Method Article

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין שיטות ללימוד אינטראקציה בין חלבונים בתוך תאים, שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא יחסית פשוטה ורגישה. BiFC מבוסס על הייצור של הקרינה באמצעות שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי (ונוס, גרסת חלבון פלואורסצנטי צהובה, משמש כאן). ברי ונוס ללא ניאון (VN והון סיכון) הם התמזגו לשני חלבוני אינטראקציה (במקרה זה, AKAP-LBC וPDE4D3), מניב הקרינה עקב אינטראקציה VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 וההיווצרות של חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי בתוך תאים.

BiFC מספק מידע על לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים ואת כוחו של אינטראקציות חלבון המבוססות על עוצמת הקרינה. עם זאת, ניתוח BiFC באמצעות מיקרוסקופ כדי לכמת את כוחו של האינטראקציה בין חלבונים הוא זמן רב ומעט סובייקטיבית בשל ההטרוגניות בביטוי חלבון ואינטראקציה. על ידי צימוד זרימת cytometricניתוח עם מתודולוגיה BiFC, אות ניאון BiFC האינטראקציה בין חלבונים ניתן למדוד במדויק לכמות גדולה של תאים בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים יישום של מתודולוגיה זו כדי למפות אזורים בPDE4D3 הנדרשים לאינטראקציה עם AKAP-LBC. המתודולוגיה תפוקה גבוהה זה יכול להיות מיושם על גורמים המווסתים את הקרנת האינטראקציה בין חלבונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

650,000 אינטראקציות בין חלבונים מוערכות להתקיים בinteractome האנושי, ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על 1,2 פונקציות רגילה של תא. חוץ משיתוף immunoprecipitation (שיתוף ה-IP), את תקן הזהב ללמוד אינטראקציה בין חלבונים מlysate התא, כמה מבחני שלמת בר חלבון (PCA) פותחו כדי לשפר את הרגישות באיתור חלבונים אינטראקציה בתוך תאים 3. טכניקות כוללות העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג), תהודת העברת אנרגיה פליטת אור (ברט), ושלמת הקרינה bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC מבוסס על עמותת הנחייתם של שני שברי חלבון פלואורסצנטי (כאן אנו משתמשים ונוס; גרסת YFP), כי הם כל התמזגו לשותף חלבון אינטראקציה פוטנציאלי (בדוגמה זו אנו משתמשים AKAP-LBC וPDE4D3). אינטראקציה של שני החלבונים של עניין בתוך תוצאות תאים בקרינה פונקציונלית, אשר ניתן דמיינו ידי Fמיקרוסקופיה luorescence או באמצעות תאי חיים או קבועים 6,7,8. בהשוואה לPCAs אחר, BiFC הוא רגיש ופחות מאתגר מבחינה טכנית, עם פוטנציאל ללמוד לוקליזציה הסלולר בתאים חיים. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שיצר עם זאת פעם אחת, לא יכול להיות הפוך מורכב חלבון פלואורסצנטי. לכן זה לא שיטה טובה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים דינמיים. במאמר זה, אנו משתמשים BiFC למפות את האתרים של האינטראקציה עם PDE4D3 AKAP-LBC על ידי ניטור את עוצמות הקרינה של ונוס. בהשוואה לניתוח מסורתי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שהוא גוזל זמן והעבודה אינטנסיבי (אם לא מתבצע באמצעות מכונות אוטומטיות תפוקה גבוהה), cytometry הזרימה מספק ניתוח הכמותי פשוט של אלפי תאים באוכלוסייה הטרוגנית על פני זמן קצר 9, 10. כאן, על ידי ביצוע השוואת Side-by-צד של זרימת ניתוח ושיתוף IP מסורתי cytometric-BiFC, אנו מדגימים כי שתיים מ 'ethods לספק נתונים דומים, עם זאת, ניתוח תזרים cytometric BiFC הוא פחות זמן רב ומשתמש בפחות חומר שעשויה להיות שימושיות יותר כאשר תאים של עניין מוגבלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection הסלולרי

