cardiomyocytes האנושי מתפקד (CMS). השימוש בתאים אלה בגילוי תרופות ומחקרי רעלים היינו גם להיות מועילים מאוד, המאפשרים מולקולות תרופתיות חדשות לטיפול בהפרעות בלב להיות מאומת טרום קליני בתאים ממקור אנושי. המקורות האפשריים של CMS, המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים הם בין המבטיח ביותר, כפי שהם יכולים להיגזר מרקמת מטופל נגישה ובעלי יכולת פנימית כדי להצמיח את כל סוגי התאים בגוף 1. מספר שיטות הוצעו להפרדת תאי iPS למערכת ניהול תוכן, הנעות בין גופי embryoid הקלסיים (EBS) גישה לפרוטוקולי צבירת הגדרה כימית 2,3. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול מבוסס EBS ולהראות איך זה methoיכול להיות מועסק ד כדי לייצר ביעילות תאים דמויי CM פונקציונליים מתאי iPS מזין ללא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה היסטורית, החקירה של המנגנונים הגנטיים ומולקולריים הנהיגה פיתוח ומחלות של בני אדם הייתה מבוססת על הדור של מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטי. עם זאת, פנוטיפים אדם רבים אינם מצליח להיות משוכפלים בהצלחה בעכברים, בעיקר בגלל ההבדלים הביולוגיים הקיימים בין שני המינים. מצד השני, גישה לרקמות אדם עשוי להיות מוגבל, ולעתים קרובות אינו מאפשר מספיק חומר כדי להתקבל ללימודים ניסיוניים לעומק. תחום הביולוגיה לב וכלי דם סובל משתי המגבלות האלה: הפיסיולוגיה של הלב האנושי היא שונה באופן משמעותי מזה של העכבר, וכמות משמעותית של רקמת לב היא נגישה רק נתיחה שלאחר מוות או במהלך ניתוח לב. מציאת מקור אופטימלי לבידול של תפקודי האנושי CMS לכן הפכה נושא מרכזי בביולוגיה לב וכלי דם, והרבה מאמץ נעשה כדי לטפל בבעיה זו. סוגי תאים שונים הוצעו, אניncluding myoblasts שלד, תאים מקומיים לב גזע, תאי mononuclear מח עצם, תאי אב אנדותל, ותאי גזע mesenchymal. עם זאת, נתונים שהושגו באמצעות תאים אלה לא היו עקבי 4.

הגזירה של תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) 5 והגילוי פורץ של (IPS) תאי גזע pluripotent מושרה על ידי יאמאנאקה ותומסון 6,7 נראו תחילה מאוחר יותר כדי לספק פתרונות: התאים הללו יש את היכולת לגדול ללא הגבלת זמן ואת הפוטנציאל לתת תעלה לכל נגזרי התא של שלוש השכבות הנבט, כולל מערכת ניהול התוכן. השימוש בתאי iPS מציע יתרונות נוספים: הנגזרים מתאי בוגרים אוטולוגי, הם נושאים את אותו הגנום כפרט או המטופל שממנו הם נובעים. לכן הם מאפשרים פיתוח של מודלים במבחנה המאפשרים החקירה של מחלות גנטיות באדם ובמנגנונים של התפתחות. בכוחו של מאפיין זה, תאי iPS יכולים גם oבעיות הקשורות לvercome דחייה חיסונית וסוגיות אתיות 8. מסיבות אלה, למרות שESCs עדיין מייצג את תקן הזהב בתחום הביולוגיה של תאי גזע, בכל העולם חוקרים כיום נעים יותר לכיוון טכנולוגיית תאי iPS.

תאי iPS כעת מועסקים למודל מחלה אנושית במבחנה לתנאים שונים, כולל הפרעות מולדות 9,10 לב וכלי דם. לאחרונה, יישום של מודלים מחלה תא iPS נעשה להפרעות בלב monogenic (תסמונות QT ארוכות, טכיקרדיה חדרית כלומר פולימורפית catecholaminergic) ומוזרויות שבו מומי לב הם חלק מהפנוטיפ מורכב (כלומר Leopard ותסמונות טימותי, קרדיומיופתיה מורחבת). דוחות אלה אישר כי תאי iPS מטופל ספציפי הנבדלים לCMS להציג מאפיינים פנוטיפי ופונקציונליים דומים כמו המחלה בגוף חי.

