מאמר שיטה

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 בספטמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב2001, חוקרים באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, תאר את בידודה של אוכלוסייה חדשה של תאי גזע בוגרים מרקמת שומן liposuctioned שהם בתחילה כינו את תאי Lipoaspirate מעובד או תאי PLA. מאז, תאי גזע אלה כבר לשנות את שמם כתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs והלכו על מנת להפוך לאחת מאוכלוסיות תאי גזע בוגרים הפופולריות ביותר בתחומי מחקר בתאי גזע ורפואה רגנרטיבית. אלפי מאמרי החברה מתארים את השימוש של ASCs במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים משובי, כוללים התחדשות עצם, תיקון עצב היקפי והנדסת לב וכלי דם. מאמרים אחרונים החלו לתאר את מספר עצום של שימושים לASCs במרפאת. הפרוטוקול שמוצג במאמר זה מתאר את ההליך הבסיסי לידני ואנזימי בידוד ASCs מכמויות גדולות של lipoaspirates מתקבל מהליכים קוסמטיים. פרוטוקול זה בקלות וניתן לשנותם למעלה או למטה כדי accommodאכלתי את עוצמת הקול של lipoaspirate ויכול להיות מותאם לבודד ASCs מרקמת שומן שהושג באמצעות abdominoplasties ונהלים דומים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב2001, אוכלוסייה משוערת של תאי גזע multipotent מרקמת שומן שתוארה בכתב עת הנדסת רקמות 1. תאים אלה ניתנו תאים שם מעובד Lipoaspirate או PLA בשל גזירתם מרקמות lipoaspirate מעובד שהושגו באמצעות ניתוח קוסמטי. שיטת הבידוד המתוארת במאמר זה הייתה מבוסס על אסטרטגיות האנזימטית קיימות לבידוד של החלק של כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן 2. SVF הוגדר כאוכלוסיית עיבוד מינימאלי של תאי דם אדום, fibroblasts, בתאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes מראש adipocytes שעדיין לדבוק במצע רקמת תרבות 2, 3. Culturing של SVF זה לאורך הזמן מוצע לחסל הרבה של אוכלוסיות תאים מזהמים אלה ולגרום לאוכלוסייה חסיד, fibroblastic. fibroblasts אלה זוהה בספרות ל40 השנים האחרונות כמי שמראשadipocytes. עם זאת, קבוצת המחקר שלנו הוכיחה כי תאים אלה ברשות multipotency mesodermal ועל שמם אוכלוסיית SVF חסיד כתאי PLA. מחקרים מאוחרים יותר על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות שהוספתם לפוטנציאל זה, המצביעים על שני endodermal ופוטנציאלי ectodermal (לסקירה ראתה 4). מאז אותה תקופה, תנאים נוספים רבים לתאים אלה הופיעו בספרות. על מנת לספק איזה סוג של קונסנסוס, המונח בתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs אומצה בnd כנס IFATS השנתי 2. ככזה, ASC המונח ישמש במאמר זה.