פיתחנו nanovesicles הרומן פנימי רב תכליתי בשם porphysomes, אשר יש מבנה תלוי הקרינה מרווה עצמית ומאפייני photothermal ייחודיים, ובכך פועל סוכני טיפול photothermal חזקים באותה מידה. אנחנו ניסחנו porphysomes באמצעות חול בלחץ גבוה וחקרנו את יעילות טיפול photothermal במודל גידול xenograft.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דקה אחת, אבלציה גידול תת-One-Watt photothermal שימוש Porphysomes, הפנימי משולבת nanovesicles
במאמר זה
סיכום
תקציר
לאחרונה פיתחו porphysomes כnanovesicles מהותי רב תכליתי. פוטוסנסיטייזר, pyropheophorbide α, הייתה מצומדת לפוספוליפידים ולאחר מכן עצמי התאספו לשלפוחית כדורית כמו יפוזום. בשל הצפיפות גבוהה מאוד של פורפירין בbilayer פורפירין שומנים בדם, porphysomes נוצר מקדמים גדולים הכחדה, מרווה עצמית הקרינה מבנה תלוי, ויעילות photothermal מצוינת. בניסוח שלנו, porphysomes היו מסונתז באמצעות חול בלחץ גבוה, ומוצג גודל חלקיקים ממוצע סביב 120 ננומטר. הזרקת עשרים וארבע שעות שלאחר עירוי של porphysomes, הטמפרטורה המקומית של הגידול גדלה מ 30 מעלות צלזיוס ל62 מעלות צלזיוס במהירות עם חשיפת דקה אחת של 750 mW (1.18 W / 2 סנטימטר), 671 הקרנת לייזר ננומטר. בעקבות אבלציה תרמית המלאה של הגידול, eschars נוצר ורפא בתוך 2 שבועות, בעוד שבקבוצת ביקורת הגידולים המשיכו לגדול והגיע לכל מוגדר enנקודת ד תוך 3 שבועות. נתונים אלו מראים כיצד ניתן להשתמש porphysomes כטיפול photothermal חזק סוכנים (PTT).
מבוא
Porphysomes הוא nanovesicles רב תכליתי החדשני שפיתחנו לאחרונה אשר מסוגל הדמיה וטיפול 1 מולטי. הם נוצרים מbilayers פורפירין העצמית התאסף ומכילים צפיפות גבוהה מאוד של פורפירין (מעל 83, 000/porphysome חלקיקים), שיוצרת מקדם הכחדה גדולה ותוצאות במרווה עצמית ייחודית מבנה תלוי הקרינה. יש לי Porphysomes מאפייני vivo הפרמקוקינטי וbiodistribution טובים ב: הם מפגינים מחצית חיים של שעות 12 דם לאחר נטילה שיטתית, ופסיביים להצטבר בגידולי xenograft עם 7.5% מזהה / g ב24 שעות שלאחר הזרקה 2.
המבנה הייחודי שלהם ואת מאפייני physiochemical להפוך porphysome מועמד טוב עבור הדמיה multimodal וטיפול מונחה תמונה. קודם כל, המכיל פורפירין, porphysomes הוא מיסודם מתאים לדימות פלואורסצנטי של גידולים על הצטברות גידול 1.בנוסף, לכל פורפירין אתר יציב לרדיואיזוטופים chelating, אם כן, יכול להיות מתויג porphysomes בקלות עם רדיואיזוטופים כגון 64Cu עבור PET הדמיה 3. יתר על כן, אנרגיית האור נספגה מתפזרת תרמית תחת חשיפת הקרנת לייזר כאשר porphysome מבנה הוא שלמות, ולכן porphysomes גם תערוכת ההדמיה photoacoustic ייחודית ויכולות PTT. הוכח ש24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של porphysomes, הקרנת לייזר של הגידולים שנצבר porphysome מושרה עליית טמפרטורה מהירה ואבלציה גידול photothermal החזקה. זה הוכיח כי porphysomes הוא משפרי photothermal יעילים עם מקדם הכחדה גבוה כמו חלקיקי זהב (AuNPs) 1. מצד השני, בהשוואה לסוכנים אחרים אורגניים photothermal, כוללים AuNPs, porphysomes מראה יתרון בולט בבטיחות ביולוגית בשל האופי האורגני שלהם. Porphysomes הם אנזימים מתכלים ולגרום toxicit החריף מינימאליy בעכברים עם מינונים תוך ורידי גבוהים כמו 1,000 מ"ג / קילוגרם 1. יתר על כן, בדומה ליפוזומים, הליבה המימית הגדולה של porphysomes יכולה להיות פסיבי או נטענת באופן פעיל עם סוכנים טיפוליים או הדמיה. תכונות וההתאמה הביולוגית של porphysomes אופטיים להדגים את פוטנציאל multimodal של חלקיקים אורגניים להדמיה וטיפול biophotonic.
במאמר זה, אנחנו מציגים את שיטת הסינתזה של conjugates pyropheophorbide שומנים בדם, הייצור ושיטת האפיון של porphysomes באמצעות חול בלחץ גבוה. בvivo PTT על עכברים מתנהל כמו גם כדי להדגים את היעילות של PTT מופעל porphysome בגידול טיפול באמצעות מודל גידול xenograft תת עורית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. סינתזה של Pyropheophorbide שומנים בדם
- שלב pyropheophorbide 200 מילימול (שהוכן מספירולינה פסיפיקה אצות כפי שתואר לעיל;... נג et al, Bioconj Chem, 2002 13 -392) 4, 98.7 מ"ג 16:00 lysophophatidylcholine (1-Palmitoyl-2--SN-glycero הידרוקסי -3-phosphocholine, אוואנטי פולאר שומנים # 855,675), 76.3 מ"ג של EDC, 48.7 DMAP מ"ג (4 - (dimethylamino) פירידין) ב 5 מיליליטר amylene התייצב כלורופורם ליחס של 1:1:2:2 Pyro: יפידים: EDC : DMPA.
- מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר תחת ארגון ל24 שעות. להתאדות כלורופורם תחת לחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי עם חימום ל40 ° C. התערובת של איזומרים Pyro שומנים בדם (המצורפים Pyro במיקום SN-1 או SN-2) היא מיוצרת.
- תערובת resuspend Pyro השומנים האיזומר ב1 מ"מ CaCl 2, 50 מ"מ טריס (pH 8), 0.5% טריטון X-100 ומתנול 10% בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר. הוספת A2 פוספוליפאז (PLA2) מארס דבורת דבש ב0.1 ריכוז מ"ג / מיליליטר ו דגירה הפתרון ב37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לעכל SN-1 Pyro שומנים בדם וכדי לייצר את האיזומר Pyro שומנים בדם הטהור SN-2.
- הוסף 2 כרכים נוספים של כלורופורם ו1.25 כרכים של מתנול, לחלץ, ולאחר מכן להסיר את הממס באמצעות אידוי סיבובי בלחץ מופחת ב40 ° C. Resuspend מוצר המחשוף ב1% MeOH בDCM ולטהר על עמודת סיליקה דיאול קטנה עבור Pyro השומנים isomerically הטהור.
2. הכנת Porphysomes
- ממיסים pyropheophorbide שומנים בדם, distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy (פוליאתילן גליקול) (PEG-2000-PE) וכולסטרול בכלורופורם בנפרד, ולהקליט את ריכוזי בהתאמה.
- הכן porphysome סרט שומנים בדם במבחנה 12x75 מ"מ ורוסיליקט עם משקל שומנים כולל של 5 מ"ג / צינור על ידי שילוב של 65% טוחנות פורפירין שומנים בדם, 5% טוחנות PEG-2000-PE וכולסטרול 30% טוחנות.
- ייבש את סרטי שומנים מתחת לזרם של ניטרוגז gen ולתת להם עוד יותר מיובש תחת ואקום במשך שעה 1. אחסן את סרטי שומנים ב-20 מעלות צלזיוס תחת ארגון עד לחות וחול בעתיד.
- להוסיף מלח 1 פוספט מיליליטר סליין (PBS, 150 mM NaCl, 10 פוספט מ"מ, pH 7.4) על צינור אחד סרט שומנים בדם. להקפיא את המבחנה בחנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין, ולאחר מכן להפשיר את הצינור ב65 ° C אמבט מים עד המדגם כולו נמס. מערבולת הצינור עבור סכום כולל של 30 שניות (3x ב10 שניות כל אחד, עם 5 שניות חימום מחדש ב65 ° C אמבט מים בין כל vortexing).
- חזור על ההפשרה ההקפאה למשך 5 מחזורים או יותר על צורך עד ניתן לצפות ללא אגרגטים גדולים בפתרון התייבשות. השאר את ההשעיה porphysome על קרח בסיום.
- להרכיב את מכבש בלחץ גבוה (10 מיליליטר) עם שני 100 מסנני פוליקרבונט ננומטר מוערמים מותקנים פנימה Connect מכבש thermobarrel לסירקולטור thermostatted ל65 ° C במחזור אמבט מים, ולחבר את מערכת מכבש למכל חנקן לנוכחות גבוההאספקה בטוחה.
- מעביר את ההשעיה porphysome לתא מכבש באמצעות פיפטה העברת זכוכית 9 אינץ'. הגדר את הלחץ על ידי סיבוב החוגה ברגולטור מיכל חנקן עד קריאה בין 200 300 psig הוא ציין כמו לחץ שחול ראשוני. פתח את השסתום של וסת הלחץ בהדרגה עד קצב זרימת porphysome מספיק מושגת או שהוא הגיע למקסימום של 800 psig (5,440 kPa) של לחץ.
- לאחר מעבר החול הראשון הושלם, סגור את שסתום בקרת לחץ ולשחרר את הלחץ של מכבש על ידי פתיחת שסתום ההקלה בלחץ על החלק העליון מכבש. למלא את מכבש עם פתרון porphysome הטרי נמתחים, וחזור על החול לפחות 10 פעמים כדי להבטיח את פתרון extruded הסופי הוא הומוגנית.
- קבע את הריכוז של פתרון porphysome הסופי על ידי מדידת הספיגה של דגימה מדוללת במתנול ידי UV-Vis ספקטרומטר. חשב את הריכוז באמצעות שנינות המשוואה הבאותh מקדם הכחדה של 97,000 M -1 cm -1 ב410 ננומטר לpyropheophorbide שומנים בדם.
- למדוד את התפלגות הגודל הסופית של porphysomes באמצעות Malvern Zetasizer ZS90 על ידי פיזור אור דינמי. לדלל פתרון porphysome ב-PBS ולבצע שלוש מדידות עם 15 ריצות כל לתוצאות בממוצע.
- לקבוע את מרווה הקרינה של porphysome ידי השוואת פליטת הקרינה של porphysome הרווה (1 מ"מ בPBS) וporphysome unquenched (1 מ"מ 1% טריטון X-100) באמצעות Spectrofluorometer. קח את הספקטרום לפני ואחרי חומר הניקוי (Tirton X-100) הוא הוסיף, ולנרמל את אות קריאה לקרינה המרבית. הגדר את העירור להיות 410 ננומטר, וטווח אורכי גל פליטה להיות 600-800 ננומטר.
- שמור על פתרון porphysomes תחת ארגון על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש עתידי, ולהגן עליו מפני אור על ידי F אלומיניוםנפט.
3. הכנת בעלי החיים xenograft הדגם
- תרבות תאי KB RPMI-1640 (עם 10% FBS), ולקיים את התאים ב 5% CO 2 ואווירה לחות ב 37 ° C.
- קציר תאי KB באמצעות טכניקת תרבית תאים סטנדרטית. שמור את ההשעיה התא (20,000 תאים / מיליליטר) בופר פוספט (PBS) על קרח לאחסון לטווח קצר עד למועד הזרקה.
- הכן xenografts KB בעכברים בעירום. עכברים בעירום נרכשים מצ'ארלס ריבר מעבדות כאשר הם 20 g (CRL # קטגוריה: נו נו (NCR)-Foxn1, 6-7 שבועות, ישן), ניתנו דיאטה ומצעים (מעבדות הרלן סטנדרטיות; דיאטה: מוקרן LM-485, # 7912; מצעים: מצעי קלח תירס, ¼ ", # 7097). לעקר את כל הכלים טיפול בבעלי החיים (מזרק, מלקחיים, וכרית בעלי חיים) לפני ניסויים. הרדימי עכברים עם 2% v / v isoflurane בגז מוביל 100% חמצן. כל הפרוטוקולים של בעלי החיים מאושרים על ידי המוסד (בריאות Ne האוניברסיטהtwork במקרה זה) ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש.
- הזרק תאים סרטניים תלויים בתת עורי PBS לאגף הימני של עכברים. עכברים הם מוכנים לשימוש לאחר 10 ימים כאשר גידול מגיע לקוטר של 4-5 מ"מ ועובי של 2-3 מ"מ.
4. בvivo photothermal תרפיה
- הזרק porphysomes (המכיל 750 Pyro nmol ב 200 μl נפח) לווריד דרך וריד זנב. לנהל לייזר הקרנת 24 שעות לאחר הזרקה של porphysomes.
- בסעיף זה, לנהל את כל הנהלים בחדר בטיחות לייזר סגור. ללבוש משקפי בטיחות הלייזר במהלך הקרנת לייזר.
- הגדר את ציוד הקרנת לייזר. החזק את סיב הלייזר ומפזר על ידי מהדק על דוכן. הגדר את כוח הלייזר ברמה נמוכה ולהפעיל את הלייזר. התאם את גובה סיב לייזר כדי להשיג את אזור הקרנה של 9 מ"מ קוטר (DPSS לייזר, LaserGlow טכנולוגיות, טורונטו, קנדה), כייל את כוח הלייזר ל750 mW (1.18 W / 2 סנטימטר) באמצעות apower מטר ולאחר מכן לכבות את הלייזר כדי להכין את בעלי החיים.
- להרדים את החיות עם 2% v / v isoflurane בגז מוביל 100% חמצן דרך חרטום אין הדחה ברורה של isoflurane מפגע סיכון בריאות אדם). ודא שבעל החיים הוא מורדם עמוק מספיק על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם מלקחיים או אצבעות לרגליו האחוריות של בעל החיים. בעלי החיים מוכנים להקרנת לייזר כאשר הם מגיבים להליך זה.
- לנטר את טמפרטורת גידול על ידי מצלמת אינפרא אדום תרמית (Mikroshot, LUMASENSE טכנולוגיות). מקם את המצלמה קרובה לגידול, להתמקד בו היטב ולקחת תמונת PTT מראש, כמו גם תמונה לבנה אור רגילה לפני תחילת ההקרנה ווקי טוקי.
- הפעל את הלייזר שוב, ולהגביר את כוח האור כדי 750 mW. מקם את הגידול במרכז קרן לייזר כדי לקבל את הגידול המכוסה במלואן, ולהתחיל עיתוי ההקרנה. קח את תמונת טמפרטורת גידול כל 5 שניות לטיפול לייזר דקה אחת. כבה את הלייזר בדקות 1. סנטאופ אספקת הגז של 2% isoflurane, לחכות עד שיתאושש מן החי מההרדמה והחזירה אותו לכלוב.
- שמור על עכברים בחדר חיה טמפרטורה נורמלי תחת מחזור אור וחושך שעה 00:12 על פי פרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי רשת בריאות באוניברסיטה. הזרק עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם, תת עורי פעמיים ביום במשך שבוע הבא הקרנת הלייזר כדי להפחית את הכאב שנגרם על ידי הצלקת. כל יומיים, למדוד את קוטר הגידול באמצעות קליפר ולקחת תמונה. לחשב את נפח הגידול באמצעות להלן משוואה: V = π / 6 · · ב 2, שבו הוא בקוטר הארוך, ואילו b הוא קצר אחד.
- להקריב את בעלי החיים על ידי לשים אותם בחדר CO 2, כאשר הקוטר של הגידול הארוך מגיע 10 מ"מ, כפי שהוא נקודת הסיום המוגדרת במעבדה שלנו. בצע נקע בצוואר הרחם לאחר טיפול CO2. מגרש את עקומת ההישרדות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Pyropheophorbide הוא מצומדת לפוספוליפידים כמונומר יציב שומנים בדם (איור 1 א) וconjugates העצמי להרכיב כדי ליצור porphysomes על ידי שיטת שחול בממברנה באמצעות מכבש בלחץ גבוה. זה בדרך כלל קשה extrude השעיה porphysome שומנים בדם במהלך 3 המחזורים הראשונים של חול עם קצב זרימה איטי יחסית. ככל שיותר פרופילים חוזרים על עצמם, את קצב הזרימה של פתרון extruded מגדיל בהדרגה, ובלחץ יכול להיות ירידה קלה במידת צורך. גודל Porphysome, ריכוז, ויעילות מרווה הן שלוש תכונות חשובות כדי ל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפיתוח של טכנולוגיות משלוח סמים, חלקיקים רב תכליתיים נמצאים כעת תחת חקירה רחבה למעקב מדויק של רכב משלוח סמים תוך שמירה על מטען סמים גבוה. ליפוזומים טעונים פורפירין פותחו עבור נכסים הפרמקוקינטי טובים יותר ואספקה יעילה יותר מניהול ישיר של פורפירין, אבל מכשולים קיימים, כוללים הכמות מוגבלת טעינה של פורפירין וחלוקים מחדש מהירים של פורפירין מיפוזומים לחלבוני פלזמה 5,6. בניגוד למערכות אספקת liposomal קונבנציונליות, שבו פורפירין בחינם מוכנסים לתוך או הליבה או שומנים בדם bilay...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן הנסיכה מרגרט החולים הלאומי למדע והנדסת מועצת מחקר של קנדה, המכון הקנדי לחקר בריאות, הקרן הקנדית של חדשנות, וג'ואי וטובי טננבאום / ברזילאי כדור יו"ר בחקר סרטן ערמונית, להעניק מקרן מחקר SUNY ותמיכת הפעלה מאוניברסיטת באפלו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מאייד סיבובי | Thermo-Savant | SPD131DDA | |
| Votex | Scientific Industries | SI-0236 | מספר דגם: G560 |
| מכבש בלחץ גבוה | LIPEX, Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 מ"ל מכבש Thermobarrel |
| סירקולטורים לאמבטיה מחוממת (סירקולטור תרמוסטטי) | Thermo SCIENTIFIC | SC100-S5P | |
| מסנני פוליקרבונט | Avanti Polar Lipids | 610005 גודל נקבוביות 100 ננומטר, וקוטר ממברנה 19 מ"מ | |
| Zetasizer | Malvern Instruments | ZS90 | |
| UV / ספקטרופוטומטר גלוי | Varian אוסטרליה | Cary 50 Bio UV / ספקטרופוטומטר | |
| ספקטרופלואורומטר | HORIBA Scientific | FluoroMax-4 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) | היטאצ'י | H-7000 | |
| חממת תרביות תאים | SANYO | MCO-18AIC | |
| מד כוח | Thorlabs | PM100D | עם חיישן S142C |
| 671nm לייזר | טכנולוגיות זוהר | LRS-0671_PFN-02000-05 | S/N:10097270 |
| מדחום אינפרא אדום | Mikroshot, LUMASENSE Technologies | 9102409 | |
| משקפי עיניים מגן לייזר | LaserGlow Technologies | AGF6602XX | צפיפות אופטית: 1.5+ ב-630-700 ננומטר |
מקורות
- Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).
- Lovell, J. F., et al. Enzymatic regioselection for the synthesis and biodegradation of porphysome nanovesicles. Angew Chem Int Ed Engl. 51, 2429-2433 (2012).
- Liu, T. W., MacDonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically Copper-64-Labeled Organic Nanoparticles as Radiotracers. Angewandte Chemie. , (2012).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2, 477-487 (2005).
- Jin, C. S., Zheng, G. Liposomal nanostructures for photosensitizer delivery. Lasers Surg Med. 43, 734-748 (2011).
- Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochim Biophys Acta. 557, 9-23 (1979).
- Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., Brandl, M. Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics. Int J Pharm. 223, 55-68 (2001).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: technologies and analytical applications. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 1, 801-832 (2008).
- Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., Blanchard, G. J. Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore. Langmuir. 23, 11677-11683 (2007).
- Liu, D., Huang, L. Size Homogeneity of a Liposome Preparation is Crucial for Liposome Biodistribution In Vivo. Journal of Liposome Research. 2, 57-66 (1992).
- Zhang, Y., Lovell, J. F. Porphyrins as Theranostic Agents from Prehistoric to Modern Times. Theranostics. 2, 905-915 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