עם זאת, ישאתגרים עדיין רבים לשפר את היעילות של תאי iPS גרימת לשושלת לב. דור הספונטני של CMS מESCs אדם דרך היווצרות המצרפי נקרא גופי embryoid (EBS) הוכיחו 17 מוצלחים. מאז הגילוי הזה, שיטות רבות אחרות שהוצעו. קבוצות רבות הגבירו מאוד את היעילות של פרוטוקול הבידול ועברה לפעול בריאגנטים תרבות הגדרה כימית וללא בעלי החיים מוצר (ראה Mummery, ג, et al., מחקר מחזור (2012) לסקירה מקיפה של כל השיטות הקיימות 3 ).

עם זאת, השיטה הקלסית המבוססת על צבירת EB עדיין מייצגת מועסק הנפוצה ביותר לביצוע מחקרים תפקודיים וחוקר מנגנוני מחלה. הפרוטוקול המוצע שלנו מבוסס על הצבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחות חומצה אסקורבית וסרום, אשר הוכח כדי לשפר את תהליך בידול הלב ולפוsitively להשפיע על ההבשלה של תאים אלה 18,19. במאמר זה אנו נעבור על מתודולוגיה זו בפירוט ונראים כיצד להשתמש בשורות תאי iPS מזין ללא ליצירת מטופל ספציפי CMS IPS-נגזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקה ללא מזין וPassaging של שורות תאי iPS אדם

  1. הכן את מנות Matrigel מצופים. הפשירו בקבוקון אחד של מטריקס ESC-מוסמך האנושי על קרח למשך שעה אחת ולדלל אותו ב25 מדיום DMEM-F12 מ"ל. הוסף 1 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ (או כמויות מקבילות לשטח פנים אם נעשו שימוש במנות אחרות), שמירה על כל מה שעל קרח ולהבטיח כי כל הצלחות והצינורות הם מראש מקוררים. אטמים ברדיד אלומיניום.

הערה: ריכוזי מניות Matrigel משתנות בהתאם למנה. הוראות דילול מצוינות בגיליון נתונים.

  1. שמור על צלחות על קרח בלילה ולהסיר מקרח ביום שלמחרת. יכולות להישמר במקרר צלחות עד שבוע לפני השימוש.
  2. הכן בינוני המלא mTESR1 (או להפשיר בקבוקון של מדיום Nutristem) וH-ESM (בינונית ESC אנושי) בהתאם לטבלה שלהלן.
    H-ESM קונצרט כלשהו סופי עבור 500 מ"ל
    החלפת סרום נוקאאוט (KSR) 20% 100 מ"ל
    Glutamax 100X 2 מ"מ 5 מ"ל
    חומצות אמינו לא חיוני ממ 0.1 מ"מ 5 מ"ל
    פניצילין, סטרפטומיצין 100 U / מ"ל ​​- 0.1 מ"ג / מ"ל 5 מ"ל
    2-mercaptoethanol 0.1 מ"מ 900 μl
    תוסף B27 - בלי Vitamina 1% 10 מ"ל
    מוסף N2 1% 5 מ"ל
    נוק DMEM - 370 מ"ל

    ניתן לאחסן בינוני מניית ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. כדי להכין מדיום גידול מלא, FGF הבסיסי הוסיף רק beforהאכלת דואר בריכוז סופי של 20 ng / ml.

הערה: שלם H-ESM מותנה בfibroblasts העכבר העוברי יכול לשמש במקום mTESR1 או Nutristem לתאי iPS.

  1. הנח צלחות מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעת 2 ​​לפני passaging.
  2. תאים צריכים להיות passaged בערך כל 5 ימים, גם אם הם לא הגיעו לנקודת מפגש. מושבות לא צריכים להיות נוגעות ללב.
  3. החלפת מדיום גידול עם 1 מ"ל של dispase (1 מ"ג / מ"ל, לפזר ממניות מ"ג / מ"ל ​​10 PBS).
  4. הסר הבחנה אזורים עם pipettes משך פסטרו זכוכית. אזורים כי יש להסיר כוללים מבנים דמויי מכתש או פיברוזיס במרכז מושבות, וכל התחום שבו תאים הפכו הופרדו ממושבות ושטוחות ונראה שנודדים החוצה.
  5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסת מנוע התרבות עד גבולות מושבה הפכו בהירים יותר ולהתחיל לנתק (בדרך כלל סביב דקות 5-7). Discarד dispase. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM וזורקים.
  6. ב1 מ"ל H-ESM, השתמש מרים תא (דמוי מרית מגרד) למושבות קציר ולאסוף בצינור 15 מיליליטר אפנדורף. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM ולהוסיף לצינור. ספין ב 1000 RCF למשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
  7. Resuspend גלולה ב1 מדיום גידול מחומם מראש מ"ל (או mTESR1 או Nutristem). הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה פחות מ 6-8x. לקבוע כמה תאים צריכים להיות מצופה ולהסיר תאים מיותרים (בדרך כלל 01:04 או 01:05 דילול), למשל עבור 2 צלחות ב1:5, להסיר 600 μl, ולאחר מכן להוסיף 1.6 מיליליטר מדיום טרי.
  8. הסר Matrigel מצלחות. תאי מקום טיפה אחרים טיפה, הפצה באופן שווה על הצלחת. הימנע מטלטול הצינור באופן מוגזם, כמו זה יגרום לתאים לעבור לכיוון המרכז.
  9. לשטוף עם צינור בינוני 1 מ"ל ופער בין צלחות. נפח סופי בכל צלחת צריך להיות 1.5 -2 מ"ל.
  10. שנה בינונית כל יום, פרט ליום שאחרי passaging. למרות זאת הואאידיאלי לשינוי היומיומי בינונית, זה עשוי להשתנות מדי פעם בתדירות של אחת לימים, אם לא יותר מ 2-3 ימים עברו מאז המעבר האחרון מבלי להשפיע על פוטנציאל pluripotency או בידול.
  11. אם יש להקפיא שורת התאים, מחדש להשעות במקום ב1-2 מדיום הקפאת mFreSR מ"ל באמצעות פיפטה 2 מ"ל ומקום 1 מ"ל / cryovial. בקבוקוני מקום בcryobox ב -80 מעלות צלזיוס והעברה לחנקן נוזלי בתוך 3-4 ימים.

הערה: microdissection הידני של תאי iPS חייב להתבצע תחת stereomicroscope. (IVF) תחנת עבודה בהפריה חוץ גופית (IVF מתחנת עבודת KSystem למשל) משולבת עם stereomicroscope מאפשרת מניפולציה של התאים בתנאים סטריליים בזמן שהם שמרו על שטח פנים מחוממים. אם זה לא זמין, ניתן להעביר stereomicroscope מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית קבועה.

2. גופי Embryoid צבירה והלב Induction

  1. להכין מדיום EBM-20 על פי הטבלה שלהלן.
    EBM-20 קונצרט כלשהו סופי עבור 500 מ"ל
    סרום שור העובר (מוצא דרום אמריקה) 20% 100 מ"ל
    חומצות אמינו לא חיוני ממ 0.1 מ"מ 5 מ"ל
    פניצילין - סטרפטומיצין 100U/ml - 0.1 מ"ג / מ"ל 5 מ"ל
    Glutamax 100X 0.1 מ"מ 5 מ"ל
    2-mercaptoethanol 50uM 450 μl
    DMEM/F12 - 385 מ"ל

    השימוש בFBS ממוצא דרום אמריקה הוא קריטית לקביעת יעילות הבידול: תעסוקה של סוגים אחרים של סרה עלולה להשפיעתהליך ההתמיינות. כדי להכין EBM-20, חומצה אסקורבית תוספת מלאה (AA) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. ניתן לאחסן את מדיום גידול שלם על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בשבוע.
  2. מושבות iPS קציר כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.6-1.9).
  3. Resuspend עדינות ב1 מיליליטר EBM-20 עם טפטפת מיליליטר 2. הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה לא יותר מ 2-3x, בודק את הגודל של המושבות תחת stereomicroscope. צלחת על צלחות התקשרות נמוכות במיוחד ביחס 1:1 (למשל לצלחת 35 מ"מ, השתמש 1 גם צלחת 6 היטב). יש לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר EBM-20 ולהוסיף לצלחת.

הערה: הגודל של המושבות להשפיע על תהליך ההתמיינות, שליטה יעילות ועיתוי של אינדוקציה לב. צבירה של EBS הומוגנית בגודל הוכח כדי להפחית את השונות שנצפו במהלך בידול.

  1. ביום 3, לשנות EBM-20 פעם אחת באמצעות מיקרוסקופ כדי למנוע מחדשmoval של EBS. שמור פיפטה הקרובה לקצה של צלחת, ולהסיר את המדיום.
  2. ב -7 ביום, מתג EBS לצלחות מצופות 0.1% ג'לטין והניח בעבר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במידת צורך, ניתן להסיר ג'לטין וצלחות יצאו מתחת למכסת מנוע תרבית תאי O / נ הוסף 35-40 EBS לכל צלחת 35 מ"מ.
  3. בדקו EBS על הכאה ושינוי אזורי EBM-20 פעמיים בשבוע. לסמן את האזורים שבו מכים נמצאים בחלק העליון של כיסוי המנה, כדי להקל עליהם לוקליזציה תחת stereomicroscope. אזורים המתקשרים אמורים להופיע לאחר כ 10-20 ימים.
  4. כאשר אזורים עם התכווצות ספונטנית מופיעים, לעבור למדיום EBM-2 (להכין כEBM-20, עם 2% FBS במקום) ולבודד אותם כמתואר להלן בסעיף 3.
  5. תמשיך לבדוק תחומים אחרים למכות ולשנות בינוני פעמיים בשבוע עד שאזורי מכים נדרשים לניסויים נוספים.

הערה: יעילות של תהליך הבידול תלויה מאוד במספר גורמים, קריטיים ביותר שלו הם הקווים הספציפיים הסלולריים ויצווה של סרום המשמשים כדי לגרום לבידול לב. כדי להשיג היעילות הגבוהה ביותר, שורות תאי בדיקה עבור פוטנציאל cardiomyogenic וקבוצות שונות של סרום.

3. מכות בידוד והתרבות תחומי

  1. צלחות מעיל 12 גם (4 ס"מ אזור 2) או את הצלחות של עניין עם פיברונקטין 5 מיקרוגרם / 2 ס"מ, בדילול מלא PBS לעשות מספיק נפח כדי לכסות את כל פני השטח לחלוטין (300 סך הכל μl לכל גם ב12 גם צלחות). שמור נחשף במכסת מנוע בתרבית תאים ולאפשר לו להתייבש. יכולות להיות עטופות צלחות ומאוחסנות על 4 מעלות CO / נ
  2. הסר להכות אזור באמצעות זכוכית משך פיפטה פסטר ואזמל, במידת צורך. מעבירים לצלחות פיברונקטין מצופים עם טפטפת 1 מ"ל.
  3. הוסף 1 מ"ל EBM-2.
  4. לחצות את הצלחת כדי לציין את האזורים שבם הוסרו תאים ולשנות את המדיום. יכולות להיות כל הזמן צלחות לתקופה של עד חודש 1, כפי שאזורים אחרים עשויים להתחיל באכילה בשלב מאוחר יותר.

הערה: אם גושי מכות קטנים יותר יש צורך, פיפטה אזור explanted מעלה ומטה מספר פעמים תחת stereomicroscope, עד שהוא נשבר לחתיכות קטנות יותר. זה יגרום אשכולות של כמה תאי מכות (ראה סרט 3).

  1. שנה בינונית פעמיים בשבוע עד מוכן לניתוחים.

הערה: cardiomyocytes מתקבל מפרוטוקול זה יש מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דמוי עוברי; התבגרות כלפי פנוטיפ כמו מבוגר ניתן לקבל על ידי הגדלת הזמן בתרבות להבדיל עוד יותר תאים אלה.

4. בידוד תאי מכות בודד וניתוח

  1. שקופיות של 2 ס"מ (הקאמריות מעיל אזור 4 2) או תומך מתאים אחרים עם פיברונקטין 2 מיקרוגרם / 5 ס"מ מדולל PBS מספיק כדי לכסות את פני השטח כולו התרבות. אם נעשה שימוש בתמיכת זכוכית, מעיל עם laminin ופיברונקטין (5 מיקרוגרם / ס"מ 2 כל אחד).
  2. הסר להכות אזור עם טפטפת / אזמל פסטר מהצלחות מהסעיף 3.
  3. באמצעות 1 מ"ל פיפטה, תאים מעבירים צינור 15 מ"ל המכיל 500 collagenase השני μl (480 U / מ"ל ​​PBS עם Mg ו Ca) ודגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מנער את צינור פעם אחת במהלך הדגירה.
  4. פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת μl 200. אם כל גושים יישארו, להעביר לטרי collagenase השני וחזור על שלב 4.3.
  5. חזור על שלב 4.4 עד אין גושים גדולים נשארים.
  6. להשבית collagenase עם 3 מ"ל EBM-2 (לא AA). לאחר מכן ניתן להשאיר את הצינור מתחת למכסת המנוע במעמד מחומם עד צינורות אחרים מוכנים. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
  7. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA (בדילול ממנייה 0.5% ב1X PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שלב את השברים של digestions מאותה הדגימה ראשונית.
  8. להשבית טריפסין עם 4 מ"ל EBM-2 (לא AA). תאים עוברים דרך מחט 18G במזרק 2.5 מ"ל אין לא יותרהאן 7x. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
  9. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל EBM-2 לכל טוב וצלחת. תאים יכולים לשמש לניתוח פונקציונלי ומורפולוגי 2-3 ימים לאחר ציפוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקרים שלנו אנחנו נוצרו CMS מכמה שורות תאי iPS. קווים אלו נוצרו בתחילה על שכבת מזין MEF אבל הונחו מייד על Matrigel באמצעות מדיום מוגדר (או mTESR1 או Nutristem). מבחני שונים שמשמשים לאימות תחזוקה של נכסים מורפולוגיים, הביטוי של סמנים אופייניים לתאי pluripotent (OCT-4, וSSEA4 TRA1-60) ויציבות הגנום שלהם (איור 1).

גיוס לשושלת הלב היה מופעל על ידי צבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחותו של סוג מסוים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש תאי גזע pluripotent פוטנציאל להבחין באופן ספונטני לCMS, אם כי ביעילות נמוכה ושונות גבוהה בין שורות. פיתוח שיטות אינדוקציה רומן ולכן התמקד בשיפור היעילות של התהליך ונע לעבר פרוטוקולים יותר מוגדרים. עם זאת, רוב שיטות הבידול החדשות אלה הם מורכבים למדי, הדורשים תנאים מורכבים תרבות, בקרת קנס של עיתוי וריכוז של חומרים כימיים, וטיפול עם ציטוקינים יקרים וגורמי גדילה. כמו כן, הבדלים ברמות האיתות ציטוקינים אנדוגניים של שורות תאי iPS השונות להבהיר את זה קשה לתקנן ריכוזים ציטוקינים, אשר לע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין אינטרסים כספיים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BS נתמכה על ידי אוניברסיטה של ​​תכנית מחקר לסטודנט קיץ מילאנו-Bicocca הדרכה; מחקר נתמך מכספים של משרד בריאות האיטלקי ומשרד איטלקי לחינוך, אוניברסיטה ומחקר וFondazione Humanitas לGC, אנחנו מודה למיכאל VG Latronico לקריאה ביקורתית כתב יד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Media and Reagents
BD Biosciencesמוסמך ESC354277להפשיר את בקבוק ה-5 מ"ל ב-4 מעלות; C על קרח O/N, יש לאחסן בצינורות קריו מקוררים מראש על קרח, על פי הוראות הדילול של גיליון הנתונים ולאחסן ב-20 מעלות; ג .
פיברונקטין, מפלזמה אנושית, תמיסה 0.1%סיגמאF0896-2MGריכוז עבודה: 5 μ גרם/ס"מ2
LamininSigmaL2020-1MGריכוז עבודה: 5 μ g/cm2
PBS (ללא Mg ו-Ca), 10XLonzaBE17-515F
PBS (עם Mg ו-Ca), 10XBio SeraXC-S2067/500
Dispase II, פרוטאז ניטרלי, דרגה IIRoche4942078001מלאי: 10 מ"ג/מ"ל ב-DMEM-F12 ב-20 מעלות; C, פתרון עבודה: 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS (ללא מ"ג/Ca)
טריפסין/EDTA, 0.5%סיגמאT3924
קולגנאז סוג 2וורת'ינגטון4176מדולל ל-480 U/ml (למשל 1.6 מ"ג/מ"ל) ב-PBS עם Mg ו-Ca
DMEM-F12Life Technologies21331-020
Knockout DMEMLife Technologies10829-018
סרום נוקאאוט החלפה (KSR)Life Technologies10828-028הפשרה ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסן ב-20 מעלות; C
F– סרום בקר tal (מקור דרום אמריקה)Invitrogen10270-106יש לבדוק את הפוטנציאל הקרדיוגני שלהם. הפשרה ב-4 מעלות; C, אי-הפעלה בחום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות, aliquot ומאחסנים ב -20 מעלות; C
PenStrep, פניצילין-סטרפטומיצין, 100XLife Technologies15140-122
GlutaMAX, 100XLife Technologies35050-038
MEM NEAA, תוסף תזונה 100XInvitrogen11140-135
N2, תוסף תזונה 100XLife Technologies17502-048
B27, 50XLife Technologies12587-010
2-mercapt– טנולInvitrogen31350-010
ג'לטין, מעור חזירSigmaG1890-100Gהכינו מלאי ב-1% במים, אחסנו ב-20 מעלות צלזיוס. מדללים ל-0.1% ב-PBS ושומרים ב-4 מעלות; C
mTeSR1Stem Cell Technologies5850שלבו את תוסף 5X עם המדיום הבסיסי, שימו לב ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. אין לשמור על מדיום שלם בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך יותר משבוע
Nutristem hESC XFStemgent מתעשיות ביולוגיות05-100-1Aהפשרה ב-4 מעלות; C O/N, לאחסן ב-20 & deg; C עד השימוש. ניתן לשמור את האליקוטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C לא יותר משבוע.
mFreSRStem Cell Technologies5853
חומצה אסקורביתSigmaA4544-25Gהכינו מלאי ב-10 מ"ג/מ"ל במים. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C בחושך. הוסף ל-EBM בריכוז הסופי (500X)
<חזק>כלי פלסטיק
>35 מ"מ כלי תרביתBecton Dickinson353001
מגרד תאיםCorning Incorporated3008
צלחות 12 בארותBecton Dickinson353043
Permanox 2-well chamber slidesThermo Fisher Scientific177437
מגלשות תא זכוכית 2 בארותThermo Fisher Scientific177380
צלחות 6 בארות, משטח חיבור נמוך במיוחדCorning Incorporated3471
18G מחטBecton Dickinson304622
פיפטות פסטור זכוכית, 230 מ"מVWR International612-1702
מזרק 2.5 מ"לBecton Dickinson300188
Equipments
IVF WorkstationKSystem, על ידי Nikon
Nikon SMZ1500 סטריאומיקרוסקופNikon
Human Matrix

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  3. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  4. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  7. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  8. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
  9. Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
  10. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  11. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
  12. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
  13. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
  14. Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
  16. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147(2012).
  17. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
  18. Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
  19. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
  20. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
  21. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Embryoid Bodies AggregationFeeder free ConditionsCardiomyocyte DifferentiationImmunofluorescence MicroscopyEnzymatic DigestionFibronectin CoatingCardiac TroponinStromal Vascular Fraction

מאמרים קשורים