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא הליך פשוט יחסית שדורש ציוד מעבדה סטנדרטי ומשתמש בחומרים כימיים פשוטים כגון שנאגרו מלוח phospho ריאגנטים מדיה תרבות תקן הרקמות וcollagenase. זה יכול לייצר מספר גדול של ASCs בהתאם לכמות של החל שומן לרקמות נפח וג הבאזמן ulture. עם זאת, העיבוד של כמות כה גדולה של רקמת שומן יכול להציג כמה בעיות פיזיות שניתן למתן במידת שימוש בפרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול זה דורש מתקני סטרילי רקמת תרבות וברדסי בטיחות ביולוגיים שאושרו, ובכך מחייב את השימוש במתקן בתרבית רקמה שאושר. דרישה זו יכולה גם להקטין את התועלת של אוכלוסיית ASC ביישומים קליניים, אלא אם כן הם מבודדים בייצור נאות מתקנים מאושרים (GMP) מיועדים לבידוד וההרחבה של חומרים לשימוש קליני. כחלופה, מערכות אוטומטיות שיכול לבודד ASCs במערכת סגורה בחדר הניתוח היינו למנוע בעיה מפתח זה ולאפשר לשימוש המיידי של ASCs ללא כל צורך בהרחבה לאחר מכן במבחנה. נכון להיום, יש שש מערכות אוטומטיות כי הם זמינים מסחריים עבור הבידוד של תאים מהרקמה אנושית. מערכות אלו יכולות לעשות את זה אפשרי לבודדמספר משמעותי של ASCs מכמויות גדולות של רקמת שומן בעקבות הקציר שלה באופן מיידי. ASCs אלה אז יכול להיות מחדש למטופל עבור מגוון רחב של מטרות משובי ללא המטופל שתצטרכנה לעזוב את חדר הניתוח. בנוסף לפרוטוקול זה מתאר את הבידוד הידני של ASCs, פרוטוקול לבידוד אוטומטי של ASCs באמצעות מערכת Celution ניתן גם במאמר נלווה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הבידוד הידני של ASCs מlipoaspirates הושג באמצעות הליכים קוסמטיים באמצעות עיכול אנזימטי וצנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה פורסם לראשונה בכתב עת הנדסת רקמות ב2001 1, שבו התאים וכתוצאה מכך נקראים תאי Lipoaspirate מעובד או תאי PLA בגלל בידודם מlipoaspirates. עם זאת, תא PLA הטווח הוחלף עכשיו עם תאים לטווח נגזר שומן גזע או ASCs לתת תחום כלשהו של קונפורמיות במונחים של מינוח. התאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הוכחו על ידי רבים להחזיק פוטנציאל mesodermal הן במבחנה in vivo (לסקירה ראו 4). בנוסף, פוטנציאל ectodermal וendodermal של ASC יש גם נחקר -4. טכניקת הבידוד היא פשוט וברורה, ודורשת כשעה כדי להשלים. תא וכתוצאה מכךשלהם בתרבית בתנאי תרבית רקמה רגילות. עם זמן תרבות, אוכלוסיית ASC הופכת להיות יותר הומוגנית, מורכב מתאי fibroblastic שלהתרחב בקלות ולהציג את יכולת קיום טוב יותר בטווח הארוך בתרבות.

