ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה
במאמר זה
סיכום
תקציר
לתפקד תאי שיער שיווי המשקל הבנה בתנאים רגילים, או איך טראומה, מחלה, הזדקנות ולשבש את הפונקציה הזו היא צעד חיוני בהתפתחות של גישות ו / או אסטרטגיות טיפוליות חדשניות מונעת. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים שמסתכלים על תפקוד שיווי משקל נורמלי לא היה ברמה התאית, אבל התמקד בעיקר במבחני התנהגות של תפקוד שיווי משקל כגון הליכה וניתוח ביצועי רפלקס vestibulo-עיניים. אמנם עבודה זו הניבה נתונים יקרי ערך לגבי מה שקורה כאשר דברים משתבשים, מעט מידע שלקט בנוגע לגורמים הבסיסיים של בעיות בתפקוד. מהמחקרים שיתמקדו בתהליכים התאיים וsubcellular העומדים בבסיס תפקוד שיווי משקל, רוב הסתמכו על החריפות בודדו תאי שיער, נטולי הקשרים סינפטיים ואת סביבת תאי תמיכה. לכן, אתגר טכני גדול כבר גישה לתאי שיער שיווי המשקל הרגישים להפליא בהכנהaration ששבש לפחות, מבחינה פיזיולוגית. כאן אנו מדגימים הכנה למחצה שלמה של האפיתל חושי שיווי משקל העכבר ששומר על מיקרו הסביבה המקומית הכולל תא שיער / מתחמים מביא עיקריים.
מבוא
למרות התרומה המשמעותית של מערכת שיווי המשקל לחיי היומיום שלנו, יש הבנה ברורה של התהליכים האחראים לירידה שנצפתה בתפקוד שיווי משקל עם גיל נשארת חמקמקה. אחת סיבות לחוסר הידע הזה הוא שהירידה בתפקוד שיווי משקל יש באופן בלעדי כמעט נחקרה באמצעות מבחני התנהגות, כוללים רפלקס vestibulo-העיני (VOR), חיווי מדויק של תפקוד שיווי משקל חיצוני, אך מספקת תובנות מוגבלות לשינויים של מרכיבים מהותיים . זהו מכשול עיקרי להבנה שלנו של תפקוד תא שיער שיווי משקל בבריאות, מחלה, או הזדקנות.
אמנם יש כבר מחקרים רבים של תאי שיער שיווי המשקל בודדים, חסרון גדול היה ההסתמכות על הכנות תא שיער חריפות, שבו תאי שיער ומסופים מביא אפילו גביע יוסרו מהסביבה הרגילה שלהם באמצעות טיפול מכאני ו / או האנזימטית. inevita גישות כגוןבליי לשבש את ארכיטקטורה העדינה בין תאי שיער וגביע, ושיער של תא ותא תמיכה. עם התפתחותה של הכנות למחצה ללא פגע 1-5, והכנת מבוך עכבר מבודדת 6, עכשיו יש הזדמנות ללמוד את הצורות השונות של תקשורת הסינפטית בתנאים שנראה דומה יותר לin vivo. ואכן, Lim et al. (2011) הראה הבדלים בולטים בכל זרמים סלולריים נרשמו מסוג החריפות מבודד אני תאי שיער שיווי המשקל בהשוואה לאלה שנשארו מוטבעים בתוך neuroepithelium. באופן ספציפי, הוא חשב אשלגן להצטבר בחלל בין התאית, בין תא השיער וגביע עצבים ולשנות באופן משמעותי תגובת תא שיער 7. מידע מסוג זה יהיה בלתי אפשרי להשגה ללא הכנה למחצה השלמה של האפיתל החושי שיווי המשקל שתואר כאן. אנו מדגימים את ההכנה למחצה השלמה של עכבר Crista 3, ולהראות תוצאות נציג המתקבלות מכל תא התיקון electrophysiology, וסידן הדמיה שני פוטונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בעלי חיים
- עכברים התקבלו ממרכז מכרסמים האוסטרלי (ARC; פרת', אוסטרליה) ונערכו באוניברסיטת בית החיות בוש סידני על מחזור אור / חושך של 12 שעות נורמלי עם העשרה סביבתית. כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת סידני בעלי החיים.
- עכברי זכרים ונקבה (C57/Bl6) שמשו לכל הניסויים שכן זן זה משמש בדרך כלל כרקע למניפולציה גנטית, ויכולים להיחשב שווה הערך ל wildtype 8-9.
2. הכנת רקמה
- להכין 300 מ"ל של נוזל מבוסס גליצרול מלאכותי השדרתי (ACSF) בהיקף של (מ"מ): 26 3 אא NaHCO, 11 גלוקוז, 250 גליצרול, 2.5 KCl, 1.2 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, ו -2.5 CaCl 2. לפני התוספת של CaCl 2, גז הפתרון עם carbogen (95% O 2 ו 5% CO 2) להקים apמשקעים סידן H של 7.4 ולהימנע (עננות). להקפיא את הפתרון במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כך שנוצר תרחיף קרח.
- עמוק לטשטש את העכברים עם קטמין (100 מ"ג / ק"ג) (פרנל, אלכסנדריה, אוסטרליה) באמצעות זריקה תוך הצפק.
- ברגע שהרפלקסים קמצוץ אחורי-גפיים הם עכברים לערוף נעדרים באמצעות מספריים נירוסטה חדים ולעשות חתך בעור sagittal באמצעות סכין גילוח (מעוגל # 22) כדי לחשוף את הגולגולת. בשלב זה ובשלבים 2.3-2.8 קמרון הגולגולת, המוח ומנגנון שיווי משקל בסיסי צריכים להישמר כקריר ככל האפשר על ידי יישום רגיל של ACSF קר כקרח על הרקמה.
- באמצעות הזרוע המחודדת של מספריים דפוס רגילים (FST, צפון ונקובר, קנדה) לעשות חתך קטן בגולגולת במבדה ולחתוך לאורך תפר sagittal. להבטיח כי המוח אינו "נגרר" על ידי להב הגזירה במהלך שלב זה.
- בזהירות לקלף את העצמות הקודקודית מרחק רוחבי והעצם posterio העורפיrly באמצעות רדוד עיקול פירסון rongeurs (FST).
- מרית נירוסטה קטנה לאחר מכן נעשה שימוש כדי להרים את המוח בעדינות מפני השטח של גולגולת fossae האמצעית והאחורי, ואת העצב החשוף vestibulocochlea (CNVIII) באמצע הדרך בין האוזן הפנימית וגזע המוח עם זוג המספריים איריס בסדר לחתוך. חיתוך עצב זה ממזער מתח מיותר על האקסונים של afferents הראשונית וקשריהם עם תאי שיער.
- בעקבות חיתוך רוחב של CN VIII מוח מוסר בטוטו.
- מבוך שיווי המשקל הוא כעת בבירור בפוסה גולגולתי באמצע, עם השבלול מצביע anteromedially. Rongeur שני צדי מבוך שיווי המשקל לפני שמוציא בעדינות על ידי אחיזה בתעלת חצי עגולה הקדמית ומושך רוחבי.
- לטבול את המבוכים הניכרים (איור 1) בצלחת ניתוחים המכילות ACSF המתואר בסעיף 2.1 קר כקרח, הומתו בגז ברציפות. תחת stereomicroscope, להחזיק את המבוך כדיהבסיס של המנה על ידי אחיזה בשבלול האוזן. שימוש במלקחיים בסדר לגרד ממנו על העצם שמעל תעלת חצי עגול ampulla הקדמי. ברגע שחור קטן בעצמות מושגת מתחיל קפיצי העצם מampulla. יש לנקוט זהירות לא לדחוף את המלקחיים באמצעות העצם כמו זה יכול לגרום נזק למבוך הקרומי הבסיסי והאפיתל החושי. המשך הליך זה עד ששתי קדמי וצינוריות קרומיות בצורה חצי עיגול אופקית סמוכות וampullae נחשפים (איור 2).
איור 1. מבוך עכבר שיווי המשקל המבודד. א לוח שמאלי) ייצוג סכמטי של מבוך שיווי משקל העכבר הבודד. נקודות חשובות של התייחסות לגישה האפיתל החושית שיווי המשקל, בתעלות בצורה חצי עיגול השבלול, קדמית, ואופקיים הן מעבדהeLED. כוכביות מצביעות ampulla תעלת חצי עגול המכיל את האפיתל החושי שיווי המשקל. ב ' פנל) Photomicrograph זכותו של מבוך שיווי המשקל המבודד מעכבר בן חודש 1.
איור 2. החשיפה של שיווי משקל המבוך הקרומי. העצם שמעל תעלת ampullae חצי עגול הקדמי והאופקי כבר גרד משם כדי לחשוף את ampullae הקרומי השחור / חום מנומר ועצבי ampullary נלווים (CNVIII). סכמטי בפנל התחתון מייצג את המבנים באזור המסומן של photomicrograph ומציג את מערכת היחסים של צינורות תעלת החצי העגולים לampullae וCNVIII.
- בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להרים ampullae וutricle המשויך מן המבוך הגרמי, על מנת להבטיח שהאזור המרכזי של ampullae (containing האפיתל החושית) לא ניזוק. בחלק מהמקרים את החלק הפרוקסימלי של הצינור הקרומי חצי עגול ייתכן שיהיה הצורך לגזור במספריים איריס לשחרר ampullae מהעצם.
- העבר את השלישייה המכילה ampullae שתיים וutricle לתוך צלחת פטרי מלאה במדיום התרבות של ליבוביץ L-15 (סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי). השתמש בסיבים אופטיים ל" תאורה אחורית "את הרקמה. זה מאפשר הדמיה ברורה של Crista המכילה האפיתל החושית בתוך ampullae.
- להפוך בזהירות חתך ב" גג "המנומר של utricle עם המספריים איריס המשובחים. המשך דרך חתך זה הגג הקדמי ולאחר מכן ampullae האופקי. הפוך את החתך קרוב לקצה של האפיתל החושית ככל האפשר מבלי ליצור קשר עם אותו (איור 3 א). ודא שאין חתיכות של קרום שמעל האפיתל החושית (איור 3)
- העבר את ההכנה השלמה למחצה המבודדת בגלאס קטןחדר הקלטה של בעל תחתית מלא בתקשורת L-15. להכביד הכנה באמצעות רשת של סיבי ניילון עדינים המובטחים לחוט פלטינה בצורת U שטוחה (איור 3). באופן אידיאלי, את הסיבים של הרשת לא צריכים לשכב על האפיתל החושית, עם זאת בחלק מהמקרים שבם נדרש יותר יציבות, סיב בודד transecting האפיתל החושית אולי עדיפה.
איור 3. ההכנה למחצה ללא פגע המבודדת של ייצוג שיווי המשקל החושי האפיתל. א סכמטי של ההכנה למחצה ללא פגע ותצורת אלקטרודה. Ampulla שמעל Crista כבר "דה גג" לחשוף את פני השטח של האפיתל החושית (ירוק). ב Photomicrograph של ההכנה למחצה ללא פגע 'השלישייה' מראה Crista (HC) הקדמי (AC) והאופקי (utricle טשטש להיותאחורי AC). שימו לב לסיבי הניילון משמשים לאבטחת ההכנה לבסיס של חדר ההקלטה. בר סולם:. 100 מיקרומטר ג האלקטרודה הקלטה ממוקמת בתא שיער שיווי משקל פרט. בר סולם: 15 מיקרומטר.
3. Electrophysiology
- Perfuse ההכנה למחצה השלמה עם חומץ ברציפות L-15 בינוניות. התקשורת מכילה אינדיקטור pH (פנול אדום) וצבע של המדיום צריך להיות במעקב לאורך כל ההקלטות. ה-pH עם חמצן צריך להיות 7.3-7.4 ומתאימה לצבע אדום.
- הכן pipettes הקלטה מ -1.5 מ"מ (1.19 מזהה מ"מ) זכוכית ורוסיליקט באמצעות פרוטוקול שני שלבים (שלב 1 חום: 72; וחום צעד 2: 50) על חולץ micropipette (Narishige, יפן, דגם PP-830) כדי להשיג עכבה סופית של 3-4 MΩ.
- מלא שוק של פיפטה עם 3-4 מ"מ של פתרון הפנימי מבוסס אשלגן המכיל פלואוריד (מ"מ) 110 KF, 12 KCl, KOH 27, NaCl 1, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8 MgCl 2,3 D-גלוקוז, ו2 Na-ATP; pH 7.4 עם KOH.
- עטוף את השוק של 2-3 פעמים טפטפו והכי למטה ועד לקצה ככל האפשר עם רצועה דקה של parafilm כדי לבודד את האלקטרודה ולהקטין קיבול פיפטה.
- מקם את פיפטה מעל האפיתל החושית בהגדלה צריכת חשמל נמוכה (5X) במיקרוסקופ זקוף (אולימפוס BX51). לעבור למתח גבוה (40X) ולדמיין תאי שיער שיווי המשקל בודדים עם מצלמת CCD מצורפת.
- פיפטה עמדה על הממברנה של תא שיער דמיינו (איור 3 ג) באמצעות micromanipulator (סאטר מכשירים, קליפורניה, ארה"ב). ברגע שחותם gigaohm מושגת, קרע קרום התא עם כמות קטנה של לחץ שלילי מיושם דרך יציאת יניקה על בעל פיפטה.
- לבצע הקלטות מהדק מתח כל התא בשימוש בטכניקות סטנדרטיות 8-9.
4. שני פוטונים במיקרוסקופ
- הכן תמיסת מלח 0.9% מכילות 5 מ"מ אורגון גרין488 BAPTA-1 (OGB-1; מלח hexapotassium; Invitrogen, גרמניה).
