Method Article

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

DOI:

10.3791/50541

⸱

August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון כמותי של אינטראקציות חלבון חיוני כמעט בכל תחום של מדעי חיים, ובמיוחד גילוי סמים. רוב השיטות הקיימים כיום של נחישות D K דורשים גישה למטוהרי חלבון של עניין, דור אשר יכול להיות זמן רב ויקר. פיתחנו פרוטוקול המאפשר לקביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis microscale (MST) ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. השיטה כרוכה בביטוי יתר של החלבון ה-GFP, התמזגו ותמוגה תא שבאינו denaturing תנאים. יישום השיטה לSTAT3-GFP transiently מתבטא בתאי HEK293 אפשרו לקבוע בפעם הראשונה את הזיקה של גורם השעתוק למד היטב לoligonucleotides עם רצפים שונים. הפרוטוקול הוא פשוט, ויכול להיות מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות קטנות, פפטידים, DNA, RNA, ו-proteins.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון כמותי של זיקה של אינטראקציות מולקולאריים חשוב בתחומים רבים של המחקר ביו. מחייבים ניתוק קבוע (K ד ') הוא חיוני לא רק בגילוי סמים, אבל הוא גם פרמטר חשוב באפיון של כל אינטראקציה בינארי בכל מערכת ביולוגית. שיטות המשמשות לזיהוי ביוכימיים של אינטראקציות בין חלבונים, כגון immunoprecipitation ושמרי מסכי שני היברידיים, לא להודיע ​​לנו על כמה חזק הן אינטראקציות אלה, תוך זיקה מגדירה אם מורכב מסוים זה קיים בתנאים שניתנו in vivo. בתהליך גילוי תרופות, פיתוח assay מחייב הוא אחד ולעתים קרובות יש צורך בצעדים שדורשים זמן רב ביותר. שיטות נפוצות ביותר של נחישות D K כוללות קיטוב הקרינה, טכנולוגית 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת lysate התא

פרוטוקול זה מיועד לתאים חסיד מבטאים כל חלבון ה-GFP-התמזגו. מספר תא צורך יכול לנוע בין נמוכה כמו 10 6 לרבים כמו 20 x 10 6 תאים, תלוי ברמת ביטוי חלבון. לדוגמה, lysate של HEK תאי overexpressing GFP-STAT3 הוכן על ידי טיפול בתאים שגודלו 10 T75 צלוחיות ליד 70% confluency עם מאגר תמוגה 1 מ"ל. עם זאת, lysate הזה היה צריך להיות מדולל של פי 150 על מנת לספק רמה אופטימלית של הקרינה לניסוי MST. פרוטוקול תמוגה תא תלוי בחום על המאפיינים והלוקליזציה תאית של החלבון נחקר. אם אתם משתמשים בחומרי ניקוי אינו רצוי בגלל חוסר יציבות חלבון, sonica....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת הזיקה של חלבון STAT3 הלא phosphorylated מחייב oligonucleotides.

HEK293 תאים לבטא STAT3-GFP שמשו כמקור STAT3 כותרתו fluorescently לassay מחייב ה-DNA. lysates התא הוכן באמצעות Ripa חיץ (20x10 6 תאים / מ"ל). ללימודים מחייבים, את lysates דוללו 150X עם חיץ ה-DNA מחייב MST כדי לספק את הרמה האופטימלית של החלבון פלואורסצנטי בתגובה המחייבת (כ -20 ננומטר). HEK293 תאים ללא transfected היו בשימ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי חלבון וטיהור הוא צעד מייגע ויקר, שהוא, לעומת זאת, יש צורך להגדרה של "אינטראקציות K D על ידי שיטה הנפוצה ביותר כיום. יישום של MST מאפשר הימנעות טיהור חלבון ובכך לפשט באופן משמעותי ומאיץ אפיון כמותי של אינטראקציות. הוא מציג יתרונות משמעותיים במיוחד במקרה של לבטא-קשים ולטהר את חלבונים, כגון חלבונים בממברנה וגורמי שעתוק.

המגבלה העיקרית והדרישה של MST היא היכולת להביע את חלבון כאיחוי עם חלבון פלו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. התוכן של פרסום זה לא בהכרח משקף את הדעות או מדיניות של מחלקת בריאות ושירותי אנוש, ואין אזכור של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מצביע על תמיכה על ידי ממשלת ארה"ב.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן; הסכם המחקר משותף בין NCI וTherapeutics Calidris; האגודה האמריקנית לסרטן מענק IRG 97-152-17 לOT; וכספים פדרליים מ המכון לאומי לסרטן, NIH, תחת HHSN26120080001E החוזה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מאגר RIPAMillipore20-188מאגרים של יצרנים אחרים עובדים גם
מעכבי פרוטאז קוקטיילSigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 מגש נימיNanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 מטופל כסטנדרט נימיםNanoTemper Technologies GmbHK002
NT תוכנת בקרהNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT Analysis softwareNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
צנטריפוגה מקוררת שולחניתEppendorf5417Rצנטריפוגות קירור מיקרו-צינור אחרות המספקות
חלבון LoBind שפופרת 0.5 מ"לEppendorf22431064
כן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

Related Articles