מאמר שיטה

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

14.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50568

⸱

21 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

במאמר זה

סיכום

הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד"א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

תקציר

נגזרי Phenanthrene מתנהגים כמו PARP1 מעכבים חזקים מנעו אשכולות דו מוקדי של centrosomes העודפים בתאים סרטניים אנושיים רב centrosomal במיטוזה. Phenanthridine PJ-34 הייתה המולקולה חזקה ביותר. Declustering של Extra-centrosomes גורם לכישלון mitotic ומוות של תאים בתאים מרובים centrosomal. יש לי הסרטן אנושי מוצק ביותר שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes. הפעילות של PJ-34 תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal של סרטן השד אנושי Live-231-MB מד"א תאי transfected עם וקטורי קידוד עבור γ-טובולין הניאון, שהוא נרחב ביותר בcentrosomes ולניאון הווה H2B ביסטון את הכרומוזומים. הסדרי כרומוזומים חריגים וביטול התקבצו מוקדי γ-טובולין המייצגים centrosomes declustered התגלו במד"א-MB-231 תאי transfected לאחר טיפול עם PJ-34. Un-התקבץ מחוץ לcentrosomes בשני קטבי הכישור קדמו המוות של התאים שלהם. תוצאות אלו מקושרות עבורR בפעם הראשונה את הפעילות ציטוטוקסית הבלעדית זוהתה לאחרונה של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים עם Extra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה, וכישלון mitotic מוביל למוות של תאים. על פי ממצאים קודמים שנצפו על ידי ההדמיה confocal של תאים קבועים, PJ-34 תאים סרטניים להכחיד באופן בלעדי עם Multi-centrosomes מבלי לפגוע בתאים נורמלים עוברים מיטוזה עם שני centrosomes וכישורים דו מוקדי. פעילות ציטוטוקסית זה של PJ-34 לא הייתה שותפים PARP1 מעכבי עוצמה אחרים, ונצפתה בPARP1 extracentrosomes מחסה MEF לקוי, דבר המצביעה העצמאות של PARP1 עיכוב שלה. לחיות הדמיה confocal הציע כלי שימושי לזיהוי מולקולות חדשות להשמיד את התאים במהלך מיטוזה.

מבוא

Phenanthrene נגזר PARP1 מעכבים, כולל PJ-34, שנועד להגן על תאים שקטים ממוות של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי אנרגיה רב PARP1 תיווך-DNA תיקון תחת תנאי לחץ (אוטם שריר הלב או שבץ מוחי) 1. עם זאת, לאחרונה גילה שPJ-34, בריכוז גבוה פי שתיים מזה ישכנע עיכוב PARP1, ניתן אך ורק לגרום למוות של תאים בתאים סרטניים אנושיים 2,3. המהירה יותר ההתפשטות של התא הייתה, יעיל יותר למיגור התאים היה. הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 יוחסה לExtra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה 2. רבים נמל תאי סרטן אנושי multicentrosomes 4,5. דגירה של תאים אנושיים של סרטן שד מד"א-MB-231, אשר נמל centrosomes העודפים, עם 20 מיקרומטר PJ-34 יעילות להכחיד את התאים האלה בתוך 72-96 שעות מבלי לפגוע בתאים שקטים או כמה תאים מתרבים פירים מחסה שני centrosomes במיטוזה 2,3. תאים שפירים כללו תאים אנושיים אפיתל החלב MCF-10, תאי אנדותל אנושיים (HUVEC) ותאי mesenchymal ראשוניים שהוכנו מבלוטת התימוס אנושית. תאים אלה היו עמידים לפעילות ציטוטוקסית של PJ-34. PJ-34 לא התערבו במחזור התא שלהם במהלך הדגירה 96 שעות או להשפיע על היווצרות ציר דו מוקדי 2,3 centrosomes ושלהם.

ההרכבה centrosome דו קוטבית היא קריטית להיווצרות ציר דו קוטבי במיטוזה 4,5. לכן, תאים עם יותר משני centrosomes פיתחו מנגנון מולקולרי הבין בקושי, אשכולות centrosomes נוסף שלהם בשני קטבים 4-9. כישלון של הרכבה דו קוטבית של centrosomes עלול לגרום להפרדת צירים וחריגים כרומוזומים קוטביים מעוותת שמעצרי מחזור התא במעצר G2 / M, ומוביל למוות של תאים המיוחס לכישלון mitotic 4,5. המנגנונים המולקולריים שבבסיס Extra-centrosomes דה אשכולות נחקרים באינטנסיביות 10. הבנת מנגנון המוות הזה תאפשר מיגור בלעדי של תאים סרטניים תוך חוסך 5,10 רקמות בריאות.

לכן, תרכובות המפעילות מות תאי קטסטרופה mitotic מציעות מצב חדש של טיפול בסרטן סלקטיבית, שעשויה להיות יעילה במגוון רחב של תוצאות cancers.Our מוצקות אדם מראה כי הדמיה confocal יכולה לשמש כדי לזהות מולקולות המשפיעות על אשכולות במיוחד בcentrosomes 2,3 מיטוזה, עיבוד תרכובות סרטן אלה מיקוד לתרופות.

אנחנו תעדו את הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 על ידי סריקת תאים קבועים ולחיות עם אדם סרטן (שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes במיטוזה) לעומת תאים נורמלים. צעד אחר צעד התיאור של נהלי ההדמיה המשמשים לזיהוי הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים כלול להלן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרבית תאים

מד"א-MB-231 תאים נרכשו מATCC (אוסף תרבות סוג אמריקאי) ומאוחסנים בחנקן נוזלי.

  1. זרעי 10 6 מד"א-MB-231 תאים בצלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ ב10 מ"ל המכילים בינונית מלא Dulbeco שינוי נשר בינוני (DMEM), 10% סוס בסרום, L-גלוטמין 1%, ו -1% Penstrep-Amphotericine אפשר תאי B. להתרבות לכ 80-100% מפגש.
  2. סור בינוני תרבות מצלחת וזורקים.
  3. שטוף את שכבת התאים לזמן קצר עם (w / v) פתרון טריפסין-EDTA כדי להסיר את כל העקבות של סרום 0.25%.
  4. הוסף 2.0 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לצלחת ולצפות בתאים על ידי מיקרוסקופ ההפוכה עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל תוך 5 עד 15 דקות).
  5. הוסף מדיום גידול מלא 18 מ"ל ולשאוב בעדינות את התאים על ידי פיפטה. מעביר צינור.
  6. צנטריפוגה ההשעיה התא ב1,200 סל"ד.
  7. Re-להשעות תא גלולה ב 24 מ"ל של מ"קlture בינונית.
  8. הוסף 2 מ"ל של השעיה תא 35 מנות מ"מ זכוכית תחתונות (כ -25% מפגש) ומקום בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס).
  9. פתרונות:
    1. בינוני מלא לתאי התפשטות: DMEM עם 10% FBS, אנטיביוטיקה 1% (פתרון העט סטרפטוקוקוס-Ampho 100 יחידות / מיליליטר פניצילין G, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל, 100) ו 2 מ"מ L-גלוטמין.
    2. פתרון טריפסין-EDTA, המכיל 0.25% טריפסין-EDTA.
  10. מנות:
    92 צלחות פטרי בקוטר מ"מ.
    מנות 35 מ"מ קוטר פולי-D-ליזין מצופה זכוכית תחתונה התרבות.

2. הכנת תאים להדמית confocal חיים

  1. זרעי 2 x 10 5 מד"א-MB-231 תאים במנות התרבות תחתיות זכוכית ב2 מ"ל בינוני מלא כאמור בסעיף 1. כאשר תרבית תאים מגיעה לנקודת מפגש של 60-70% (כ 10 5 תאים לכל צלחת 3-4 x), המשך עם transfection.
  2. Transfect התאים עם שני פלסמידים encoding היתוך חלבוני γ-טובולין-GFP (לגילוי ניאון של centrosomes) והיסטון אדום (H2B אדום, לגילוי ניאון של כרומוזומים) באמצעות מגיב transfection liposomal Jet-PI, בעקבות פרוטוקול הייצור. בקצרה, לערבב 2 מיקרוגרם מפלסמיד בצינור עם 100 NaCl μl (150 מ"מ). מערבבים את מגיב transfection (100 μl) עם 100 NaCl μl (150 מ"מ) במבחנה שנייה, ודגירת 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לאחר מכן לשלב את שני פתרונות, לערבב (באמצעות מערבולת קלה) וספין למטה. דגירה במשך 30 דקות ב RT.
  3. במהלך הדגירה של תערובת transfection, לשטוף את תאי פעם עם PBS ולהחליף את המדיום הסלולרי עם 2 מ"ל של DMEM החם ללא תוספים (37 מעלות צלזיוס).
  4. בעדינות להוסיף את תערובת transfection לתאים בDMEM ולאחר מכן להחזיר את התאים לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 8 שעות.
  5. אחרי 8 שעות של דגירה, להחליף DMEM עם 2 מ"ל בינוני מלא ודגירת התאים בחממה במשך 24משאבי אנוש.
  6. 24 שעות לאחר transfection, להחליף את המדיום של התאים עם 2 בינוניות מלא המכיל 20 מ"ל מיקרומטר PJ-34.
  7. דגירה התאים עבור 18 שעות נוספות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  8. נושא התאים לחיות הדמיה confocal לפחות 16 שעות בחדר הדמיה שמירה על התאים ב5% CO 2 ו 37 ° C.
  9. במקביל, יבחן transfection transfection יעילות 36 שעות הודעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדלקמן:
    1. זרעי 2 x 10 5 מד"א-MB-231 תאים בצלחת 6 היטב המכילה coverslip 1 לכל גם ב2 בינוניות מלא מ"ל.
    2. Transfect התאים כאמור בסעיפים 2.2-2.5.
    3. 36 שעות לאחר transfection לתקן את תאי transfected רכובים על coverslip על ידי דגירה במתנול הקר: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C.
    4. לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת coverslip עם התאים רכובים לייבוש במנדף כימי.
    5. החל להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI ולתת הדואר coverslip להתייבש בחושך במשך 6 שעות.
    6. בדוק את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחשב את אחוז תאי transfected (אותות אדומים וירוקים) מהאוכלוסייה של תאים (מכתים-DNA על ידי DAPI). אחוז transfection הרצוי הוא כ 20-40%, כאשר 100-200 תאים נספרים.

3. פרמטרים טכניים של הגדרות סורק ההדמיה confocal חי

  1. ScanMode XYZT; חריר [אוורירי] 1.00; זום 3.5; 8 סיביות רזולוציה; ננומטר לייזר DPSS 561; ארגון, לייזר גלוי 488 ננומטר, לייזר הוא / Ne 633 ננומטר גלוי; מטרת HCX PL APO CS 63x 1.40 UV נפט; מספרי צמצם 1.4; מהירות סריקה 700 הרץ; מדד שבירה 1.52.
  2. מצגת 3-D תמונה הוכנה על ידי Imaris הדמיה תוכנה 7.0.

4. Confocal הדמיה של מיטוזה בתאים קבועים

  1. זרעי 2 x 10 תאי סרטן שד (ATCC), fibroblasts העכבר העוברי הנורמלי (MEF), או PARP1 מד"א-MB-231 חסרים לי 5F (PARP - / -, שהוכן על ידי ד"ר פרנסואז Dantzer) על coverslips זכוכית בצלחת 6 היטב ב2 בינוניות מלא מ"ל. Coverslips נשטפו עם 96% אתנול, בעקבות על ידי שטיפה עם המים DD סטרילי, התייבש במשך שעה 2, והניח בבאר כל צלחת 6 באר.
  2. הוסף PJ-34 (10-30 מיקרומטר) לבינוניות ודגירת התאים לתקופה הנדרשת (HR בדרך כלל עד 96).
  3. שטוף את coverslips פעם עם PBS (בופר פוספט), ולתקן את התאים באמצעות דגירה במתנול קר כקרח: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C.
  4. לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת את coverslips לייבוש במנדף כימי (בשלב זה, יכול להיות כל הזמן את coverslips ב-20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות).
  5. שטוף את coverslips פעם אחת עם PBST (PBS בתוספת 0.1% Tween-20) לpermeabilize את קרום התא ולחסום את התאים עם 10% NDS (רגיל חמור בדם) בPBST ("פתרון חסימה ') במשך שעה 1 ב RT.
  6. דגירה התאים הקבועים permeabilized עם antibodi העיקריes לשעה 2 ב RT (לצירים וcentrosomes מכתים). את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כדלקמן: טובולין אנטי α (1:250 דילול) ואנטי טובולין γ (1:200 דילול). נוגדנים ראשוניים מיושמים כדלקמן: להחיל 100 μl (בירידה) מתערובת של הנוגדנים בחסימת פתרון לכל coverslip על כריכת צלחת 6 היטב (הכיסוי הוא הפוך). בעדינות לשים את coverslip על ירידת הנוגדנים, תאי זרע מול הירידה. דגירה coverslips העומדים בפני הנוגדנים במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר.
  7. הנח את coverslips בחזרה בבארות ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBST. לאחר מכן להשתמש באותו ההליך מתואר ב4.6 עבור תיוג תאים על coverslips עם נוגדנים משני הניאון. דגירה התאים על coverslips עם נוגדנים משני לשעת 1, RT, בחושך. את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כמו בצע: Alexa פלואוריד 488 (1:1,000 דילול; ירוק) ואלקסה פלואוריד 568 (1:1,000 דילול;אדום).
  8. הר את coverslips באמצעות להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI (לצביעת כרומוזומים) ו דגירה הלילה ב RT בחשכה לייבוש.
  9. בדוק את התלושים לכסות על ידי מיקרוסקופיה confocal.

5. כדאיויות תא נמדד על ידי ייצור ה-ATP

ייצור ה-ATP שנמדד על ידי assay ערכת זיהוי ה-ATP זורח.

  1. תאי זרע בצלחת 96 היטב, כ -20,000 תאים בינוניים μl 800 בכל טוב. שלוש בארות ריקות אמורים לשמש לקביעת הארה הרקע של המדיום.
  2. הכן סדרת דילול הסטנדרטית ATP מ כ 10 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר ולשמור על קרח.
  3. הוסף 50 μl של חומר ניקוי לזה היטב ולנער את הצלחת למשך 5 דקות בהקפה ייקרה, 700 סל"ד.
  4. מחדש כל בקבוקון של 'מצע lyophilized' עם 5 מ"ל של "חיץ מצע 'בערכה.
  5. הוסף 50 μl של פתרון המצע המחודש לבארות, ולנערהצלחת למשך 5 דקות על המסלול שייקר, 700 סל"ד.
  6. שמור את הצלחת בחושך במשך 10 דקות.
  7. מדוד luminiscence של כל אחד גם על ידי ELISA microplate קורא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PJ-34 הוא מים יציבים מסיס 1 phenanthridine (איור 1). התוצאות הקודמות שלנו גילו מוות של תאים ודה התקבצו מחוץ לcentrosomes במספר סוגים של תאי סרטן רב centrosomal הקבועים שטופלו בPJ-34. לעומת זאת, תאים מתרבים נורמלים לא היו נפגעים 2,3. Centrosomes זוהה על ידי תיוג כפול עם נוגדנים המכוונים נגד centrine1 וγ-טובולין בתאים במיוחד centrosomal 2 הקבועים.

כאן, הפעילות ציטוט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לחיות ההדמיה confocal סיפק תיעוד בזמן אמת של האפקט הרעיל לתאים של PJ-34 בתאים מרובים centrosomal חיה במהלך מיטוזה (איור 3 ומידע משלים). זה היה התיעוד החי הראשון מייחס cytotoxicity של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים לcentrosomes נוסף דה אשכולות ומוות של תאים, דבר המצביע אינדוקציה של מוות של תאי הקטסטרופה mitotic ידי PJ-34 5-9. בניגוד לכך, באשכולות דו מוקדי של centrosomes סופר numerary נצפו במד"א-MB-231 תאים שלא טופלו חיים העוברים מיטוזה הרגילה עם דו foc...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מקורות מימון של מחקר זה: קרן משותפת של החברה באוניברסיטת תל אביב העברת טכנולוגיה, רמות ומרכז הרפואי שיבא, (מ 'ע"א וע"כ.), ICRF - ישראלי לחקר סרטן בבסיס (מ' ע"א.) וקרן לאומית למדע ( SI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (סרום בקר עוברי)Invitrogen (GIBCO)12657 
פתרון פן-סטרפטוקוסתעשיות ביולוגיות, ישראל03-033-1B 
L-גלוטמיןאינוויטרוגן (GIBCO)25030-024 
0.25% Tripsin-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
צלחות פטרי 92 מ"מNunc,Thermo scientific150350 
כלי תרבית תחתית זכוכית מצופים פולי-D-ליזין 35 מ"מMatTek Corporation, ארה"בP35GC-0-14-C 
ערכת בדיקת זיהוי ATP זוהרAbcamab113849 
NDS (סרום חמור רגיל)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
נוגדן אנטי &אלפא טובוליןSigmaT90261:250 דילול (IF)
נוגדן אנטי &גמא;-טובוליןSigmaT51921:200 דילול (IF)
Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכבר IgGInvitrogenA-110171:1,000 דילול (IF)
Alexa Fluor 568 חמור נגד ארנב IgGInvitrogenA-100421:1,000 דילול (IF)
מגיב אנטי-דהייה ProLong Gold עם DAPI (הרכבה)InvitrogenP36935 
JetPEI (מגיב טרנספקציה ליפוזומלי)פוליפלוס101-10 
EQUIPMENT
מיקרוסקופ קונפוקליLeica (מנהיים, גרמניה)TCS SP5II 

מקורות

  1. Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
  2. Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412(2011).
  3. Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78(2009).
  4. Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
  5. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
  6. Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
  7. Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
  8. Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
  9. Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
  10. Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
  11. Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
  12. Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
  13. Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
  14. Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
  15. Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
  16. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PJ 34centrosomesGamma TubulinHistone H2bPARP1MDA MB 231

מאמרים קשורים