- אמנם עדיין מתחת למים, מניח את ההכנה "דה הגג" חצי השלמה השלישייה על גבי פיסה קטנה של נייר סינון (4X4 מ"מ, 0.8 מיקרומטר עבה; Millipore, גרמניה) להבטיח כי האפיתל החושית היא בלא הפרעה מלמעלה.
- העבר את נייר הסינון והעריכה על גבי האלקטרודה מלוחה כיסתה בסיס הפלטינה (7 μl) של electroporator בהיקף של שילוב של גנרטור ודופק מגבר בפס רחב, ולכסות עם 5 μl נוסף של פתרון 5 מ"מ של הסיד הסינטטי מחוון הצבע אורגון גרין 488 BAPTA-1 (איור 4).
איור 4. electroporation גורפת. א סכמטי המציג חתך של תצורת electroporation. ההכנה למחצה ללא פגע (*) מונחת על פיסת נייר סינון שקועה בdy הסידדואר (אורגון גרין 488 BAPTA-1) ולהחיל נוכחי בין 2 אלקטרודות פלטינה. מעובד מתוך Briggman ואוילר, 2011 10.
- תביא במקביל האלקטרודה הפלטינה העליונה עם אלקטרודה הבסיס במרחק של כ 2 מ"מ, נזהר שלא לשבש את הכיוון של ההכנה, כאשר קשר עם פתרון BAPTA-1 אורגון גרין 488 הוא עשה.
- לעבור דופק נוכחי קצר על פני ההכנה (פרמטרים לנוכחיים; 13 V, 10 רוחב פולס אלפיות שני, תדירות הרץ 1, 10 פעימות כיכר גל) 10-11.
- בחלק התחתון של תא הקלטת תחתית זכוכית מלא עם מדיום L-15, מקום טיפה קטנה של שמן סיליקון ועמדת ההכנה למחצה השלמה של עליה, שוב על מנת להבטיח כי האפיתל החושית היא בלא הפרעה מלמעלה. כדי להבטיח יציבות לאורך הדמיה, להחליף את רשת הניילון על ההכנה כפי שתואר לעיל (נקודת 2.13 ראה מסגרת).
- באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לבצע הקלטות אופטיות של ספונטניפעילות בסידן שונה מס, אגרות האפיתל החושית (איור 7) תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים להדמית 10-11.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
את המאפיינים אלקטרו של תאי שיער שיווי המשקל תלויים בארכיטקטורה המורכבת שבתוכה הם משובצים 7. ניתן לראות בתרשים 5, כי הכנת האפיתל שיווי המשקל חצי שלמותם ניתן להשתמש כדי להבדיל בין סוג I תאי שיער (איור 5 א), תאי שיער מסוג II (איור 5), וגביע עיקרי מביא (איור 5 ג) המבוסס על דגנים conductances הסלולרי אופייני. מאפיינים אלה כוללים "לשקוע" מבוטא בשלילת קוטביות וזרמים גדולים "קורסת" זנב בסוג ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מנגנוני תחושת האיזון שלנו זכו לתשומת לב מוגבלת בהשוואה למערכות חושיות אחרות, למשל את מערכות ראייה ושמיעה. מהמחקרים שחקרו שינויים בתפקוד שיווי משקל או איזון, רוב התמקדו באמצעים התנהגותיים כולל את רפלקס vestibulo-העיני, עם ידע לא שלם מאבני הבניין הבסיסיים של מאזן תאי שיער שיווי המשקל בעצמם. אלה מחקרים שהתמקדו בתאי השיער שכמעט תמיד עשו זאת באמצעות תאי שיער בחריפות מבודדים שהוצאו מהסביבה הטבעית שלהם. במאמר זה אנו מדגימים הכנה למחצה שלמה של האפיתל חושי שיווי משקל העכבר שמרחיב ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מימון עבור עבודה זו סופק על ידי מאטה גארנט ורודני וויליאמס קרן זיכרון לפרויקט מענק לר 'לים ומחנה AJ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| מיקרוסקופ זקוף | אולימפוס | BX51WI | |
| מיקרוסקופ דו-פוטוני | אולימפוס/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 מלקחיים SF | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| מספריים דפוס סטנדרטי | FST | 14001-12 | |
| ממיר InstraTECH A-D | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter מיקרומניפולטור | Sutter | MP-225/M | |
| מגבר רב-מהדק | Axon Instruments | 700B | |
| תוכנת רכישת נתונים (אלקטרופיזיולוגיה) | Axograph | N/A | |
| ספקטור תוכנת רכישת נתונים (שני פוטונים) | מקס פלאנק חדשנות | N/A |
מקורות
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
