כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה דרוזופילה זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
צורת תא היא קריטית לתפקוד תא. עם זאת, למרות חשיבותה של מורפולוגיה של תאים, מעט מאוד ידוע על אופן בו תאים בודדים ליצור צורות ספציפיות. תאים סופניים קנו נשימה תסיסנית הפכו מודל גנטי רב עוצמה כדי לזהות ולהבהיר את התפקידים של גנים הנדרשים ליצירת מורפולוגיות הסלולר. תאי הדקים הם מרכיב של רשת צינורות מסועפת, המערכת לקנה הנשימה המתפקדת כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות. תאי Terminal הם מודל מצוין לחקר שאלות של צורת תא כפי שהם בעלי שתי ארכיטקטורות סלולריות שונות. ראשית, יש תאים סופניים מורפולוגיה קנים משוכללת, בדומה לתאי עצב מורכבים; שני, סניפי מסוף סלולרי נוצרים כדקים צינורות ומכילים תאי לום קרום הנכנס. ניתוח כמותי של מספר מסוף תא סניף, ארגון סניף וסניף צורה פרטנית, ניתן להשתמש בו כדי לספק מידע על תפקידו של mech הגנטי הספציפיanisms בהתהוות של תאים מסועפים. ניתוח של היווצרות צינור בתאים אלה יכולים לחשוף את המנגנונים נשמרים של tubulogenesis משותפים לרשתות צינורי אחרות, כגון כלי דם החוליות. כאן אנו מתארים טכניקות שיכולים לשמש כדי לתקן במהירות, תמונה, ולנתח את שני דפוסי הסתעפות והיווצרות תאי צינור במסוף בתוך זחלי דרוזופילה. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לנתח תאים סופניים בחיות הבר מסוג ומוטציה גנטיים, או פסיפסים. בגלל היעילות הגבוהה של פרוטוקול זה, הוא גם מתאים מאוד לגנטי, RNAi מבוסס, או מסכי סמים במערכת תסיסנית קנה הנשימה.
מבוא
צורת תא היא קריטית לתפקוד של תאים בודדים בתוך האורגניזם, כמו גם תאים שמתפקדים כחלק מאיבר או רקמה. אנו משתמשים בתאים תסיסנית קנו נשימת מסוף, מרכיב של מערכת הנשימה החרקים, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המשתתפים בשליטה על שני סוגים נשמרים של מורפולוגיה תאית: היווצרות צינור (lumenogenesis) והסתעפות. תאי מסוף נמצאים בקצוות של רשת מסועף של צינורות שפונקציות כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות 1 ויש לי מורפולוגיה קנים משוכללת אשר תלוי במסלול איתות FGF שהוא נשלט על ידי רמות חמצן מקומיות בתוך יעד רקמות 2. ענפים סלולריים מסופים צינורות דקים, עם לום subcellular מלאי גז המתרוצץ בכל סניף. הארכיטקטורות שונות של ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דור פסיפס
- צלב גנטי
האמבטיה w FRT 19 א: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, כטב"מ-GFP (זכרים) X * FRT 19 א / אל (נשים), שבו * מייצג את המוטציה כדי להיבחן. הערה: הגדרה לעבור לפחות יום אחד לפני הניסוי, כמו זו מאפשרת חיות להזדווג כראוי. - טרום חילוני: צלב העברה לבקבוקונים לטוס-מזון עם כתם קטן של רסק שמרים טרי הונח על כלי התקשורת. לאפשר לשכבת במשך שעה 1 ב 25 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות מוצגות באיור 2. קבוצה אחת לרוחב (LG) תא מסוף מציגה הסתעפות subcellular נרחבת (דמיין ידי GFP;) ולום subcellular מלאי גז פועל באמצעות כל אחד מהסניפים (דמיינו ידי מיקרוסקופ brightfield; ב '). תמונות אלו נאספו מזחל L3 פסיפס, שנוצרו באמצעות מערכת MARCM המתוארת בסעיפי 1 ו -2, ונקבע חום וצלם, כאמור בסעיפים 3 ו -4. לוחות C & D להראות שמץ NeuronJ שנוצר, כאמור בסעיף 5, של הסניפים ולומן בהתאמה מהתמונות המוצגות בA & E & B. פנלי F להראות את המיקום של השו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקת קיבוע החום המתוארת כאן היא כלי מהיר ונוח לתאים סופניים קונים נשימת הדמיה תסיסנית זחל. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבחון את ההסתעפות ודפוס לומן של wild-type תאים. קנו נשימת תאים להביע GFP, מונע על ידי האמרגן הספציפי לקנה הנשימה הנשימה, יכולים להיות בקלות דמיינו דרך ציפורן הזחל לאחר קיבוע חום. את דפוסי הסתעפות מסוימים של תאי מסוף בודדים, כמו גם אלה של לומן מלא באוויר, יכולים להיות במהירות ודמיינו שנמדדו באמצעות שיטה זו. טכניקה זו יכולה גם להתבצע על זחלי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.
תודות
אנו מודים לג'יליאן סטנפילד להערות על כתב היד. טאג' נתמך על ידי אוניברסיטת יוטה הגנטיקה הדרכה גרנט T32-GM007464 מNIGMS NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סטודנט Dumont #5 מלקחיים | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 מיקרוסקופ מנתח (או שווה ערך) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 מיקרוסקופ מורכב (או שווה ערך) | Carl Zeiss | מצויד ב-AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, סט מסננים 38HE | |
| 100% גליצרול | BioExpress | M152-4L | |
| זבוב | : w FRT19A tub: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| מלאי | גנוטיפ: y w FRT19A |
מקורות
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