הערה: החתיכות של ציוד הנדרשים הבאות מופיעות בסוף המאמר זה. יש לעקר כל כלי הזכוכית, כלי התקשורת והחומרים כימיים דרך מעוקר או מסוננת דרך 0.22 מיקרומטר מסננים. צריכה להיות אחרי טכניקות תרבית רקמה אספטיים בכל העת. כדי להבטיח זאת, כל החומרים להציב את ארון הבטיחות הביולוגי צריכים להיות מעוקרים על ידי ריסוס עם תמיסת אתנול 70% ומנגבים במגבות נייר נקיות.

1. לפני הקציר, הכן בעקבות:

  1. תמיסת מלח סטרילית 1X שנאגרו phospho (PBS) לשטיפת lipoaspirates. הכן כ 1 ליטר של 1x PBS לשל lipoaspirate כל 100 מיליליטר. החיטוי PBS וכלow להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. כאופציה, אנטיביוטיקה / antimycotic ניתן להוסיף לריכוז סופי של: 100 IU / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו2.50 מיקרוגרם / amphotericin B מיליליטר פעם אחת PBS התקרר.
  2. .075-.1% סוג סטרילי collagenase IA (מhistolyticum Clostridium) לעיכול אנזימטי של lipoaspirate. ריכוז יהיה תלוי באיכות והמקור של collagenase - כלומר לעומת גולמי מטוהרת. סוגים אחרים collagenase עשויים לשמש (הסוג למשל collagenase II או IV) בריכוזים דומים. הכן ב1x PBS וסינון סטרילי באמצעות מערכת סינון 1,000 מיליליטר עם מסנן 0.22 מיקרומטר (איור 1 א). עם זאת, עשויים לשמש גם בקבוקי זכוכית סטרילית מצוידים במסנן עליון בקבוק. להכין ולהשתמש בטמפרטורת חדר. פתרונות Collagenase עשויים להיות מאוחסנים לטווח הקצר על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. אין להקפיא פתרון collagenase כפי שהוא עשוי להפחית את פעילותה.
  3. סטרילי בקרה בינוני (CM) לאיון collagenase וculturing של אוכלוסיית ASC. ל500 מיליליטר של CM, לשלב הבא: 500 מיליליטר DMEM (גלוקוז 4.5 גר '/ ל', עם L-גלוטמין), 50 מיליליטר סרום שור העובר (חום מומת), 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU פניצילין, 10,000 מיליליטר מיקרוגרם / סטרפטומיצין). כאופציה, 5 מיליליטר amphotericin B (250 amphotericin B מיקרוגרם / מיליליטר) יכול להיות גם הוסיף. סינון סטרילי של המדיה הזו נדרש אם חומרים כימיים שאינם סטרילי משמשים. הנח את CM בדקות 37 ° C אמבט המים 30 לפני השימוש כדי לחמם את המדיום.
  4. כלי זכוכית סטרילית וplasticware לבידוד. החיטוי כוס זכוכית 1,000 מ"ל ולאפשר להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. בנוסף, יש לי plasticware הבא מוכן: טפטפות סרולוגיות בקטריאלית (5 מיליליטר, 10 מיליליטר ו25 מיליליטר), 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, ומנות תרבות שטופלה בתרבית רקמה.