  1. פלייט תאי היום לפני transfection, תאי ציפוי פחות עבור immunofluorescence.
    1. לimmunofluorescence: בצלחת, מכסה מחליק זכוכית מעיל 6 גם (1 לכל טוב) עם 0.02% ג'לטין על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות, לשטוף פעם עם מדיום, וגם לכל אחד, צלחת 1 x 10 5 HEK 293T 2 תאים במדיום גידול מ"ל מלא [התקשורת השונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% FBS].
    2. למנתח כתם זרימת cytometric והמערבי: צלחת 1.2 x 10 5 תאי HEK 293T / גם במדיום גידול 2 מ"ל שלם בצלחת 6 היטב (0.3 10 293T תאי x 5 HEK ב0.5 מדיום גידול שלם מ"ל לכל טוב בצלחת 24 גם ).
  2. הכן את ה-DNA לtransfection פי הפרוטוקול של הייצור: Effectene (Qiagen) משמש לimmunofluorescence. Transit-LT1 (Mirus) משמש למנתח כתם זרימת cytometric והמערבי. כמות ה-DNA משמש היא מפורטת להלן.
    צלחת 24 גם (נ"ג) צלחת 6 היטב (נ"ג)
    CFP וקטור 10 50
    VN N-AKAP-LBC 200 1000
    N-VC PDE4D3-FL (באורך מלא PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC-N-PDE4D3 UCR1 (שבר PDE4D3 N-מסוף המכיל תחום UCR1) 100
    VC-N-PDE4D3 UCR2 + חתול (שבר בטרמינל C-PDE4D3 המכיל את תחומי UCR2 וקטליטי) 100
    Transfection באמצעות Effectene (6 היטב):
    1. הוסף סכום המצוין של פלסמיד דנ"א + 4 משפר μl עד 100 μl החיץ EC, לערבב, ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. הוסף 5 Effectene μl, לערבב, ודגירה במשך 10 דקות בשעהטמפרטורת חדר. הוסף טיפה חכמה לתאים.
    Transfection באמצעות מעבר-LT1 (6-well/24-well):
    1. הוסף סכום המצוין של ה-DNA פלסמיד ל250 μl/50 μl של מדיום סרום ללא Opti-ממ אני בצינור סטרילי.
    2. הוסף מגיב Transit-LT1 לתערובת ה-DNA בדילול מלא ופיפטה בעדינות לתערובת. (Transit-LT1 מגיב: יחס ה-DNA הוא 3 μl של-LT1 מעבר למגיב 1 מיקרוגרם של ה-DNA).
    3. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ולהוסיף טיפה חכמה לתאים.

2. הכנת תא לcytometry זרימה, כתם מערבי, וImmunofluorescence

  1. 24 שעות לאחר transfection, לבדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence לפני קצירת תאים.
  2. הכנת תא לניתוח תזרים cytometric:
    1. שטוף תאים עם 0.5 מ"ל / 2 מ"ל קר כקרח PBS עבור צלחות 24-well/6-well.
    2. ניתוק תאים באמצעות 50 0.05% טריפסין μl μl/250.
    3. לנטרל טריפסין עם 200 μl / בינוני 1 מיליליטר DMEM.
    4. שיתוף250 תאי μl llect (גם בצלחת 24 גם ו6 היטב) על ידי צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות, השתמשו בתאים הנותרים (1 מ"ל) לניתוח כתם מערבי.
    5. Resuspend תאים ב250 חיץ FACS μl [PBS + 0.5% (w / v) BSA + 2 מ"מ EDTA], לאחסן על קרח לניתוח תזרים cytometric. יכולים גם להיות קבועים בתאי 1% paraformaldehyde (PBS), אם ניתוח תזרים cytometry לא יהיה מיידי.
  3. הכנת תא לניתוח כתם מערבי: מתבצעת במקביל להכנת תא לניתוח cytometry זרימה.
    1. שטפו תאי 1x עם 2 מ"ל קר כקרח PBS, lyse תאים על ידי הוספת 100 μl של חיץ תמוגה תא [10 מ"מ חיץ נתרן פוספט, pH 6.95, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 5 מ"מ EGTA, 1% טריטון X-100] .
    2. לאסוף lysate תא על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 21,000 XG ב 4 ° C.
    3. לכמת ריכוז חלבון על ידי assay החלבון ברדפורד, טען כמויות שווה של חלבון לכל נתיב ל- SDS, ולהעביר לnitrocellulose לimmunoblotting.
  4. הכנת תא לimmunofluorescence.
    1. יש לשטוף את תאי 3x עם 2 מ"ל PBS, לתקן את התאים ב 1 מ"ל של paraformaldehyde 3.7% (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף 3x עם 2 מ"ל PBS במשך 5 דקות.
    2. הר לכסות להחליק על שקופיות זכוכית, באמצעות הרכבה בינונית. לאטום את קצות coverslip באמצעות לק במידת צורך.
    3. אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס לפני הבדיקה.

3. Cytometry זרימה ומיקרוסקופיה immunofluorescence

  1. cytometry הזרימה מתבצע באמצעות Beckman Coulter ציאן ADP, המצויד ב488 ננומטר, 405 ננומטר, ו642 לייזרים של מצב מוצק ננומטר. תוכנת פסגה משמשת לרכישה וניתוח.
    1. לכייל cytometer זרימה באמצעות חרוזים סטנדרטיים.
    2. פיזור עלילה קדימה (FSC) / פיזור צידה (SSC) בקנה מידה ליניארי לאוכלוסיית תא חי gating.
    3. רוחב הפולס FSC / מתח מגרש לאוכלוסיית תא חי שאינם מצטבר gating.
    4. עלילת count/FL6 (CFP fluorescencE, 405 ננומטר) בקנה מידת יומן לתאי חיים שאינם מצטברים gating CFP-חיוביים.
    5. העלילה count/FL1 (YFP הקרינה, 488 ננומטר) בקנה מידה לעוצמת יומן BiFC.
    6. הפעל דגימות שליליות YFP-CFP כפול, להתאים FSC, SSC, FL1 וFL6 צינור מכפיל תמונה (PMT) מתח כדי לקבוע את הסף לכל אות.
    7. הפעלה אחת חיובי (גם YFP + +) וCFP פיצוי לא מחובר לעתיד הדגימות
    8. לרכוש לפחות 10,000 אירועים מגודרים (CFP + תאי חיים שאינם מצטברים) לניתוח.
  2. מיקרוסקופיה immunofluorescence מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal 510 Zeiss LSM. הערה: חשוב לשמור על כל ההגדרות (כמו זום, חריר, עלייה בגלאי, מגבר קיזוז, גודל מסגרת, מהירות סריקה, סריקת ממוצע, וכוח לייזר) עקבי בין דוגמאות להשוואה נכונה של כל הנתונים.

4. ניתוח נתונים (שבוצע באמצעות תוכנות פסגה)

  1. להגדיר את פרוטוקול הניתוח הדומה לזה לacquisitיון עם gating התקין:
    שער 1 בעלילת FSC / SSC נקודה לתאים חיים.
    שער 2 ברוחב FSC / דופק של שער 1 לתאי חיים שאינם מצטברים.
    שער 3 בספירה / CFP של שער 3 לCFP אינו מצטבר + תאי חיים.
  2. לפצות YFP ואות CFP באמצעות YFP + + וCFP תאים חיוביים יחידים.
  3. Re-קובעים קווים חתוכים לתאי CFP / YFP-חיובי.
  4. יצוא YFP מתכוון עוצמת הקרינה (MFI) של תאי CFP + ל-Excel לנתונים ההתוויה.
  5. לנרמל YFP MFI לרמות ביטוי של AKAP-LBC, PDE4D3, וטעינת שליטת α-טובולין, כפי שנקבע על ידי כתם מערבי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDE4D3 מבנים (איור 1) AKAP-LBC והיו התמזגו לVN ושברי הון סיכון, בהתאמה. אינטראקציה של PDE4D3 תוצאות תפקודית YFP הקרינה (איור 1 א) AKAP-LBC ו. כאן אנו משתמשים בשיטת BiFC לאתרי AKAP-LBC מחייבים המפה בPDE4D3. אזור נשמרים במעלה הזרם 1 (UCR1), באזור נשמרים במעלה הזרם 2 (UCR2) ואזור קטליטי (CAT) הם נשמרים בין PDE4 חלבוני משפחה, ולכן, באורך מלא (פלורידה), וUCR1 UCR2 תוספת CAT שמשו לסינון אתר הקישור של PDE4D3 לAKAP-LBC. הביטוי של VC-PDE4D3-ברים בתוצאות תא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC הוא שיטה פשוטה ורגישה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. שיטה זו אינה יכולה לשמש כדי לזהות חלבונים אינטראקציות חדשות, לעומת זאת, זה נוח במיוחד כדי לאשר את חלבונים האינטראקציה בתוך תאים וללמוד מאפיינים תפקודיים; כגון לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים, מיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים, ו להקרנה של מולקולות קטנות / פפטידים שיכולים לווסת את האינטראקציה בין חלבונים. בגלל שברי VN והון הסיכון הם לא פלורסנט, הקרינה רקע היא נמוכה, ובכך מסייע לרגישות של assay זה. הוא זקוק לזמן כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת O'Bryan בUIC להערכה ניסויית ביקורתית ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11SDG5230003 למרכז GKC והלאומי לקידום מדע Translational - מרכז UIC למדעים קליניים translational גרנט UL1TR000050.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’ s שונה Eagle’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטוק), 100xInvitrogen15070-063
סרום בקר עוברי (FBS)Invitrogen16000-044
נוגדן נגד דגלSigmaM2, F1804
נוגדן נגד HACovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A, T9026
נוגדן נגד GFPClontech632569
צלחות תרבית תאים, תרבית רקמות 6 בארות מטופלותThermo Fisher Scientific130184
תאי HEK 293TATCCCRL-11268
Maxiprep ערכת טיהור פלסמידמהירות גבוהה Qiagen12663
Dulbecco’ s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS), סטרילית 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)Gibco25300
צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן לצביעת FACSBD Biosciences352052
ParaformaldehydeFisher ScientificS74337MF
מגיב נוגד דהייה זהב Prolong עם DAPIInvitrogenP-36931
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-15
Fisherfinest פרימיום כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-548-5P
<חזק>ציוד
CO2 חממה מעטפת אווירNuAIR DH זרימה
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM510 METAקארל זייס, בע"מ
יחידת אלקטרופורזה והעברהBiorad
Cyan ADP זרימה ציטומטרבקמן קולטר
, אוטומטית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles