במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

Summary

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי פליטה רכשו בו זמנית, רצפי תמונת pseudocolored מיוצרים.

Abstract

מיקרוסקופיה immunofluorescence צבע רב כדי לזהות מולקולות ספציפיות בקרום התא יכולה להיות בשילוב עם מבחני זרימת צלחת קאמריים במקביל לחקור את המנגנונים המסדירים את הידבקות תא בתנאי זרימה דינמיות. לדוגמא, ניתן perfused תאים הסרטניים שכותרתו עם fluorophores מרובה על פני מצע שעלול להיות תגובתי למודל מנגנונים של גרורות סרטניות. עם זאת, מערכות מצלמה אחת מרובה ערוצים ומצלמות צבע חסרונות תערוכה ברכישת תמונה לניתוח תא חי בזמן אמת. כדי להתגבר על המגבלות האלה, השתמשנו מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה כדי ללכוד בו זמנית רצפי תמונה בזמן אמת של תאים שכותרתו fluorescently בתא הזרימה. אורך גל מסנן מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה מוגדר נע לשתי מצלמות CCD בצבע אחד, ובכך בו זמנית ללכוד שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי. בהמשך לכך, תמונות אחד ערוצי psuedocolored משולבות לתוך אחדזמן אמת התמזג רצף שיכול לחשוף מולקולות מטרה מרובות בתאים עוברים במהירות על פני אזור של עניין.

Introduction

שיטות לניתוח של מולקולות על פני התא, כגון immunostaining, להעסיק בדיקות הכימיות מצומדת לfluorophores, המאפשרים זיהוי של מולקולות מטרה. הדמיה תא חי ומבחני הידבקות תא המבוסס על זרימה הידרודינמית נרשמים בדרך כלל עם מצלמות CCD מונוכרום נועדו ללכוד תהליכים פיסיולוגיים ברמה התאית ו / או מולקולרית ^{1, 2.} מצלמות אלה הן מאוד רגישות, לספק שיעורים מהר מסגרת (יותר מ 30 פריימים לשניה), ולספק פתרון זמני חריג (עקב שיעורים מהר מסגרת וזמני חשיפה קצרה). עם זאת, מצלמות מונוכרום יכולות רק ללכוד ערוץ פליטה בודד (גילוי fluorophore יחיד) כדי לאסוף את התמונות. ניתן לשלב מערכות פיצול פליטת מצלמה אחת כדי ללכוד ערוצי פליטה מרובים, אך לעתים קרובות לצמצם את שדה הראייה ודורשות באותו זמן חשיפה להדמיה את כל הערוצים. כדי ללכוד את קשת צבעים מלאים מהתאים שכותרתו עם multiple fluorophores, מצלמה צבע יכולה לשמש כחלופה. עם זאת, מצלמות צבע הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק הרזולוציה של הזמן רצוי להדמית תא חי ביישומים מסוימים. מכשיר הדמיה נוסף נחוץ ליישומים בהם יש יתרון לתאי חי תמונה באורכי גל מרובה תוך שמירה על רזולוציה גבוהה זמנית. יישום ניסיוני ראש הוא assay המקביל תזרים צלחת קאמרי ההידבקות, שבו תאים הם perfused בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית על מצע פוטנציאלי תגובתי ^{1, 3.} תאים בזרימה המבטאים את המולקולות בתא שטח ספציפיות עשויים לדבוק ומתגלגלים על המצע, כגון monolayer תא לבטא מולקולות הדבקות או חלבונים adsorbed משטח תאיים מטריקס ^{4, 5.} תאים מתגלגלים עשויים לעבור תנועה סיבובית וtranslational בחלקיקים שניים. תכונות מולקולריות במתגלגלים ותאים חסיד, כגון צבירים של מולקולות בתא שטח, יש גם potentiאל לעבור ארגון מחדש פעיל על פני התא. לכן, מערכות הדמיה חייבות לספק פתרון זמני חריג (30 פריימים לשניה ומעלה ו" קרובים לאפס "זמני חשיפה) כדי ליצור רצף תמונה הממחיש את התקדמות צעד אחר צעד של התא מתגלגל ^{6, 7.} מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה הן מסוגלים לעמוד בדרישות אלה לתאי הדמיה שכותרתו עם fluorophores מרובה.

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה לפצל וערוצי הקרינה מסנן לשתי מצלמות דומות כדי ללכוד בו זמנית שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי תוך שמירה על השדה המלא של תצוגה. טכנולוגיה זו מאפשרת השוואה ישירה של התמונה שצולמה בזמן אמת בכל ערוץ ומאפשרת למשתמש לעבור במהירות בין דגמי מצלמות עם יכולות הדמיה שונות. תכונה זו שימושית לביצוע התאמות להגדרות לכידת תמונה במצלמה אחת שטוב יותר לאפשר למערכת כדי ללכודfluorophores עם עוצמות שונות, תקופות חיים, ומקדמי הכחדה ^8. יחד עם תוכנת הדמיה, מערכות פיצול כפולה מצלמה פליטה מאפשרות הקלטה של מבחני הדמיה תא חיים באורכי גל מרובים בזמן אמת ועשויות לשפר את מבחני במבחנה המשתמשים בקרינה כדי ללמוד על התנהגות תא.

Protocol

1. התקנת תוכנה

1. לרכוש StreamPix 5 תוכנת Multi-מצלמה עם מודול SimulPix או תוכנת הדמיה אחרת מסוגל איסוף ושילוב של תמונות שנתפסו על ידי מצלמות CCD מונוכרום.
2. דרישות מינימום עבור StreamPix 5 כוללות: מחשב מצויד בCore 2 Duo עם 2.4 GHz או יותר טוב עם GB זיכרון RAM 2 ומעלה. מצלמה נתמכת IEEE דיגיטלי או אנלוגית ולוכד תמונות תואמות. Windows XP/7/Vista 32 או 64 קצת. צג תומך ברזולוציה 1,024 x 768 ומעלה. מתאם גרפי עם ביצועים טובים 2D (יחידת פשע מאורגן להביע 16x או יותר מומלץ) וכונן דיסק קשיח 7,200 סל"ד להקלטה בתצורת RAID-O.

2. התקנה של מערכת מצלמה כפולה מסוגלים שתי הדמיה בזמן אמת הצבע סימולטני

1. חבר את מפצל DC2 Photometrics פליטה, או התקן פיצול פליטת מצלמה כפולה דומה, למיקרוסקופ על ידי הזזה מתאם DC2 C-Mount ליציאת וידאו של MICRoscope כך שהדיור של dichroic במכשיר הוא נגיש.
2. הכנס את שתי מצלמות CCD מונוכרום לתוך C-mount 1 נקבה והנקבה C-mount 2. מצלמות זהות עדיפות. ניתן להשתמש במצלמות דומות, אבל התאימות תלויה בחומרה פנימית, והכי חשוב חיישן CCD התמונה.
3. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות משתי המצלמות. השלבים הבאים (2.3.1 - 2.3.4) יחולו על StreamPix 5 עם מודול SimulPix וצריכים להיות מותאמים לתוכנת הדמיה מרובה מצלמה אחרת.
   1. StreamPix פתוח 5 ובחר "סביבת עבודה" בסרט המשימה.
   2. "מנהל סביבת עבודה" פתוח הממוקם בקצה הימני של המסך, ובחר באפשרות "סביבת עבודה חדשה".
   3. לאחר מתן שם מצלמה, בצע את התוכנה תבקש ממך לבחור חוטף מרשימה מולאה מראש. בחר את חוטף דגם המצלמה התאמה ולחזור לסביבת העבודה של המצלמה השנייה. לסביבת העבודה הממוזגת, חוזרים פעם נוספת, אבל "כל המצלמות נמצאות בשימוש" מ 'שגיאהessage יופיע. הודעה זו היא נורמלית.
   4. ברגע שסביבת העבודה הממוזגת נטענת, להקצות מצלמות מסביבת העבודה וסביבת העבודה של 1 2 לסביבת העבודה הממוזגת בפנל העגינה הממוקם בצד הימני של מסך הצפייה.
4. יישר מצלמות במערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה.
   1. יישר מצלמות בשדה בהיר או ניגוד שלב עם רשת הכיול המסופקת על ידי היצרן באמצעות מטרת PlanApo 40X (או יותר).
   2. שלח אור לעיניות המיקרוסקופ, הנח את רשת הכיול מצופה המתכת שסופקה על ידי היצרן על הבמה מיקרוסקופ, ולרבע את הרשת על הבמה מיקרוסקופ.
   3. להביא את הרשת אל מוקד.
   4. לעקור, אבל לא להסיר, דיור dichroic ליישר מצלמה 1 (עוקפת מצלמה). להציג את הרשת ללא binning וללא autoscaling. למקד את התמונה באמצעות חיוג התאמת התמקדות ביציאת C-Mount 1.
   5. דחוף את דיור dichroic לchanne הכפולמכשיר רכישת ליטר באופן מלא, כך שהתמונה מחולקת על ידי dichroic לשתי המצלמות.
   6. שחרר את שלושה 5/64 "להגדיר ברגים ולסובב את המצלמה השנייה על C-mount 2 הנקבה עד הנטייה של הרשת היא זהה בשתי התמונות. באמצעות חיוג התאמת דגש על C-mount נמל 2, להביא את התמונה ממצלמה 2 אל מוקד.
   7. לסיים את היישור באמצעות התמונה המשולבת בסביבת העבודה הממוזגת של תוכנת ההדמיה. זה מאפשר לראות שכבת pseudocolor זמן אמת של שתי התמונות של רשת הכיול. התאם את עמדות תמונה המשולבות רק באמצעות ידית R / L בצד ימין של DC2. התאם כפתור זה עד גבול אנכי ימין / שמאל של התמונות מיושרת במדויק.
   8. השתמש בכפתור U / D כדי להתאים את למעלה / למטה היישור של התמונה השנייה ועד לברי רשת אופקיים מיושרים כמו שצריך.
   9. אם במהלך למעלה / למטה יישור סיבוב מצלמה קל מתרחש בעיה, נכונה זו על ידי שחרור שלושה 5/64 scre אינץ "ws למצלמה 2 ולסובב עד שהתמונה המוצגות מיושרת כהלכה.

3. הכנת תאי הסרטן לפלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay

1. 20-BT תאי סרטן שד תרבות במדיום המינימום הכרחי (MEM) בתוספת להשלמת בינונית עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס ו.5.0% CO ₂ תיארו ² כמו בעבר.
2. תאים סרטניים קציר עם טיפול טריפסין לדלל ולספור תאים עם hemocytometer.
3. לשטוף ולהשעות את התאים ב10 ⁷ תאים / מיליליטר באלבומין 0.1% מסרום שור (BSA) בDPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS +).
4. מדולל נוגדנים ראשוניים, CD24 אנטי אנושי בעכבר וחולדה מטוהר מטוהרת HECA-452 (אנטיגנים אנטי sialofucosylated), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות ^{9, 10.}
5. תאי צנטריפוגה ב 1,200 סל"ד להשיג תא גלולה. ASPIלדרג נוגדן ראשוני, ולשטוף את התאים פעמיים עם 0.1% DBPS + BSA.
6. מדולל נוגדנים משני, עז אנטי העכבר IgG AlexaFluor 568 (פליטת מקסימום, 603 ננומטר), ועז אנטי עכברוש IgM AlexaFluor 488 (פליטת מקסימום, 519 ננומטר), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות.
7. שטוף תאי פעמיים ולהשעות ב0.1% DPBS + BSA ב10 ⁶ תאים / מיליליטר ב0.1% DPBS + BSA.