2. בידוד של ASCs מLipoaspirates

רוב lipoaspirates נאספים במכל שאיפה (ראה איור 1) ויכולה להיות מורכב משלוש שכבות נפרדות: 1) שכבה עליונה של נפט בשל תמוגה של adipocytes הבוגרת, 2) שכבה אמצעית של רקמת שומן, ו 3) תחתון, infranatant נוזל המכיל מלח ולזהם סוגי תאים כמו תאי דם אדומים (RBCs). שכבת השמן העליונה לא יכולה להיות נוכחת בכמויות משמעותיות. אם הוא קיים, הוא צריך להישאף כזיהום נפט של תרבות ASC כתוצאה מכך עלול להשפיע על יכולת הקיום של התרבות. Infranatant התחתון צריך להסיר לפני העיבוד כדי למזער את הזיהום של תרבויות ASC עם RBCs. זה ישאיר את האמצע, שכבת רקמת שומן, שלאחר מכן ניתן יהיה לרחוץ ואנזימים מתעכלים לשחרר את החלק שלה סלולארי, סטרומה וסקולרית (SVF).

  1. כביסה lipoaspirate: פתח את מיכל lipoaspirate בשעתי תרבית הרקמהood ולמזוג בזהירות lipoaspirate לתוך כוס זכוכית 1 ליטר סטרילי. לאפשר לשכבות lipoaspirate להפריד עד ששכבת רקמת השומן מופרדת היטב (איור 1).
    1. לשאוב את שכבת הנפט (אם קיימים) באמצעות, פיפטה זכוכית סטרילית וinfranatant המלוחים התחתון באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר. פעולה זו תסיר את הרוב הגדול של זיהום תאי דם אדומים ומלוח.
    2. להעריך את נפח שכבת רקמת שומן וכתוצאה מכך ולהוסיף סטרילי 1x PBS בנפח שווה. מערבבים את לשאוב עם פיפטה משמשת לשאיפה כדי לערבב lipoaspirate עם PBS. לאפשר לשתי השכבות להתיישב. כפי שצוין לעיל, PBS 1x ניתן להשלים עם האנטיביוטיקה / antimycotics.
    3. לשאוב infranatant באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר.
    4. תמשיך לשטוף את שבר רקמת השומן כפי שמתואר בצעדים 2.1.2. ו2.1.3. עד ששכבת השומן יש / צבע זהב צהוב. ה לשאובדואר infranatant בפעם אחרונה, והשאיר את החלק יחסי רקמת השומן בכוס הזכוכית. על מנת להבטיח הסרה מספקת של infranatant, לאפשר לשכבות lipoaspirate להתפשר על 5 דקות לאחר השטיפה האחרונה ולפני השאיפה הסופית.
  2. אנזימתי עיכול של lipoaspirate: הכן פתרון 1A collagenase סטרילי כפי שתואר לעיל ביחידת מסנן. הכן את נפח שווה לזה של חלקיק השומן וסינון סטרילי.
    1. לאחר סינון של פתרון collagenase, לבטל את יחידת המסנן העליונה, יוצק בזהירות את החלק יחסי שומן נשטף לפתרון collagenase והדוק לסגור את הבקבוק.
    2. מניחים את תערובת collagenase / שומן באמבט מים C ° 37 ולעכל ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מערבולת בעדינות את תערובת collagenase / שומן בכל דקות 5-10 ואת המקום בחזרה באמבט המים. שכבת רקמת השומן צריכה לקחת על הופעתו "חלקה" (figurדואר 1B) כתמורה לעיכול. זמני עיכול נוספים (כלומר עד 2 שעות) יכולים לשמש אם שכבת רקמת השומן עדיין נראה שיש חתיכות מוצקות של שומן בתוכו.
  3. בידוד של ASCs: מניח את תערובת collagenase / השומן מתעכל חזרה לתוך ארון הבטיחות הביולוגי. הקפד לחטא את יחידת המסנן עם 70% אתנול לפני הצבת חזרה בארון.
    1. aliquots 25 מיליליטר פיפטה של infranatant מכיל SVF לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר סטרילי.
    2. הוסף 25 מיליליטר של CM לצינור אחד. לאפשר CM כדי להשבית collagenase ידי דוגרים בטמפרטורת חדר בקבינט למשך 5 דקות.
    3. צנטריפוגה 10 דקות ב 1,200 XG כדי לאסוף את SVF כגלולה.
    4. בארון הבטיחות הביולוגי, לשאוב supernatant מצינור אחד. להבטיח את שכבת שמן העליונה וכל adipocytes צפה להישאף עם supernatant זה ( איור 1).
    5. מערבבים את כדורי SVF לתוך צינור צנטריפוגות אחד באמצעות 30 CM מיליליטר ולחלק באופן שווה יותר משני צינורות 50 צנטריפוגות מיליליטר חדשים. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.3. ולשאוב supernatants משני כדורי SVF (לא מוצגים באיור).
      אופציונלי: אם תמוגה RBC היא רצויה, resuspend כל גלולה SVF ב10 מיליליטר של חיץ RBC תמוגה (160 4 Cl מ"מ NH) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.3. ולשאוב supernatants להניב את כדורי SVF (לא מוצגים באיור).
    6. לשלב את שני כדורי SVF לתוך צינור אחד חדש צנטריפוגות באמצעות CM מיליליטר 5-10 (איור 1).
    7. כדי לסנן חלקיקי רקמות גדולים יותר, פיפטה גלולה SVF resuspended על מסנן רשת 100 מיקרומטר ממוקם על גבי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש ולאפשר לסינון על ידי זרימת כוח הכבידה.
    8. aliquots פיפטה של ​​resuspended(ומסונן) גלולה המכילה SVF ASCs על מנות תרבות שטופלו רקמות תרבות. מוסף כל מנה עם נפח מתאים של CM.
    9. תרבות התאים בסנטימטר ל3-4 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ללא שינוי של מדיה.

בעקבות תקופת התרבות ראשונית זה, התקשורת והתרבות עלולה להישאף וכל תאי דם אדומים לזהם להסיר בעדינות על ידי שטיפה עם 1XPBS סטרילי. החלף עם CM ולהמשיך תרבות ASCs לפי צורך. הסוג של מאכל רקמות התרבות השתמש ואיך גלולה SVF resuspended מתחלקת בין מנות אלה יהיו תלוי במספר התאים הרצויים הבאים תרבית רקמה קונבנציונלית.

3. אפיון של אוכלוסיית ASC: בידול cytometry הזרימה וMultilineage

ברגע מבודד, אפיון של אוכלוסיית ASC צריך להתבצע. גישות מקובלות לכך כוללות זרימה ציטומגלווירוסmetry לאפיין את פרופיל אנטיגן CD פני התא של התאים והתמיינות במבחנה כדי לאשר יכולת בידול multilineage. בעוד ניתן להעריך שושלות מרובות בASCs, פרוטוקול זה מתאר את הבידול של ASCs לתוך תאים של adipogenic, osteogenic ושושלות chondrogenic כאמצעי המאשר פוטנציאלי mesodermal multilineage 5.

בבידול רב שושלת מבחנה של ASCs

  1. בידול osteogenic של ASCs: לפני הגיוס, להכין osteogenic בינונית (OM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 25.0 מיליליטר של FBS (.5.0% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / ml וריכוזים סופיים 10,000 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה osteogenic הבאות כדי להעניק לריכוזים מצויינים הסופיים: דקסאמתאזון (0.1 מיקרומטר סופי), L-אסקורבית חומצה 2-פוספט (סופי מיקרומטר 50.0) וβ-glycerophosphate (10.0 מ"מ סופי).
    1. לפני גיוס, קציר וצלחת ASCs התרבותי לתוך צלחת תרבית רקמה הרצויה, כך שconfluency של כ 50% מושגת. לכל מנה ניסיונית מצופה, צלחת מנה נוספת לשליטה אינה מושרה. לילה תרבות בסנטימטר.
      הערה: confluency 50% מומלץ על מנת לאפשר להמשך התפשטות שעלולה להתרחש במהלך האינדוקציה
    2. ביום של אינדוקציה, להסיר הבינוני ולהוסיף את הדברים הבאים: OM לבארות הרצויות osteogenic הניסיוניות וCM לבארות שליטה. נפח התקשורת המשמשת יהיה תלוי בגודל של המנה בתרבית הרקמה. ל12 מנות טובות, 1.0 מיליליטר של מדיה לכל גם הוא מספיק. עבור 6 מנות טובות, 2.0 מיליליטר של תקשורת לכל טוב מספיק. ל100 מנות מ"מ, יש להשתמש 10.0 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת.
    3. תרבות התאים למינימום של 14 ימים עם שינויים של המדיום המתאים כל 3-4בימים. אוכלוסיות ASC מאוד osteogenic עלולות להראות סימנים של בתצהיר מינרלים תאי מוקדם ככל אינדוקציה 7 ימים.
    4. בידול osteogenic (כלומר בתצהיר מינרלים תאי) ניתן לאשר באמצעות כתם היסטולוגית פון Kossa לסידן זרחה. כתם זה יהיה לייצר משקע שחור חום זיהוי הנוכחות של פוספט תאי סידן (ראה איור 2).
      כדי להכתים עם מגיב פון Kossa:
      1. הסר את OM מתאי הניסוי וCM מתאי השליטה
      2. תקן את התאים ל60 דקות בparaformaldehyde 4.0% ערוכים 1x PBS.
      3. שטוף תאים פעמיים עם 1X PBS.
      4. דגירה התאים עם 2.0% כסף חנקה (שהוכנו במים) בחושך במשך 30 דקות.
      5. הסר את הכסף חנקה, לשטוף פעמיים במים מזוקקים ואוויר יבש התאים.
      6. לחשוף את התאים לאור UV במשך 60 דקות לפתח calמשקע פוספט cium.
      7. לשטוף את התאים מספר פעמים עם 1XPBS.
      8. Counterstain התא עם hematoxylin אם רוצה.
  1. בידול Adipogenic של ASCs: לפני הגיוס, להכין Adipogenic בינוני (AM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 50.0 מיליליטר של FBS (10.0% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / מיליליטר ו -10,000 בריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה adipogenic הבאים כדי להעניק לריכוזים הסופיים הצביעו: dexamethasone (1.0 מיקרומטר סופי), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX - 0.5 מ"מ סופי), indomethacin (0.2 מ"מ סופי) ואינסולין (10.0 מיקרומטר סופי ).
    1. לפני גיוס, קציר וצלחת ASCs התרבותי לתוך צלחת תרבית רקמה הרצויה, כך שconfluency של כ 80% מושגת. לכל מנה ניסיונית מצופה, צלחת בנוסףהמנה אל לשליטה שאינה מושרה. . תרבות הלילה בCM הערה: בידול Adipogenic של ASCs מופיע להיות יעיל יותר עם ​​confluency המוגבר.
    2. ביום של גיוס, להסיר את המדיום ולהוסיף את הדברים הבאים: בבוקר עד הבארות הרצויות osteogenic הניסיוניות וCM לבארות שליטה. נפח התקשורת המשמשת יהיה תלוי בגודל של המנה בתרבית הרקמה. ל12 מנות טובות, 1.0.ml של תקשורת לכל טוב מספיק. עבור 6 מנות טובות, 2.0 מיליליטר של מדיה לכל גם הוא מספיק. ל100 מנות מ"מ, יש להשתמש 10.0 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת.
    3. תרבות התאים למינימום של 14 ימים עם שינויים של המדיום המתאים כל 3-4 ימים. אוכלוסיות ASC מאוד adipogenic עשויות להציג סימנים של היווצרות vacuole שומנים בדם כבר באינדוקציה 7 ימים.
    4. ASCs עובר התמיינות adipogenic יפתח וקואולות שומנים רבות שעשויים להיות דמיינו בקלות תחת מיקרוסקופ האור. בנוסף, רשאי בידול adipogenicלהיות מאושר באמצעות כתם היסטולוגית שמן האדום O שיצטבר בתוך וקואולות אלה (ראו איור 2).
      כדי להכתים עם שמן אדום או:
      1. הסר את המדיה מתאי הניסוי וביקורת ולתקן אותם בשביל 60 דקות באמצעות 10% מקבע סידן רשמי. כדי להכין את מקבע את זה, לשלב הבא: מים 1.0 גרם של CaCl 2, 25.0 paraformaldehyde מיליליטר 16% (4.0% סופיים) ו75.0 מיליליטר מזוקק.
      2. לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS.
      3. לשטוף את התאים לזמן קצר עם 70% אתנול.
      4. דגירה התאים בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בתמיסת נפט אדום O. כדי להכין את פתרון שמן האדום O, לפזר אבקת 2.0 גרם שמן האדום O ב50.0 אתנול מיליליטר 70% ו50.0 מיליליטר אצטון.
      5. לשטוף את התאים עם 70% אתנול ולאחר מכן במים ברז.
      6. דמיינו את התאים בקרוב לאחר הצביעה עקב דהייה של הכתמים עם זמן.
  1. בידול Chondrogenic של ASCs: בידול Chondrogenic מושגת באמצעות טכניקה לתרבות בצפיפות גבוהה המכונה "תרבות micromass". לפני התרבות, להכין Chondrogenic בינוני (CHM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 5.0 מיליליטר של FBS (1% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / ml ו10,000 מיקרוגרם / ריכוזי סופי מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה chondrogenic הבאים כדי להעניק לריכוזים הסופיים הצביעו: L-אסקורבית-2-פוספט (50.0 מיקרוגרם / מיליליטר סופי), אינסולין (6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סופי), transferrin (6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) וTGFβ1 (10.0 ng / ml).
    1. קציר ASCs צנטריפוגות למשך 5 דקות ב1,200 XG כדי גלולה תאים. ספירת התאים על מנת לקבוע את הצפיפות של ההשעיה התא.
    2. כדי להכין את כדורי micromass, להכין את שתי השעיות תא: השעיית ניסוי אחד הערוך CHM בצפיפות של 1 x 10 7 תאs / מיליליטר והשעית שליטה אחד שהוכנה בסנטימטר בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר.
      1. הנח 10.0 "טיפות" μl של ההשעיה הסלולרית בבארות בודדות של צלחת רב גם. לאפשר לדבוק ל2-3 שעות על 37 ° C.
      2. בעדינות שכבת הטיפות מצופות או CHM או CM נזהר שלא לנתק את התאים.
      3. תרבות התאים לתקופה של עד 14 ימים בCHM או CM עם שינויים במדיום כל 3-4 ימים. תאים בתרבית בCHM יהיה לדחוס בזמן זה כדי ליצור גלולה micromass בצפיפות גבוהה עם לא מעט תאים בשכבה שמסביב. תאי בקרה בתרבית לא יעברו העיבוי הזה ועוד רבים יימצא כשכבה.
      4. כדי לאשר chondrogenesis, לתקן את כדורים במשך 15 דקות בparaformaldehyde 4.0% (שהוכנו ב 1x PBS) בטמפרטורת חדר. כתם לנוכחות של proteoglycans sulfated באמצעות כתם היסטולוגית הכחול Alcian.
        כדי להכתים באמצעות Alcian הכחול:
        1. שטוף את הרשותכדורים קבוע raformaldehyde פעם אחת ב 1x PBS.
        2. דגירה את כדורים ב0.1 N HCl (pH 1.0) במשך 5 דקות כדי להוריד את ה-pH שלהן.
        3. הסר את HCl ולהוסיף 1% מגיב Alcian הכחול (שהוכן ב0.1 N HCl, pH 1.0). דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
        4. הסר את המגיב הכחול Alcian ולשטוף את כדורים עם 0.1 N HCl (pH 1.0) כדי להסיר את כתם עודף.
        5. שוטף נוסף באמצעות מים ברז עשוי לשמש כדי להפחית מכתים רקע.
        6. כחלופה, כדורי micromass יכולים להיות שנקטפו, קבוע הלילה בפורמלין 10%, משובץ בפרפין והסעיפים מוכתמים עבור Alcian הכחול.

