מאמר שיטה

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

DOI:

10.3791/50489

⸱

13 ביוני 2013

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טריפסין עיכול הוא שיטת תקן זהב לניתוח בכלי הדם ברשתית 1-5. זה מאפשר הדמיה של כל הרשת מורכב של כלי תלת ממדים ברשתית ונימי דם על ידי יצירת שטוח הר דו ממדי של כלי הדם המחוברים בין הערוצים לאחר עיכול של המרכיבים שאינם בכלי הדם של הרשתית. זה מאפשר לאדם ללמוד שינויים פתולוגיים בכלי הדם שונים, כגון microaneurysms, ניוון נימים, והאנדותל נורמלי ליחסי pericyte. עם זאת, השיטה היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד בעכברים, שהפך למודל של בעלי החיים באופן נרחב ביותר שקיימים כדי ללמוד את הרשתית בגלל הקלות של מניפולציות גנטיות 6,7. בעיני העכבר, זה קשה במיוחד להסרה מלא של רכיבים שאינם כלי הדם, תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם ברשתית. נכון להיום, קיים מחסור בספרות המתארת ​​את הטכניקה לעכל טריפסין בפירוט אניn העכבר. כתב יד זה מספק מתודולוגיה צעד אחר צעד מפורט של לעכל טריפסין ברשתית עכבר, תוך מתן גם טיפים על שלבים לפתרון בעיה קשים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לדמיין את כלי הדם של הרשתית היא גישה מאוד חשוב לנתח את המנגנונים של מחלות עיניים שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית. זה מאפשר לאדם להעריך את ליקויים בכלי הדם המוקדמים, כולל microaneurysms, ניוון נימים, ואובדן pericyte 8,9. עד כה, היו מספר טכניקות שפותחו לניתוח בכלי הדם ברשתית. טפטוף של צבעים שונים נעשה שימוש כדי לסמן את הכלים, אבל כולם חלקו מגבלות דומות. לעתים רחוקות הזרקה מדגישה את כלי הדם ברשתית כולה, אלא אם כן ניתנו בלחץ גבוה, המסכן את פקיעת ופגיעה בכולים 1. Immunostaining של האנדותל של כלי דם שבכותרת fluorophore G isolectin B4 (אלקסה פלואוריד 594 מצומדות; I21413; Invitrogen; 1:100 דילול) וmounts שטוח רשתית יכול להדגיש את הארכיטקטורה הכוללת של כלי, אבל בלי הדמיה מפורטת של נימי דם, קרומי מרתף וpericytes . צוין על ידיפרידנוואלד שיכול להיות מודגש על ידי צביעת כלי שטוח mounts של רשתית עם תקופתי חומצה שיף (PAS) או hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים 10. עם זאת, הצביעה הייתה לא ספציפית לכלי, והדגישה את הרקמה ללא כלי הדם, כמו גם, ולכן קשה להבדיל בין הכלים. בשנתי ה -1960, קוגן וKuwabara פיתחה את הטכניקה לעכל טריפסין שעשה את זה קל יותר לדמיין את כלי הדם ברשתית על ידי לעכל את מרכיבי nonvascular של הרשתית 1. מאז אותו הזמן, לעכל טריפסין הפכה את שיטת תקן זהב בניתוח בכלי הדם של רשתית 2-5. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקות חלופיות אחרות כדי לבודד את כלי הדם כבר תאר. השימוש בתמוגה האוסמוטי נעשתה שימוש כדי לבודד את כלי הדם ומאפשר מחקרים ביוכימיים של רקמת 11,12, אך ההליך לא נעשה שימוש כדרך עיקרי ללימוד אנטומי. שיטת הדפסת הרקמות כברמשמש לבודד חלקים גדולים של microvasculature ומאפשר את היכולת ללמוד ארכיטקטורת electrotonic של כלי הדם 13. בתאוריה, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את השינויים אנטומיים, כמו האיכות של כלי היא גבוהה. עם זאת, הוא רק הצליח לבודד מקטעים של רשת כלי הדם כולו. למרות ששיטות אלה לא יכולים להחליף טריפסין לעכל, חשוב לציין שיש להם יתרונות וחסרונות שונים ומשלימים בעניין זה.

שיטת עיכול טריפסין היא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע באופן עקבי 6,7. יתר על כן, כבר ציין כי טריפסין לעכל קשה במיוחד במודל של עכברים, במיוחד אם אחד רצונות כדי לשמר את הארכיטקטורה הכללית של כלי הדם ברשתית 6,7. אתגרים כוללים (1) יתר מערכת העיכול של הרשתית שגורמת לאובדן של שניהם בכלי הדם, כמו גם רקמה ללא כלי דם, (2) מתחת לעיכול, הדורשיםנתיחה מכאנית נרחבת אשר עלולה להוביל לנזק של כלי המיטה, (3) הפרדה לקויה של הרקמות שאינן כלי דם מכלי הדם שמוביל לכתמים שאינם ספציפיים. כמה כתבי יד הדגישו האתגרים הללו, אבל אף סיפקו פרוטוקול מפורט ועקבי כדי להתגבר עליהם 14,15. כתב יד זה יציג מתודולוגיה צעד אחר צעד המפרטת את הטכניקה לביצוע לעכל טריפסין על רשתיות עכבר וחולדה עם עצות ספציפיות בטיפול בשלבים הקשים במיוחד. סקירה סכמטית מוצגת באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת רשתית

  1. Enucleate עין העכבר. שימוש ביד אחת, לפתוח את עפעפי העין, כך שהעין גלויה. ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כלפי מעלה (מול מעוגל), להפעיל לחץ על היבטים עליונים ונחותים של המסלול עד שבולט הגלובוס. בעדינות לסגור מלקחיים בחלק האחורי של העין ולהרים בתנועה רציפה לenucleate העין.
  2. תקן את העין עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין במשך לפחות 24 שעות.
  3. עיניו את המקום בפתרון PBS בצלחת פטרי קטנה.
  4. לנתח את רשתית בזהירות מתחת למיקרוסקופ, מקפידים להימנע מגרימת דמעות גדולות. הפוך את חתך ראשוני בקרנית עם מספריים לנתיחה. ואז, תוך כדי לחיצה על אזור החתך עם מלקחיים ישרים, השתמש במספריים כדי לגזור לאורך הגבול של הקרנית ולובן עין הסרת הקרנית. באמצעות מלקחיים מעוקלים וישרים עדינים, בזהירות לקלף את לובן העין ורחוקה מהרשתית אל עצב הראייה דמית העין. צעד זה דורש סבלנות כמולשחרר את הרשתית במהירות יכול לגרום לדמעות. הסר את העדשה וכל קשתית עודפת ופסולת מהרשתית 16.

2. מים שוטפים

  1. רשתית מניחה בצלחת ומכסים במים (כ 500 μl, מסונן עם לפחות מסנן מיקרומטר 45) 24 גם.
  2. שינוי מים כל דקות-1 שעות 30, לפחות 4-5 פעמים.
  3. להשאיר למשך לילה במים עם טלטול עדין בטמפרטורת חדר.

הערה: שלבי הכביסה הם מאוד חשובים כפי שהוא לסייע להפריד בין שכבות רשתית עצביות מכלי הדם.

3. טריפסין דייג'סט

  1. הסר את המים ואת רשתית דגירה בתמיסה של 3% טריפסין (Difco 1:250) ב0.1 מ 'טריס חיץ (pH 7.8) בשעה 37 ° C עם רעד עדין לא. טריפסין עיכול יושלם כאשר הרקמה מתחילה להראות סימני ההתפוררות (כ 1.5 שעות).
    שים לב: יש להימנע מטלטול מהירכמו זה יכול לגרום נזק לכלי הדם.
  2. זהירות, פיפטה טריפסין אל נפרד גם באמצעות מיקרוסקופ כדי להימנע מלגעת ברשתית. טריפסין עודף זה יכול לשמש מאוחר יותר, כאשר מניפולציה של כלי מתחת למיקרוסקופ, בשלב 4.3.

4. הפרדת כלי הדם

  1. הוסף מים מסוננים לרשתית. לאחר מכן, אנסה לקלף את קרום הגבלה הפנימי עם מלקחיים, תוך שימוש במספריים במידת צורך. Shake עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות. זהירות, פיפטה את המים מתחת למיקרוסקופ, כדי למנוע פגיעה ברשתית.
  2. חזור על שוטף למים (5 דקות כל אחד) כדי לסייע בחינם ברשת של כלי מרקמת הרשתית חסיד. שוטף מים הושלם כאשר יש לא מעט פסולת שנותרה במים לאחר שטיפה.
  3. מניפולציות זהירות תחת מיקרוסקופ לנתיחה כעת זקוקה לחופשיים יותר את הרשת של כלי דם. להלן כמה טכניקות שימושיות, אשר עשוי לשמש ברצף או individually כדי להשיג את התוצאה הרצויה על בסיס העדפה טכנית:
    1. בעזרת פיפטה μl 200, פיפטה בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לכלי שיט, שנושב בכלי מים, גורם לתסיסה עדינה.
    2. באמצעות פיפטה μl 200, פיפטה טריפסין למעלה ולמטה כדי לעזור קירות מעיל של פיפטה. ואז, בזהירות פיפטה רשת הכלי כולו למעלה ולמטה פעם אחת כדי לעזור לשבור את הרקמה ללא כלי דם.
      הערה: מרכוז קצה פיפטה בעצב הראייה ולא את הקצוות של רשת כלי הדם יכול גם למנוע מהם להידבק כלי דם ועד לקצה.
    3. רם בעדינות כלי דם עם מלקחיים עדינים מחוץ למים כדי לסלק רכיבים שאינם בכלי הדם.
    4. אם הצעדים הנ"ל אינם עובדים, להוסיף טריפסין לרשתית כדי לעזור לשבור את הרקמה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות. לאחר מכן, להסיר טריפסין וחזור על שלבי 4.1-4.3.

<חזקה> הערה: הקפד מעיל כל המכשירים שבאים במגע עם הכלים בטריפסין (למשל פיפטה הקצה, מלקחיים). זה יעזור למנוע הדבקה של כלי דם לציוד.

5. לדמיין את כלי הדם

  1. מניחים ירידה של מים לשקופית נקי. בעזרת פיפטה μl 200 או מלקחיים, להעביר את כלי מתעכלים אל תוך המים. ודא שטוח כלי דם ההר הוא פרש. מתח הפנים של המים מסייע לנפרש רשת כלי דם החברה שקופה. אם הרקמה לא להתפתח, להוסיף מים נוספים ובעדינות לנער את השקופית כדי להקל על התגלגלות.
  2. להסיר את עודפי מים באיטיות רבה על ידי pipetting או בעזרת מגבת נייר.
  3. לאפשר שקופיות להתייבש לחלוטין.
  4. כתם שקופיות באמצעות פרוטוקול מתאים גם עם PAS / hematoxylin או H & E כתם.
    הערה: PAS / hematoxylin שימושי לזיהוי קיר כלי וגרעיני הסלולר; H & E היא שימושית עבור דemonstration של RBC גם כן.
  5. מייבשים ולעלות (Permount הרכבה בינונית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא בעלת הר בכל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שמרה על האדריכלות, מוכתם גם PAS / hematoxylin או H & E, כפי שמוצג באיורים 2-4. הבחנה ברורה של תאי האנדותל וpericytes ניתן לראות, כפי שמוצגת באיור 3. ברשתית, הגרעינים של תאי האנדותל הם סגלגלים או מוארכים ולשכב לחלוטין בתוך דפנות כלי הדם. גרעיני Pericyte הם קטנים, כדוריים, כתם בצפיפות ובאופן כללי יש לי עמדת תפוח של הנימים לאורך הקיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טריפסין עיכול הוא שיטה סטנדרטית על מנת להעריך בכלי הדם של הרשתית. למרבה הצער, זה מאתגר מבחינה טכנית ויכול לגרום לשיעור גבוה של אובדן דגימה אם לא מבוצע כהלכה. יתר על כן, ההליך הוא קשה במיוחד בעכברים, מה שיכול להגביל את היישום של טכניקה זו במודלים של בעלי החיים הגנטיים הנפוצים של מחלות עיניים. מאמר זה מספק הדרכה כיצד לבצע את ההליך בצורה יעילה ועקבי בעיני עכבר.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, חשוב כי הרשתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH RO1-EY019951 (AAF), חברת אילינוי למניעת עיוורון (מרכז קהילתי יהודי, משרת בחיל אוויר), קרנות בלתי מוגבלות למחלקת עיניים ממחקר למניעת עיוורון (RPB), ניו יורק וRPB הרפואי הסטודנטים המלגה גרנט (JCC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
REAGENTS
10% ניטרלי פורמליןFischer ScientificSF100-4
טריפסין (1:250)Amresco0458-50Gהכינו 3% טריפסין ב-0.1 M בסיס Tris
TRIZMASigmaT1503-1KGצרו 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 ° C)
TRIZMASigmaT3253-500G
בקבוק ואקום סטרילי SteritopMilliporeSCGPS05REצור מים
<חזק>ציוד
>מיקרוסקופכל מיקרוסקופ המאפשר הדמיה טובה של הרשתית מספיק. (10x מספיק עם מרחק עבודה של 24 מ"מ)
מספריים ישריםFine ScienceTools 15024-10קצה חיתוך: 8 מ"מ; קוטר קצה: 0.2 מ"מ; 10 ס"מ
מלקחיים ישרים (Inox)Dumont #511252-20קצה ביולוגי; 0.05 x 0.02 מ"מ; 11 ס"מ
Forcepts מעוקלים (Dumostar)Dumont #711297-10קצה ביולוגי; 0.07 x 0.04 מ"מ; 11.5 ס"מ
Dubnoff מטבולי שייקר אינקובטורדיוק מדעיBDG59442שייקר אופציונלי
צלחת 24 בארותפלקון353047
מיקרוסקופ שקופיותVWR82027-132
מסוננים מנתח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flat Mount

מאמרים קשורים