מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה
במאמר זה
סיכום
תקציר
היווצרות של קשרים פונקציונליים עצבית ברשת פיתוח מושפעת על ידי רמזים חיצוניים. צמיחת neurite של נוירונים מתפתחים כפופה לאותות כימיים ומכאניים, והמנגנונים שבאמצעותם הוא חש ומגיב לאותות מכאניים הם הבינו היטב. הבהרת תפקידם של כוחות בהתבגרות תא תאפשר את העיצוב של פיגומים שיכולים לקדם את הידבקות תא וצימוד cytoskeletal למצע, ולכן לשפר את היכולת של סוגים שונים עצביים להתחדש לאחר פציעה.
כאן, אנו מתארים שיטה ליישם מדידות ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. אנו מודדים את שחרור מתח באקסון באופן חלקי על ידי מעקב lesioned interferometric סימולטני של חללית לכודה אופטי דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי שלנו מזהה את שחרור המתח עם רגישות piconewton, והדינמיקה של שחרור המתח ברזולוציה זמן אלפית השנייה. לכן, היא מציעה שיטת רזולוציה גבוהה ללמוד איך הצימוד מכאני בין תאים ומצעים יכול להיות מווסת על ידי טיפול תרופתי ו / או על ידי תכונות מכאניות שונות של המצע.
מבוא
מיקרוסקופיה אופטית היא אחד ממערכת ההדמיה פחות פולשנית זמינה להתבונן תאי חיים. עם הניצול של תופעות כגון לחץ קרינה (כמו בפינצטה האופטית 1), או שטף פוטונים באנרגיה גבוהה (כמו בליזר המבתר 2), טכנולוגיה זו הוארכה עד ננו מניפולציה. מערכת ההדמיה האופטית מספקת שליטה מדויקת לדמיין ולתפעל מטרות הסלולר משנה 3. באותו הזמן, הודות לכיול מדויק של כוח לייזר נמסר, כלים אופטיים להשיג או מניפולציה מדגם רכה או פולשני עם שחזור חסר תקדים.
מספר מעבדות משולבות, באותה הגדרת ניסוי, פינצטה אופטית וליזר מבתר כדי לקטוע האברונים 4, לפתיל יחד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. התקנה אופטית
המערכת האופטית כל שתוארה קודם לכן 15. בקצרה, המערכת האופטית פינצטה מבוססת על גל רציף איטרביום (CW) הפעלה לייזר סיב ב 1064 ננומטר (IPG לייזר GmbH). מרחבי אור מאפנן (SLM) (LCOS-SLM, מודל X10468-07 - Hamamatsu) משתנה השלב של קרן לייזר אינפרא אדום נכנסת לשליטה במיקום של נקודת פוקוס ההשמנה על צלחת התרבות על ידי הולוגרמות שנוצרו במחשב. את התוכנה (קישור אינטרנט על שולחן ציוד) הולוגרמות שנוצרו זמינות באופן חופשי Blue-פינצטה מוקרנות על מאפנן אור מרחבי. אינטרפרומטר למדידות ספקטרוסקופיה כוח היה מבוסס על photodiode ארבע רבע (QPD, S5980 עם C5460SPL....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התא מייצר כוחות המתיחה על המצע על ידי הידבקויות המוקד שלה. כוח שנוצר על ידי גורמי cytoskeletal נמצא בשיווי משקל עם כוח מנטרל את המצע של התרבות. לאחר נגע לייזר המושרה של neurite, חלק מכבלי cytoskeleton נדרכו הם שיבשו ומתח equilibrated הוא שוחרר בגלל כוח הנגדי של הידבקות המצע מתבטל. המתח שוחרר מופץ באופן חלקי על הידבקויות מוקד שלא נפגעו, והחרוז מצורף קרום התא, שהתקיים במלכודת אופטית, מודד את החלק של שחרור כזה לא נוטרל ע"י אלמנטי cytoskeletal עיגון התא למצע (ראה איור 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מדווחים בעבודה זו שיטה כמותית להשוואת הידבקות neurite למצע התרבות, על ידי ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. שחרורו נמדד מתח קשור למידת ההדבקה של התא למצע: תאים עם מספר גבוה יותר של הידבקויות מוקד צריכים לשחרר פחות מתח. מדידת שחרור המתח במונחים של piconewtons מספקת כמות פיזית שבו כדי להעריך את הידבקות axonal לתמיכת התרבות בתנאים שונים 14 ניסויים.
מספר מעבדות משולבות מבתר ליי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אלברטו Guiggiani לפיתוח מערכת הבקרה בזמן אמת, אוולינה Chieregatti וHanako צושימה לדיוני תובנה, ג'אקומו Pruzzo ואלסנדרו פארודי לפיתוח אלקטרוניקה ותוכנה מותאמות אישית, וקלאודיה Chiabrera ומרינת נאני לייעוץ המקצועי שלהם וסיוע בהכנת תרבית תאים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| >מיקרוספירות פולימר, 4 μ m, מעבדות פוני מצופות COOH | PC05N/6700 | ||
| ערכת צימוד חלבון PolyLink | Polyscience | 19539 | |
| <חזק>ציוד | |||
| לייזר IR לייזר | IPG לייזר GmbH | YLM-5-SC-LP | גל רציף ytterbium (CW) לייזר סיבים הפועל ב-1064 ננומטר, עם קיטוב ליניארי |
| מודולטור אור מרחבי | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| תוכנת פינצטה | כחולה קבוצת אופטיקה, אוניברסיטת גלזגו | תוכנה להורדה בחינם | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | תוכנה | להורדה בחינםhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 עם לוח C5460SPL 6041 | ארבע דיודות צילום מרובעות למדידת תזוזה של בדיקה לכודה x, y |
| Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode למדידת תזוזה של בדיקה לכודה z | |
| לייזר UV ננו-פולס | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | לייזר UVA פועם, אורך דופק 400 ps |
| מודולטור אופטי אקוסטי | אולימפוס | MQ110-A3-UV, 355 ננומטר מיקרוסקופ זקוף סיליקה | |
| Andor | BX51 | מצויד במטרת טבילה במים 60, 0.9 NA, | |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB מכשיר EMCCD | |
| Peltier | Physic Instruments | QE1 חימום התנגדות עם מחמם ערוץ כפול TC-344B שלב | |
| : שלב מיקרו + פייזו | מכשירים לאומיים שלושה | שלבים ליניאריים M-126. CG1 נושא שלב מיקום ננו-אלקטרי פיזואלקטרי נפרד בעל 3 צירים P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | רכישת מיקום x, y, z של הגשושית הכלואה, ושליחת אותות לולאת משוב לשלב המיקרוסקופ | |
| ממשק יישומים בזמן אמת לינוקס (RTAI) | מערכת לולאת משוב בזמן אמת, לשליטה במיקום הבמה, שפותחה על שולחן עבודה ייעודי למחשב |
מקורות
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