4. תזרים cytometric אפיון ASCs

אפיון פרופיל אנטיגן CD פני התא יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה הקונבנציונלי.

  1. הכנת ASCs עבור cytometry זרימה: לפנילניתוח, להכין Cytometry הצפת Flow (FCB) מורכבות מהפעולות הבאות: ארגון ה-BSA, 1.0% FBS 2.0% וsaponin 0.025% ערוכים 1x PBS.
    1. קציר ASCs וצנטריפוגה התאים 5 דקות ב1,200 XG לייצר גלולה.
    2. Resuspend תאי 1XPBS סטרילי ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. לקבוע את צפיפות התאים של ההשעיה.
    3. מחלקים את ההשעיה עד לaliquots של 5 x 10 5 תאים בסך הכל ו צנטריפוגות לגלולה.
    4. הסר את supernatant PBS ולתקן את התאים ל60 דקות ב -20 מעלות צלזיוס עם עודף של אתנול 70% קרים כקרח. במידת צורך, תאים אלה עשויים להיות מאוחסנים באתנול 70% זה ב-20 ° C במקפיא עד צורך.
    5. בעקבות קיבעון, לשאוב בזהירות ובעדינות אתנול לשטוף את הכדור פעמיים עם עודף של FCB. לשטוף:
      1. הוספת עודף של FCB ועדינות resuspend את הכדור.
      2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,200 XG כדי לאסוף את התאיםגלולה sa.
      3. בזהירות לשאוב supernatant FCB.
      4. חזור על פעולה.
    6. הסר את supernatant לשטוף FCB הסופי מכל aliquot ו resuspend ב של FCB 100 μl. מוסיף את הנוגדן הראשוני fluorochrome מצומדות הרצוי באמצעות הדילול של היצרן הציע. דגירה התאים על קרח עם הנוגדן ל30 דקות.
      הערה: אם נוגדנים ראשוניים fluorochrome מצומדות אינם זמינים, ניתן להשתמש בנוגדנים ראשוניים שאינם מצומדות.
    7. לכל fluorochrome משמש (למשל FITC, PE), דגירה aliquot של תאים עם 100 FCB מיליליטר מכיל IgGs בהתאמה אלוטיפ כביקורת שלילית.
    8. דגירה aliquot אחד ב100 FCB מיליליטר מכיל לא נוגדנים כבקרה נוספת.
    9. לשטוף כל aliquot של תאים פעמיים עם FCB כמפורט בשלב 4.1.5. בעקבות לשטוף האחרון, resuspend aliquots בשל FCB 100 מ"ל ולהמשיך בניתוח תזרים.
      הערה: אם נוגדנים ראשוניים שאינם מצומדות היו בשימוש: לאחר שלב זה לשטוף דגירה aliquots על קרח עבור 20 דקות עם FCB השלים עם הנוגדנים משני fluorochrome מצומדות המתאימים באמצעות הדילול של היצרן הציע. שטוף פעמיים כפי שתואר בשלב 4.1.5.
  2. ניתוח תזרים של ASCs: לניתוח תזרים, מינימום של 10,000 אירועים צריך לספור. יש להשתמש בבקרות בלא כתם ובהתאמה אלוטיפ להגדיר שערים על ידי פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC). לשם כך, יש להשתמש לא שולט נוגדנים (כלומר בלא כתם) של צעד 4.1.8 כדי לחסל פסולת וASCs המת. פקדי IgG בהתאמה אלוטיפ של צעד 4.1.7. יש להשתמש כדי לקבוע אזורים של הקרינה חיובית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתווה הפרוטוקול לעיל מתארת ​​שיטה ידנית, אנזימטיים לבידודה של SVF ממדגם lipoaspirate נפח גדול. בתוך SVF זה הן אוכלוסיות תאים רבות, כוללים ASC. מחקרים רבים מציעים כי culturing SVF זה בתנאי תרבות תקן רקמות יבחר עבור אוכלוסיית פיברובלסטים חסיד עשויה להיות מורכבים בעיקר מסוג ASC. עולה בקנה אחד עם זה, שהראינו, באמצעות cytometry זרימה וimmunofluorescence, שכדורי SVF התרבותיים הפכו למעשה ללא סוגים העיקריים מזהמים תאים, כלומר RBCs, תאי שריר חלק ותאים של שושלת אנדותל 1. אוכלוסי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת שומן לבידודה של ASCs יכולה לבוא בצורות רבות: מחתיכות מוצקות של רקמה המתקבלות באמצעות כריתה או lipoplasty לחתיכות קטנות יותר שהושגו באמצעות שני חילוץ מזרק או lipoplasty בסיוע יניקה (כלומר שאיבת שומן). האם ניתן להשיג יותר תאי SVF (ובכך ASCs) מדגימות שומן resected או להישאף לא ברור מחקרים סותרים הוצגו 16, 17. יתכן כי גם צורה של רקמת שומן היא יותר ממתאים לבידוד של תאים וASCs SVF כל עוד המפעיל הוא בקיא בטכניקת הבידוד שלהם. עם זאת, שאיבת שומן עושה להחזיק יתרון ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסופרים של כתב היד הזה הם שיתוף ממציאים בפטנטים שבבעלות העוצרים של אוניברסיטת קליפורניה ומורשה לTherapeutics Cytori.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות ולהודות לאנשי מחקר נוספים אלה שתרמו לפיתוח של הפרוטוקול המתואר ובידודה של ASCs, ביניהם: ד"ר ה 'פיטר לורנץ, MD, ד"ר הירושי Muzuno, MD, ד"ר ג'רי הואנג, MD , ד"ר האדם כץ, MD, ד"ר ויליאם פוטרל, MD, ד"ר רונג ג'אנג, DDS, PhD, ד"ר לריסה רודריגז, MD, ד"ר Zeni אלפונסו, PhD, וד"ר ג'ון פרייזר, PhD. התוצאות שהוצגו מומנו בחלקו על ידי מענקי מחקר מהמכון הלאומי לבריאות, כולל NIAMS ומכוני NIDCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Reagent
DMEM (Dulbecco’ s שינוי של נשר’ s Medium)Mediatech Cellgro10-013-CVעם 4.5 גרם/מ"ל גלוקוז, L-גלוטמין, סודיום פירובט
פניצילין/סטרפטומיצין,Mediatech Cellgro30-002-CI10,000 יחב"ל/מ"ל פניצילין/10,000 μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין
אמפוטריצין BMediatech Cellgro30-003-CF250 & #956; גר'/מ"ל אמפוטריצין B
10X PBS (מי מלח עם חוצץ פוספו)MediatechCellgro25-053-CIללא סידן, ללא מגנזיום
טריפסין/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0.25% טריפסין/2.21 מ"מ EDTA
קולגנאז מסוג IA (מ-Clostridium histolyticum)SigmaC2674; 125 יחידות עיכול קולגן/מ"ג מוצק
FBS (סרום בקר עוברי) מומתבחום Gemini Bioproducts100106ממקור USDA, מומת בחום
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותGenesee Scientific12-104
25 מ"ל פיפטות סרולוגיותGenesee Scientific12-106
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליפרופילןGenesee Scientific21-106
כלי תרבית רקמות 100 מ"מGenesee Scientific25-202
150 מ"מ כלי תרבית רקמותGenesee Scientific25-203
500 מ"ל יחידות סינון StericupMilliporeSCGPU05REקרום PES, 0.22 & #956; m נקבוביות
מסנני תאיםFisherBrand22-363-549100 & #956; m ניילון רשת
דקסמתזון - מסיס במיםסיגמאD-2915
L-חומצה אסקורבית 2 פוספטסיגמאA-8960
β-גליצרופוספט מלח דיסודיום סיגמאG-9422הידוע גם בשם אינסולין גליצרופוספט
סיגמאI-6634עשוי מלבלב בקר
אינדומתציןסיגמאI-7378
apo-transferrinSigmaT-4382
TGFβ 1מו"פ D Systems240-B-002שמן אנושי רקומביננטי
אדום OSigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
כסף חנקתיSigmaS-0319
חומצה הידרוכלוריתFisher ScientificA144
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4מסופק כמלאי
[כותרת]
<חזק>דרוש ציוד
Class II A/B מכסה מנוע בטיחות ביולוגיתThermo Scientificלהבטיח שלמכסה המנוע יש קווי ואקום לשאיפה
צנטריפוגה ספסליתHermle LabnetZ383רוטור מתנדנד לצינורות 50 מ"ל נדרשים, מסוגל לאמבט מים 1200xg
Fisher Scientific IsotempS52602Qקיבולת 5-10 ליטר, מסוגל 37C
עזרי פיפטה אוטומטייםDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2 אינקובטורThermo ScientificForma 310חום ישיר או מעטפת מים
תכשיר גולמי של 16%

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים