Method Article

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין שיטות ללימוד אינטראקציה בין חלבונים בתוך תאים, שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא יחסית פשוטה ורגישה. BiFC מבוסס על הייצור של הקרינה באמצעות שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי (ונוס, גרסת חלבון פלואורסצנטי צהובה, משמש כאן). ברי ונוס ללא ניאון (VN והון סיכון) הם התמזגו לשני חלבוני אינטראקציה (במקרה זה, AKAP-LBC וPDE4D3), מניב הקרינה עקב אינטראקציה VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 וההיווצרות של חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי בתוך תאים.

BiFC מספק מידע על לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים ואת כוחו של אינטראקציות חלבון המבוססות על עוצמת הקרינה. עם זאת, ניתוח BiFC באמצעות מיקרוסקופ כדי לכמת את כוחו של האינטראקציה בין חלבונים הוא זמן רב ומעט סובייקטיבית בשל ההטרוגניות בביטוי חלבון ואינטראקציה. על ידי צימוד זרימת cytometricניתוח עם מתודולוגיה BiFC, אות ניאון BiFC האינטראקציה בין חלבונים ניתן למדוד במדויק לכמות גדולה של תאים בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים יישום של מתודולוגיה זו כדי למפות אזורים בPDE4D3 הנדרשים לאינטראקציה עם AKAP-LBC. המתודולוגיה תפוקה גבוהה זה יכול להיות מיושם על גורמים המווסתים את הקרנת האינטראקציה בין חלבונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

650,000 אינטראקציות בין חלבונים מוערכות להתקיים בinteractome האנושי, ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על 1,2 פונקציות רגילה של תא. חוץ משיתוף immunoprecipitation (שיתוף ה-IP), את תקן הזהב ללמוד אינטראקציה בין חלבונים מlysate התא, כמה מבחני שלמת בר חלבון (PCA) פותחו כדי לשפר את הרגישות באיתור חלבונים אינטראקציה בתוך תאים 3. טכניקות כוללות העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג), תהודת העברת אנרגיה פליטת אור (ברט), ושלמת הקרינה bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC מבוסס על עמותת הנחייתם של שני שברי חלבון פלואורסצנטי (כאן אנו משתמשים ונוס; גרסת YFP), כי הם כל התמזגו לשותף חלבון אינטראקציה פוטנציאלי (בדוגמה זו אנו מש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection הסלולרי

  1. פלייט תאי היום לפני transfection, תאי ציפוי פחות עבור immunofluorescence.
    1. לimmunofluorescence: בצלחת, מכסה מחליק זכוכית מעיל 6 גם (1 לכל טוב) עם 0.02% ג'לטין על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות, לשטוף פעם עם מדיום, וגם לכל אחד, צלחת 1 x 10 5 HEK 293T 2 תאים במדיום גידול מ"ל מלא [התקשורת השונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% FBS].
    2. למנתח כתם זרימת cytometric והמ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDE4D3 מבנים (איור 1) AKAP-LBC והיו התמזגו לVN ושברי הון סיכון, בהתאמה. אינטראקציה של PDE4D3 תוצאות תפקודית YFP הקרינה (איור 1 א) AKAP-LBC ו. כאן אנו משתמשים בשיטת BiFC לאתרי AKAP-LBC מחייבים המפה בPDE4D3. אזור נשמרים במעלה הזרם 1 (UCR1), באזור נשמרים במעלה הזרם 2 (UCR2) ואזור קטליטי (CAT) הם נשמרים בין PDE4 חלבוני משפחה, ולכן, באורך מלא (פלורידה), וUCR1 UCR2 תוספת CAT שמשו לסינון אתר הקישור של PDE4D3 לAKAP-LBC. הביטוי של VC-PDE4D3-ברים בתוצאות תא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC הוא שיטה פשוטה ורגישה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. שיטה זו אינה יכולה לשמש כדי לזהות חלבונים אינטראקציות חדשות, לעומת זאת, זה נוח במיוחד כדי לאשר את חלבונים האינטראקציה בתוך תאים וללמוד מאפיינים תפקודיים; כגון לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים, מיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים, ו להקרנה של מולקולות קטנות / פפטידים שיכולים לווסת את האינטראקציה בין חלבונים. בגלל שברי VN והון הסיכון הם לא פלורסנט, הקרינה רקע היא נמוכה, ובכך מסייע לרגישות של assay זה. הוא זקוק לזמן כ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת O'Bryan בUIC להערכה ניסויית ביקורתית ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11SDG5230003 למרכז GKC והלאומי לקידום מדע Translational - מרכז UIC למדעים קליניים translational גרנט UL1TR000050.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’ s שונה Eagle’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטוק), 100xInvitrogen15070-063
סרום בקר עוברי (FBS)Invitrogen16000-044
נוגדן נגד דגלSigmaM2, F1804
נוגדן נגד HACovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A, T9026
נוגדן נגד GFPClontech632569
צלחות תרבית תאים, תרבית רקמות 6 בארות מטופלותThermo Fisher Scientific130184
תאי HEK 293TATCCCRL-11268
Maxiprep ערכת טיהור פלסמידמהירות גבוהה Qiagen12663
Dulbecco’ s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS), סטרילית 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)Gibco25300
צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן לצביעת FACSBD Biosciences352052
ParaformaldehydeFisher ScientificS74337MF
מגיב נוגד דהייה זהב Prolong עם DAPIInvitrogenP-36931
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-15
Fisherfinest פרימיום כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-548-5P
<חזק>ציוד
CO2 חממה מעטפת אווירNuAIR DH זרימה
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM510 METAקארל זייס, בע"מ
יחידת אלקטרופורזה והעברהBiorad
Cyan ADP זרימה ציטומטרבקמן קולטר
, אוטומטית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles