הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בחינה של

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50496

⸱

9 ביולי 2013

 , 
1Department of Human Genetics, University of Utah

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה דרוזופילה זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.

תקציר

צורת תא היא קריטית לתפקוד תא. עם זאת, למרות חשיבותה של מורפולוגיה של תאים, מעט מאוד ידוע על אופן בו תאים בודדים ליצור צורות ספציפיות. תאים סופניים קנו נשימה תסיסנית הפכו מודל גנטי רב עוצמה כדי לזהות ולהבהיר את התפקידים של גנים הנדרשים ליצירת מורפולוגיות הסלולר. תאי הדקים הם מרכיב של רשת צינורות מסועפת, המערכת לקנה הנשימה המתפקדת כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות. תאי Terminal הם מודל מצוין לחקר שאלות של צורת תא כפי שהם בעלי שתי ארכיטקטורות סלולריות שונות. ראשית, יש תאים סופניים מורפולוגיה קנים משוכללת, בדומה לתאי עצב מורכבים; שני, סניפי מסוף סלולרי נוצרים כדקים צינורות ומכילים תאי לום קרום הנכנס. ניתוח כמותי של מספר מסוף תא סניף, ארגון סניף וסניף צורה פרטנית, ניתן להשתמש בו כדי לספק מידע על תפקידו של mech הגנטי הספציפיanisms בהתהוות של תאים מסועפים. ניתוח של היווצרות צינור בתאים אלה יכולים לחשוף את המנגנונים נשמרים של tubulogenesis משותפים לרשתות צינורי אחרות, כגון כלי דם החוליות. כאן אנו מתארים טכניקות שיכולים לשמש כדי לתקן במהירות, תמונה, ולנתח את שני דפוסי הסתעפות והיווצרות תאי צינור במסוף בתוך זחלי דרוזופילה. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לנתח תאים סופניים בחיות הבר מסוג ומוטציה גנטיים, או פסיפסים. בגלל היעילות הגבוהה של פרוטוקול זה, הוא גם מתאים מאוד לגנטי, RNAi מבוסס, או מסכי סמים במערכת תסיסנית קנה הנשימה.

מבוא

צורת תא היא קריטית לתפקוד של תאים בודדים בתוך האורגניזם, כמו גם תאים שמתפקדים כחלק מאיבר או רקמה. אנו משתמשים בתאים תסיסנית קנו נשימת מסוף, מרכיב של מערכת הנשימה החרקים, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המשתתפים בשליטה על שני סוגים נשמרים של מורפולוגיה תאית: היווצרות צינור (lumenogenesis) והסתעפות. תאי מסוף נמצאים בקצוות של רשת מסועף של צינורות שפונקציות כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות 1 ויש לי מורפולוגיה קנים משוכללת אשר תלוי במסלול איתות FGF שהוא נשלט על ידי רמות חמצן מקומיות בתוך יעד רקמות 2. ענפים סלולריים מסופים צינורות דקים, עם לום subcellular מלאי גז המתרוצץ בכל סניף. הארכיטקטורות שונות של תאים הסלולריות מסופים, יחד עם קלות שבה ניתן לבצע ניתוח גנטי בדרוזופילה, להפוך את התאים האלה F מודל מצויןאו חקר מנגנונים של תולדה סלולרית, מסתעף, והיווצרות צינור תוך תאית. תאי מסוף הוכיחו מודל שימושי להבנת חלק ממסלולי האיתות המובילה להתמיינות תאים מסועפת, תולדה, והתבגרות 2-4. באמצעות מערכת זו משוחדת, מסכי קדימה גנטיים למוטנטים המורפוגנזה סלולריים כבר בוצעו, מניב תובנות מנגנוני שליטה תא צורה 5,6. לדוגמה, מסכי אלה חשפו כי RabGAP ספציפי נדרש לקוטביות cytoskeletal וסחר בשלפוחית ​​בהיווצרות ומיצוב 7 לום; שהידבקות integrin בתיווך נדרשת ליציבות ענף 8, וכי חלבוני PAR-קוטביות אפיתל לווסת את סחר קרום מקוטב נדרש עבור שניהם לום היווצרות 9 הסתעפות ו. מחקרים אחרים בתאי מסוף הראו כי הצטברות אקטין סימטרית וארגון microtubule נדרש להתארכות תא וlumenogenesis 10. לפיכך, מנגנוני תאים שונים, נשמרים ביולוגיים יתרמו להמורפוגנזה תא מסוף.

כאן, אנו מתארים שיטה לתקן את הזחלים תסיסנית שלישי instar-שלמים לניתוח של מסוף היווצרות לום תא הסתעפות ובמהירות. פרוטוקול זה גם יכול להתבצע על בעלי החיים instar גם ראשונים והשני. מפתח לטכניקה זו היא היכולת לדמיין תאי מסוף שכותרתו גנטית על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי ישירות דרך ציפורן הזחל של בעלי חיים שלמים. מאז הליך זה אינו דורש שום מניפולציות לאחר קיבוע, כגון צביעת נוגדנים, כדי לבחון את התאים, הוא גם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה, כולל בדיקות גנטיות או בסמים. ביטוי חלבון פלואורסצנטי חושף את המבנה של הסניפים המלאים cytoplasmically. היווצרות צינור יכולה להיות במעקב במקביל באמצעות מיקרוסקופ brightfield לזהות לום גז מלא, העומד בניגוד לסביבת נוזל המילוירקמות ed.

בפרוטוקול זה כלל הוא השיטה ליצירת פסיפסים גנטיים המבוססים על מערכת MARCM 11, כדי לייצר תאים סופניים מוטציה הומוזיגוטים שכותרתו עם חלבוני ניאון בבעלי חיים בדרך אחרת ללא תווית. זה הכרחי, שכן תאים סופניים לפרט המבנים המורכבים שלהם רק בשלב מאוחר יחסית בפיתוח; פסיפסים גנטיים מאפשרים מעקף של דרישות הגנים ברקמות אחרות מוקדמת יותר בפיתוח. . כדי ליצור שיבוטים MARCM, קנה נשימה מסומנות באמצעות מנהל ההתקן הספציפי לקנה נשימת הנשימה (BTL) 12 מתוארת כאן הוא הפרוטוקול לכרומוזום X תסיסנית; לכרומוזומים אחרים, ניתן להשתמש בהליך דומה, עם חומרים כימיים גנטיים מתאים לכרומוזום להיות בדק. כאן, קנה נשימה מתויגת על ידי ביטוי של GFP cytoplasmically מקומי, אבל ההליך עובד באותה מידה גם עם ביטוי של חלבוני ניאון אחרים, כגון DsRed.

בנוסף, יש לנו כלל שיטה לכמת דפוסי הסתעפות והיווצרות לומן בתאים סופניים, המבוסס על שיטות שפותחו לאפיון דפוסים עצביים 13 סניפים. סוג זה של נתונים כמותיים יכול להיות קריטי בתפקיד ההבחנה המדויק של הגנים בתהליך ההסתעפות או lumenogenesis, כמו גם לאפשר להשוואה ישירה בין מוטציות שונות 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דור פסיפס

  1. צלב גנטי
    האמבטיה w FRT 19 א: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, כטב"מ-GFP (זכרים) X * FRT 19 א / אל (נשים), שבו * מייצג את המוטציה כדי להיבחן. הערה: הגדרה לעבור לפחות יום אחד לפני הניסוי, כמו זו מאפשרת חיות להזדווג כראוי.
  2. טרום חילוני: צלב העברה לבקבוקונים לטוס-מזון עם כתם קטן של רסק שמרים טרי הונח על כלי התקשורת. לאפשר לשכבת במשך שעה 1 ב 25 ° C.
  3. הנח: חיות העברה מבקבוקון מראש להניח לבקבוקון טרי עם כתם קטן של רסק שמרים טרי. לאפשר להניח ל6 שעות ב 25 ° C.
  4. מבוגרים העברה בחזרה מראש להניח בקבוקון לאחסון ושימוש בניסויים הבאים. הלם באופן מיידי חום הבקבוקון המכיל 0-6 שכב עוברים ישנים HR ל45 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, באמבט מים במחזור. הערה: פני השטח של המזון צריך להיות מתחת למפלס המים כדי לאמת את כלעוברים כראוי לחמם בהלם.
  5. דגירה בקבוקונים המומים חום של 25 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים עד שזחלי instar שלישי להתחיל לנדוד.

2. מסך למען בעלי חיים פסיפס

  1. בעזרת מלקחיים בסדר בעדינות להרים זחלים שלישי instar-נודדים מן הצדדים של הבקבוקון ולהכניס אותם לתוך גליצרול 100% צוננים בצלחת פלסטיק קטנה.
  2. בחן את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ לנתח הגדלה גבוה מצוידים באופטיקה ניאון. זהה את הזחלים עם ביטוי פסיפס של תאים שכותרתו fluorescently קונים נשימה. בדרך כלל, זה יכול להיעשות ב10-הגדלת 20X.

3. קיבוע חום

  1. בעזרת מלקחיים בסדר לבחור בקפידה חיות פסיפס מתוך הצלחת ומניחה בירידה של 100% גליצרול טרי בשקופית זכוכית לבנה מ"מ 75x25x1 מיקרוסקופ. הערה: ניתן להציב בעלי חיים רבים בירידה (איור 1 א).
    יכולים גם להיות ממוקמים בעלי חיים בטיפת גליצרול ישירות על גבי coverslip,אך יש להקפיד במהלך קיבעון (שלב 3.2), כמו החיות תהיה לחמם במהירות רבה והוא יכול להיות מעל קבוע.
  2. שקופיות זכוכית מקום על 70 מעלות צלזיוס עד לגוש חום החיות רק להפסיק לנוע, לא יותר מ -20 שניות לשקופית, ו -10 שניות ללהחליק את מכסה (איור 1). בעלי חיים להתפתל בהתחלה, אבל לעצור ולהיות נוקשה ומוארך פעם אחת מת. הערה: חשיפה לחום ארוכה מדי תפגע בסניפי מסוף ולומן, כמו גם להפוך את אות ה-GFP עמומה ומפוזרת. ליעילות אופטימלית מומלץ לי הגוש החום באותו החדר כמו מיקרוסקופים.
  3. בעזרת מלקחיים בסדר בזהירות לכוון את כל הזחלים בירידה בכיוון אחד, כך שכל הזחלים בשקופית מקבילים בכיוון אחד לשני (איור 1 ג).
  4. מניח בעדינות מכסה זכוכית מייקר 18x18mm על גבי זחלים (או להפוך את coverslip לשקופית זכוכית) ולמנוע בועות יוצרים (1D איור). הערה: ייתכן שלא תשקר coverslip בדיוקדירה על זחלים, זו לא בעיה.
  5. זחלי תמונה בתוך 30 דקות. תאי מסוף קבועים חום יהיו לבזות ואות ה-GFP תהפוך להיות מאוד מפוזרת.

4. בתחום ההדמיה vivo של תאי קני Terminal

  1. הנח שקופית על הבמה של stereomicroscope מתחם. באמצעות מטרה לאתר 5X שני גזעי הגב המקבילים ריצה מקדמית לאחוריים על פני השטח הגבי של בעל החיים (איור 1F). לאתר את שני תאים סופניים גב, באופן ישיר בין שני הגזעים הגבי. זה עוזר לזהות את הקטע המתאים לניתוח.
  2. פעם אחת בכיוון, לסובב את החיות לתאים סופניים רצויים תמונה. כדי לעשות זאת, בזהירות לדחוף את coverslip על הקצה עם המלקחיים בניצב לציר הארוך של הזחלים, מגלגלים את הזחלים מתחת coverslip (האיורים 1E ו1G) באיטיות.
  3. בחירת תאי המסוף המתאים היא קריטית לתוצאות עקביותוהשוואות בין מוטציות. (FB) תאים סופניים סניף השומן בגוף נמצאים בסמוך לגזע הגבי, לרוחב קו האמצע בקלות. התאים סופניים לרוחב קבוצת G (LG) הם מצאו בקלות והם ממוקמים רק לרוחב של קו האמצע הגחון (איור 1H). הערה: ב( TR10) המגזרים הקדמיים ביותר (TR1) ואת אחורי של תא הסדר מסוף הוא מסתעף ממגזרים אחרים. אנו מנתחים רק תאים סופניים במגזרי TR2-Tr9. יש תאים סופניים הגבי דפוס הסתעפות סטריאוטיפי יותר מאשר תאים סופניים קנו נשימה אחרות. זה יכול להיות תלוי באותות נוספים, שאינו תא אוטונומיים, וזה צריך להילקח בחשבון כאשר מחליטים אם לכלול אותם בניתוח.
  4. ברגע שתא מסוף עניין זוהה, ללכוד תמונה באמצעות ההגדלה הרצויה, בדרך כלל 10X או 20X הוא הטוב ביותר (איור 2 א). הערה: בשל דפוסי הסתעפות משתנות, מנסה ללכוד תמונות שכוללות כמה שיותר סניפים וטיפים לסניף ככל האפשר.
  5. מבלי להזיז את הבמה, לכבות את הקרינה ולהדליק את האור מועבר ללכוד תמונת brightfield של אותו התא ומישור מוקד (איור 2). הלום יהיה דמיינו כמו קדרות מנוגדת בתוך חלל תא המסוף. אם מתכנן על סניפים לכמת סלולריים מסוף ולומן, לאסוף מספר רב של תמונות במטוסי מוקד מרובים של כל תא מסוף.

5. ניתוח וכימות של מורפולוגיה של תאי מסוף באמצעות ImageJ

  1. פתח את תמונות הניאון וbrightfield באמצעות ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) התוספת NeuronJ (http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/).
  2. שימוש בכלי "הוסף העתקים", באופן ידני לאתר את הסניפים ולומן של תא הטרמינל כולו.
  3. שימוש באפשרות "תווית ההעתקים", שינוי שם וRecolor להקצות לכל קו בתוך עקבות ייעוד ספציפי.
  4. שימוש באפשרות "הגדר הפרמטרים", לשנות את עובי הקו 6-10 512x512 פיקסלים (לתמונות המתקבלות מהמצלמה הדיגיטלית מחוברת למיקרוסקופ המתחם. למצלמות ברזולוציה גבוהות יותר או נמוכות יותר, ברוחב פיקסל צריך להיות מדורגת כראוי), תוך שימוש בכל הגדרות ברירת מחדל אחרות, ולבחור "אישור". לאחר מכן להשתמש בכלי "הפוך תמונה" לקחת תמונה. בחר "צייר עקבות" כדי לקבל תמונת מצב של העקבות שניתן לראות בצד על ידי צד עם מקורי.
  5. בחר באפשרות "מדוד ההעתקים" ובחר את סוג המעקב (כלומר שסניפים למדידה המבוססים על הייעודים הספציפיים שהוקצו בשלב 5.3). בשלב הבא, בחר באפשרות "תצוגת מדידות מעקב" ו "מדידות קודמות ברור" ולאחר מכן לחץ על "הפעל". זה יהיה לייצר גיליון אלקטרוני המכיל את השם, תווית, אורך (בפיקסלים), ונתונים אחרים לתמונה. לאחר מכן ניתן לשמור את הנתונים כגיליון אלקטרוני של Microsoft Excel עבור סטטיסטי נוסףניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות מוצגות באיור 2. קבוצה אחת לרוחב (LG) תא מסוף מציגה הסתעפות subcellular נרחבת (דמיין ידי GFP;) ולום subcellular מלאי גז פועל באמצעות כל אחד מהסניפים (דמיינו ידי מיקרוסקופ brightfield; ב '). תמונות אלו נאספו מזחל L3 פסיפס, שנוצרו באמצעות מערכת MARCM המתוארת בסעיפי 1 ו -2, ונקבע חום וצלם, כאמור בסעיפים 3 ו -4. לוחות C & D להראות שמץ NeuronJ שנוצר, כאמור בסעיף 5, של הסניפים ולומן בהתאמה מהתמונות המוצגות בA & E & B. פנלי F להראות את המיקום של השו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקת קיבוע החום המתוארת כאן היא כלי מהיר ונוח לתאים סופניים קונים נשימת הדמיה תסיסנית זחל. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבחון את ההסתעפות ודפוס לומן של wild-type תאים. קנו נשימת תאים להביע GFP, מונע על ידי האמרגן הספציפי לקנה הנשימה הנשימה, יכולים להיות בקלות דמיינו דרך ציפורן הזחל לאחר קיבוע חום. את דפוסי הסתעפות מסוימים של תאי מסוף בודדים, כמו גם אלה של לומן מלא באוויר, יכולים להיות במהירות ודמיינו שנמדדו באמצעות שיטה זו. טכניקה זו יכולה גם להתבצע על זחלי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

אנו מודים לג'יליאן סטנפילד להערות על כתב היד. טאג' נתמך על ידי אוניברסיטת יוטה הגנטיקה הדרכה גרנט T32-GM007464 מNIGMS NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סטודנט Dumont #5 מלקחייםFine Scientific Tools91150-20
Leica MZ16 מיקרוסקופ מנתח (או שווה ערך)LeicaMZ16
AxioImager M1 מיקרוסקופ מורכב (או שווה ערך)Carl Zeissמצויד ב-AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, סט מסננים 38HE
100% גליצרולBioExpressM152-4L
זבוב: w FRT19A tub: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
מלאיגנוטיפ: y w FRT19A
גנוטיפ מלאי זבוב

מקורות

  1. Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
  2. Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
  3. Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
  4. Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).
  5. Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).
  6. Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
  8. Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
  9. Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
  10. Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  12. Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
  13. Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות במיקרוסקופיה של אורפרוטוקול קיבוע בחוםסימון בחלבון פלואורסצנטיניתוח דפוסי הסתעפותכימות יצירת צינורותניתוח פסיפס גנטימורפולוגיה של מערכת הקשמיותויזואליזציה של ביטוי GFPניתוח במיקרוסקופיה בשדה בהיר
בחינה של
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.