הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50565

⸱

3 בספטמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Translational Hematology & Oncology Research, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University , 3Department of Molecular Biology & Microbiology, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

כדי להדגים הדמיה מולקולרית סרטן MR עם פפטיד קטן ממוקד חומר ניגוד MRI ספציפי לחלבוני פלזמה קרוש בstroma גידול במודל עכבר של סרטן ערמונית.

תקציר

יש מטריצה ​​תאית גידול שפע של חלבוני סרטן הקשורים שיכול לשמש כסמנים ביולוגיים להדמיה מולקולרית בסרטן. בעבודה זו, שהראינו הדמיה מולקולרית יעילה סרטן MR עם פפטיד מולקולרי קטן הממוקד מורכב monoamide האלוקים-DOTA כחומר ניגוד MRI ממוקד ספציפי לחלבוני פלזמה קרוש בstroma גידול. אנחנו ביצענו את הניסוי של הערכה האפקטיביות של הסוכן לגילוי בלתי פולשנית של גידול בערמונית עם MRI במודל של עכברי orthotopic PC-3 סרטן ערמונית. חומר הניגוד הממוקד היה יעיל כדי לייצר שיפור לעומת גידול משמעותי במינון נמוך של 0.03 אלוקים / קילוגרם מילימול. פפטיד ממוקד חומר ניגוד MRI הוא מבטיח להדמיה מולקולרית MR של גידול בערמונית.

מבוא

הדמיה אפקטיבית של מטרות מולקולריות סרטן הקשורים היא בעל חשיבות רבה כדי לשפר את הדיוק של זיהוי סרטן מוקדם ואבחון. דימות תהודה מגנטית (MRI) היא שיטת הדמיה קלינית רבת עוצמה עם רזולוציה מרחבית גבוהה ואין קרינת יינון 1. עם זאת, אין חומר ניגוד ממוקד זמין עבור הדמיה מולקולרית סרטן MR קליני. עיצוב ופיתוח חדשני של סוכנים בניגוד MRI ממוקדים יקדמו באופן משמעותי את היישום של הדמיה מולקולרית סרטן MR. מאמצים משמעותיים נעשו לפתח סוכנים בניגוד ממוקדים על MR הדמיה של הסמנים הביולוגיים לידי ביטוי על פני השטח של תאי סרטן. בשל רגישות נמוכה יחסית של ה-MRI וריכוז נמוך של סמנים אלה, זה אתגר לייצר שיפור לעומת מספיק להדמיה מולקולרית MR היעיל באמצעות סוכנים קטנים מולקולריים ממוקדים ניגוד 2,3. על מנת לקבל שיפור מספיק, מערכות אספקה ​​שונות sucשעות כמו ליפוזומים, חלקיקים וconjugates פולימר עם מטען גבוה של הקב"ה chelates (III) פאראמגנטיים היו מוכנים להגביר את הריכוז מקומי של סוכנים בניגוד לאתרי היעד 4,5. למרות שמערכות אספקה ​​אלה היו מסוגלים להפיק שיפור משמעותי בגידול מודלים של בעלי חיים, במידות הגדולות שלהם הביאו לחיסול איטי ולא שלם מהגוף, וכתוצאה מכך ההצטברות ארוכה הטווח של הקב"ה יונים רעילים (III), שעלול לגרום לבעיות בטיחות חמורות 6. לאחרונה, כמה מחקרים הראו כי המגבלות של ה-MRI להדמיה מולקולרית ניתן להתגבר על ידי בחירת סמנים ביולוגיים מולקולריים הנכונים עם ביטוי מקומי גבוה בנגעים ובאמצעות סוכנים מולקולריים קטנים שיכול להיות מופרש 7,8 בקלות. התכונה המרכזית של חומרים אלה היא שהם יעד סמנים מולקולריים בשפע נוכח ברקמות החולות עם נוכחות קטנה ברקמות נורמליות. ריכוז גבוה של סוכנים בניגוד יכול להיקשר למטרות אלה, וכתוצאה מכך suffiשיפור לעומת cient להדמיה מולקולרית MR יעיל. מאז הגודל שלהם קטן יותר מסף הסינון של הכליות, יכולים בקלות להיות מופרשים סוכנים בניגוד מאוגדים מהגוף עם רעש רקע מופחת. יש לנו נבחרת סמן אוניברסלי הקשורים לסרטן, חלבוני פלזמה קורשים, אשר קיים בשפע בstroma גידול, ורק לעתים נדירות קיימים ברקמות נורמליות 9. אנו מסונתזים חומר ניגוד ממוקד המכיל פפטיד קטן מיקוד CGLIIQKNEC (CLT1), אשר הראה ספציפי חזק מחייב למודל הגידול בערמונית PC3 10, וארבעה chelates monoamide האלוקים-DOTA. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה להדמיה מולקולרית סרטן MR לגילוי גידולים בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול מותאם ממחקר לפני 11.

1. נטיה של הקב"ה-DOTA לCLT1 פפטיד

  1. באמצעות סינתזת פפטיד מוצק שלב סטנדרטי, לסנתז פפטיד CLT1 (CGLIIQKNEC) מחומצות אמינו המוגנים ב-Fmoc על שרף 2-chlorotrityl כלוריד (1.0 מילימול).
  2. לאחר הוספת חומצת אמינו סופית, cyclize פפטיד ליניארי על שרף עם trifluoroacetate תליום (III) (1.09 גרם, 2.0 מילימול, 2 שווה) בDMF (20 מיליליטר) ב 0 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  3. בשלב הבא, המצומד PEG ורצף ליזין לN-הסופית של פפטיד CLT1 (1.0 מילימול) על שרף על ידי מגיב ברצף עם Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 מילימול), Fmoc-ליס (Fmoc)-OH (3.0 מילימול), ומנה שנייה של Fmoc-ליס (Fmoc)-OH (6 מילימול).
  4. הסר Fmoc עם piperidine. הוספת DOTA-טריס (t-BU) (4.58 גרם, 8.0 מילימול, 2 שווה לכל קבוצת אמינו) כדי להגיב עם ארבעה אמינים חופשיים מdendrimer יזין על השרף לשעה 2.
  5. לבסוף, לבקע וdeprotect המוצרמהשרף על ידי טיפול עם קוקטייל של חומצת trifluoroacetic, מים, וtriisobutylsilane (TIS) (20 מיליליטר, 95/2.5/2.5) במשך 8 שעות ב RT. הסר את השרף על ידי סינון ואחרי כביסה עם חומצת trifluoroacetic (TFA). הוסף את filtrates שילוב dropwise לאתר קר אתיל (200 מיליליטר), צנטריפוגות, ולשטוף עם 4x אתר אתיל. ייבש תחת ואקום לתת (ז 1.99, תשואת 61%) חסר צבע מוצק.
  6. לטהר את המוצר הגולמי עם HPLC preparative באמצעות שיפוע של 0-40% B ממס (TFA 0.1% באצטוניטריל) בממס (0.1% תמיסה מימית TFA) עבור 20 דקות ו40-90% B ממס בממס עבור 10 דקות .
  7. ממיסים CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 מ"ג, 0.077 מילימול) במי DI (15 מיליליטר) ולהתאים את ה-pH ל 6 באמצעות 1 M NaOH. מוסיף הקב"ה (OAC) 3 .4 H 2 O (472 מ"ג, 0.462 מילימול, 1.5 שווה לmonoamide DOTA) במנות לפתרון, תוך שמירה על רמת החומציות ב6 באמצעות 1 M NaOH. מערבבים את פתרון התגובה על RT במשך 48 שעות.
  8. מורכב הקב"ה שיורי (III) עם דוארחומצת thylenediaminetetraacetic (EDTA) (מ"ג 90, 0.31 מילימול), ולטהר את המוצר הגולמי עם עמודת הרחקת גודל לתת את המוצר הסופי CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 (169 מ"ג, 57%).

2. אפיון של סוכנים בניגוד

  1. מדוד תוכן האלוקים (III) עם ספקטרוסקופית פליטת פלזמה אופטית מצמידים אינדוקטיבי.
  2. רכישת ספקטרום בסיוע מטריקס לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה (MALDI-TOF) מסה במצב ליניארי עם חומצת 2,5-dihydroxybenzoic (2,5-DHB) כמטריצה.
  3. למדוד זמני הרפיה של התמיסה המימית של הסוכנים בניגוד לCLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 וסוכן שליטת nontargeted sCLT1-DL-(ה'-DOTA) 4 עם ריכוזים שונים ב60 MHz (1.5 T) עם relaxometer ב 37 ° C. השתמש ברצף דופק היפוך התאוששות למדוד T 1 ורצף קאר-פרסל-Meiboom-גיל עם 500 הדים למדוד T 2. חישוב T 1 ו-T 2 relaxivities של הסוכני דואר מהמדרונות של החלקות של 1 / T 1 ו 1 / T 2 לעומת ריכוזי הקב"ה.

3. תא תרבות ופיתוח של בעלי החיים דגם עם גידול Orthotopic PC3 ערמונית

  1. תאי סרטן ערמונית PC3 תרבות עם ביטוי מכונן חלבון ירוק הקרינה (GFP) של במדיום RPMI בתוספת 5% בסרום שור העובר ופניצילין / סטרפטומיצין / fungizone, קציר על ידי trypsinization ו resuspend בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים / μl PBS.
  2. לשמור על עכברי זכרי NIH athymic עירום (4-5 שבועות) במתקן athymic בעלי החיים Core, אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב (CWRU) על פי פרוטוקול של בעלי חיים אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית CWRU.
  3. המשטחים כירורגית רוססו עם פתרון 2% כלורהקסידין ולאחר מכן מכוסה בסדינים סופגים. כפפות מנתחים סטרילית נלבשו במהלך ההליך. לפני הניתוח של בעלי החיים, IP להזריק Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) לanesthetizדואר העכברים. לחלופין, קטמין / xylazine / acepromazine ניתן להשתמש בריכוז של 50/5/1 מ"ג / קילוגרם. משחת עיניים היה מוחל על העכבר כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההרדמה.
  4. להתחיל את הניתוח על ידי חיתוך חתך קטן דרך העור והצפק לאורך קו האמצע התחתון באורך של כ 1 סנטימטר באמצעות אזמל סטרילי. וילון כירורגי סטרילי היה מכוסה סביב אתר החתך במהלך ניתוחי הישרדות.
  5. בעדינות exteriorize ולייצב את האונות הגבי ערמונית לחשוף את הערמונית. הזרק ההשעיה של תאי PC3-GFP ב-PBS (20 μl) לתוך הערמונית בעזרת מחט 30 מד. לבסוף לסגור את החתך עם פצע autoclip 12.
  6. לניטור שלאחר ההליך, לפקח על בעלי חיים פעמיים ביום במשך שבוע 1. סימני המחלה כוללים חוסר האכילה, איסוף שתן כהה סביב שופכה, והליכה לא יציבה שיכול להצביע על זיהום או חסימה של שלפוחית ​​השתן בסיכות.
  7. לאחר 10 ימים, להסיר tהוא סיכות באמצעות מסיר מצרך. לפקח על בעלי החיים מדי יום כדי להעריך את גודל גידול וכל ראיה של כאב, כגון ירידה במשקל, סטיות התנהגותיות וליקויים מוטוריים. להרדים בעלי החיים אשר הראו גודל גידול העולה על המגבלה מוותרת מבחינה אתית או עדות לכאב במהלך גידול.

4. אישור ספציפי מחייב גידול של פפטידים עם דימות פלואורסצנטי והיסטולוגיה

  1. לאחר חיסון תאים סרטניים, מאפשר כ 4 שבועות של גידול לפני תחילת עם ההדמיה. לפני ההזרקה של בדיקות פפטיד, לרכוש תמונות הקרינה GFP עם עכברים חיים בתרמי הקרינה כדי לוודא את הנוכחות של גידול.
  2. Iv להזריק טקסס האדומה שכותרתו פפטידים לנושאת גידול עכברים במינון של 10 nmol / עכבר.
  3. להקריב שעות 2 העכברים מאוחר יותר על ידי נקע בצוואר הרחם, לאסוף את הגידול ואיברים גדולים, ומייד תמונה על תרמי הקרינה. להשתמש במסנני אור ירוקים עבור ה-GFP (עירור: 444-490 ננומטר; פליטה: 515 מסנן ארוך לעבור ננומטר; הגדרות רכישה: 500-720 ב10 צעדים ננומטר) ומסנני אור האדום לטקסס אדומה (עירור: 576-621 ננומטר; פליטה: 635 מסנן ארוך לעבור ננומטר; רכישה הגדרות: 630-800 ב10 צעדים ננומטר). 10 זמן חשיפה אלפיות שני עבור ה-GFP ו150 אלפיות שניים לטקסס אדומה.
  4. מייד לאחר המדידה של הקרינה ברקמות שלמה, לאסוף רקמות גידול, לתקן עם פורמלין, וcryosection לפרוסות 5-מיקרומטר.
  5. לאחר שטיפה עם PBS, הר עם 1 טיפה של מדיום הרכבה המכילה 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), תמונה באופן מיידי בליזר סריקה מיקרוסקופ confocal.

5. הדמיית תהודה מגנטית (MRI)

  1. כ 4 שבועות לאחר חיסון תאים סרטניים, מאפשר הגידולים לגדול עד 0.3-0.6 ס"מ קוטר. השתמש בסורק 7 T-MRI עם תדר רדיו נפח סליל (RF) למחקר MRI.
  2. להרדים את העכבר עם 2% תערובת isoflurane חמצן בתא האינדוקציה isoflurane. Ophהמשחה thalmic הייתה מוחלת על העכבר כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההרדמה.
  3. הכנס מחט 30 מד לתוך צינורות ארוכים 1.0 מ 'מלאים מלוח heparinized. מניחים את הקטטר מתוצרת העצמית בוריד זנב עכבר.
  4. מניחים את העכבר לתוך המגנט ולשמור תחת הרדמה משאיפת עם 1.5% isoflurane חמצן באמצעות חרטומו.
  5. הנח חיישן נשימה מחובר למערכת ניטור על הבטן כדי לפקח על קצב ועומק הנשימה. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ° C על ידי נשיפת אוויר חם לתוך המגנט באמצעות מערכת בקרת משוב.
  6. תתחיל עם תמונות סעיף sagittal תוך שימוש ברצף לוקליזציה לזהות את מיקום הגידול (TR / TE = 200/3.7 אלפיות שני, FOV = 3.0 סנטימטר, עובי פרוס = 2.2 מ"מ, מספר פרוסה = 16, = 2, זווית להעיף ממוצעת = 45 °, מטריצה ​​= 128 x 128).
  7. השתמש ברצף דיכוי T1-משוקלל 2D שיפוע שומן לרכוש תמונות צירי 2D עבור CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msec, FOV = 3.0 סנטימטר x 3.0 סנטימטר, יםעובי כינים = 1.2 מ"מ, מספר פרוסה = 12 = 1, זווית, בממוצע להעיף = 80 °, מטריצה ​​= 128 x 128).
  8. לאחר רכישת תמונת MR בסיס טרום הזרקה, מתחיל להזריק את הסוכן הממוקד או סוכן שליטה במינון של 0.03 מילימול אלוקים / קילוגרם על ידי שטיפה עם 200 μl של תמיסת מלח.
  9. תמשיך לרכוש תמונות CE-MRI בנקודות זמן שונים עד 30 דקות.

6. עיבוד תמונה וניתוח

  1. השתמש בתוכנת הדמיה לניתוח תמונה.
  2. צייר את האזורים של עניין (ROIs) על כל הגידול ואת הכליות במטוס ההדמיה דו ממדי ולמדוד עוצמת אות ממוצעת.
  3. כדי לכמת את נתוני CE-MRI, למדוד גידול או שיפור בכליות ניגוד (ΔSNR) על ידי חישוב של הגידול בהודעת הניגוד-SNR מעל SNR מראש ניגוד באמצעות המשוואה הבאה: ΔSNR = (t S / σ t) - (S 0 / Σ 0), שבו 0 S ו-S לא לציין את האות בקיבהאו או הכליות לפני ואחרי ניגוד לכך, וσ 0 ו t σ הן סטיית התקן של רעש שנמדדה מאוויר הרקע לפני ואחרי הניגוד.
  4. לחשב את ערכי p באמצעות מבחן t שני זנבו של התלמיד, בהנחת מובהקות סטטיסטיות p <0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג סינתזת הסוכן הממוקד ניגוד CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 והתכנית הכוללת של הניסוי של. CLT1-DL-(ה '-DOTA) relaxivity הגבוה הרבה יותר מאשר 4 תוכניות קלינית האלוקים-DOTA (טבלת 1). ב1.5 T, T relaxivity 1 לגדוליניום של CLT1-DL-(ה '-DOTA) 4 ב PBS (pH 7.4) גבוה בכ 3 פעמים יותר מזה של ה'-DOTA 10. הדמיה מאסטרו מאשרת ספציפית החזקה המחייב של טקסס האדומה שכותרתו CLT1 (CLT1-TR) לגידול עם מעט מחייב לאיברים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים

מבחר של סמנים ביולוגיים נכון ומיקוד פפטיד הקטן

לפתח חומר ניגוד ממוקד עם גודל קטן בהצלחה, שתי נקודות מרכזיות צריכים להילקח בחשבון. ראשית, חשוב לבחור סמנים ביולוגיים מולקולריים נכון שהם בשפע נוכח ברקמות חולות עם נוכחות קטנה ברקמות נורמליות. הסמן הביולוגי שלנו נבחר הקשורים לסרטן, חלבוני פלזמה קרוש, עונה על דרישה זו. שנית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי איגוד לב האמריקאי GRA אביב 09 פוסט דוקטורט המלגה (09POST2250268) וNIH R01 CA097465. אנחנו מאוד מעריכים את ד"ר וון לי וד"ר יקאס Gulani לבדיקת MRI בפרוטוקול והתקנה, והגב 'איבון פרקר על סיועה בהשתלת גידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
REAGENTS
Fmoc חומצות אמינו מוגנות EMDChemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu)TCI America
PyBOP, HOBt, HBTUNova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TISSigma-Aldrich Corp.
טקסס אדום, succinimidyl ester, איזומר יחידInvitrogenT20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 HPLC systemAgilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHTcolumn Agilent
ICP-– S Optima 3100XLPerkin-Elmer
MALDI-TOF ספקטרומטר מסהBrukerAutoflexTM Speed
Maestro FLEX In Vivo Imaging SystemCambridge Research Instrumentation, Inc.
סורק MRI Biospec 7TBruker

מקורות

  1. Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
  2. Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
  3. Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
  4. Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
  5. Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
  6. Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
  7. Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
  9. Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
  10. Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
  11. Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
  12. Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
  13. McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
  14. Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MRIGd DOTA Monoamide
MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.