מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור In vivo קיפול חלבונים ב Cerevisiae Saccharomyces. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostasis בבקרת איכות חלבון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות 1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון 10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ 'isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים 12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase 13 Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת 5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.
מבוא
אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה 10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני 6 misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה 19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ב18 viv....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בנייה של זנים המכילים FFL-GFP פלסמיד
במחקר זה, זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) שימש יחד עם מתח מחיקת HSP104 מאוסף נוקאאוט שמרים (הפתוח Biosystems / Thermo Scientific). המחיקה אושרה באמצעות נוגדן ספציפי לHsp104 ניתוח כתם מערבי.
FFL-GFP בא לידי ביטוי מp426MET25-FFL-GFP, שנבנה ממקור פלסמיד מבוסס LEU2 התקבל מהמעבדה גלובר באוניברסיטת טורונטו 17 והשגה, על פי בקשה למחברים. הביטוי של חלבון היתוך פלסמיד FFL-GFP נשלט על יד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השמרים תלויים בdisaggregase, Hsp104 לקפל חלבוני חום מפוגלים ביעילות. הפעילות של FFL-GFP הייתה פיקוח אחרי 25 דקות הלם חום, באמצעות assay הבזק הארה איור 1. את התוצאות של assay האוטומטי זו שמוצגת באיור 2 נחשפו עלייה הדרגתית בפעילות מעל 90 דקות שסופו של דבר הובילו להתאוששות> 80% בתאי WT. זן hsp104Δ התאושש 19% מהפעילות המקורית על אותה מסגרת הזמן. יתר על כן, במידה של איון הראשוני הייתה גבוהה הרבה יותר בזן מוטנטי המלווה (26% פעילות בWT ו -11%.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתאוששות המקסימלי בזן מוטנטי hsp104D לא יעיל, אבל בסדר הגודל הראשוני של לחץ התגלגלות היה גדול יותר בזן המוטציה (איור 2). הניתוח גם מראה כי בעוד שתאי hsp104D נראה ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (074,696 NIGMS-) לKAM וחברה אמריקנית למיקרוביולוגיה מלגת רוברט ד 'ווטקינס סטודנט לתואר מחקר לJLA אנו מודים גם ג'ון גלובר באוניברסיטת טורונטו למתן FFL מקור-GFP פלסמיד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC קונפוקלי מיקרוסקופ הפוך | אולימפוס, טוקיו יפן | ||
| Lumitrac 200 צלחות לבנות 96 בארות | ארה"ב Scientific | ||
| SlideBook 5.0 תוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית | Intelligent Imaging Innovations, Inc. דנבר, קולורדו, ארה"ב | ||
| <חזק>ציוד | |||
| >טריס בסיס | פישר | BP152-1 | |
| (LiAc) ליתיום אצטט | סיגמא | L6883 | |
| PEG (פוליאתלן גליקול) | פישר | BP233-1 | |
| EDTA | פישר | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| נמס נמוך אגרוז | NuSieve | 50082 | |
| שמן טבילה | Cargille | 16484 |
מקורות
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