4. הכנת התשתית לתגובתי פלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay

1. חבר את שני אורכים נפרדים של צינורות ליציאות הכניסה ויציאה של זרימת צלחת התא המקביל שמתאים בתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. צינור אחד יתחבר למאגר של תאים שכותרתו תלויים ב0.1% DPBS + BSA והשני למשאבת המזרק, שייסוג נוזל בקצב זרימה שצוין.
2. חבר קו ואקום לתא הזרימה ^1.
3. מקם את תא הזרימה מעל di תרבית רקמת 35 מ"מsh מכיל monolayer של תאי השחלה אוגר הסיני מביע E-selectin (CHO-E). תאי CHO-E היו גדלו במדיום שלם MEM ב 37 ° C ו-CO ₂ .5.0% ^2.
4. התאם את תא הזרימה ו / או אטם תא זרימה כדי להבטיח חותם ואקום נאות ^1.
5. לסגת נוזל ממאגר, ניטור ההרכבה תא זרימה לחותם תקין ואין עדות חזותית של היווצרות בועת אוויר ^1.
6. הנח קאמרי הרכבה זרימה במיקרוסקופ (לייקה DMI 6000B) ^1.

5. רכישת תמונה בשני צבעים

1. כוח מקור לייקה EL-6000 אור הקומפקטי, או מכשיר דומה, כדי להפיק אור בעוצמה גבוה וזוג אותו לתוך ספר אור. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי להעביר את האור הזה דרך קוביית מסנן שילוב, כלומר קוביית מסנן G / R (ירוק / אדום), כדי לעורר fluorophores של צבע / עוצמה רצויה.
2. הבטחת דיור dichroic נמצא במצב הפעלה נכון (מדוכא) והוא לא במצב עוקף.
3. פועל מיקרוסקופ במצב הקרינה ובחר קובייה תקינה מסנן הקרינה (ירוק / אדום).
4. קבע את זמן החשיפה ולהשיג במצלמת 1 (אדום; 620 ± 60 ננומטר) ומצלמת 2 (ירוק; 535 ± 40 ננומטר).
   1. לדכא את dichroic כדי להשיג תמונות בשני ערוצי הפליטה האדומים וירוקים. השתמש assay תא זרימה עם תאים שכותרתו עם fluorophore האדום בלבד, ולקבל תמונה במסלול האדום על ידי התאמת זמן החשיפה של המצלמה 1 ב" הגדרות חיות "של תוכנת ההדמיה.
   2. התאם את זמן החשיפה של מצלמה 2 לזמן החשיפה של המצלמה 1. אם תמונה שנצפתה בערוץ הירוק, חפצים לדמם דרכם בהווה ובזמן חשיפה בשתי המצלמות צריך להיות מופחת.
   3. שמירה על זמן החשיפה מקביל במצלמה 1 ומצלמת 2, לצמצם את זמן החשיפה עד החפץ לדמם דרך הוא כבר לא נראה לעין במסלול הירוק. התאם את הרווח של המצלמה 1 כדי לשפר visibilit תמונהy במסלול האדום במידת צורך.
   4. חזור על השלבים 5.4.1 - 5.4.3 עם תאים שכותרתו עם fluorophore הירוק בלבד, אך מגדיר את זמן חשיפה במצלמה 2 תאי תמונה במסלול הירוק בלי חפצים לדמם דרך במסלול האדום שנאסף על ידי מצלמה 1.
   5. נוגדני Retitrate אם לא ניתן למנוע חפצים לדמם דרך ^11, או אם זמני חשיפה של מצלמה 1 ומצלמת 2 שונים באופן מהותי כך שהתמזגו תמונות עשויות להיות temporally מתואמים.
5. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות שנתפסו בו זמנית משתי מצלמות CCD מונוכרום בניסוי תא זרימה.
6. מיזוג תמונות שנאספו משני המצלמות משתמשים במודול SimulPix של Streampix 5 או חבילת תוכנה חלופית.
7. השתמש בהתאמות תיקון דיגיטליות בSimulPix או תוכנה חלופית כדי ליישר מרחבית תמונות הממוזגות, במידת צורך. ניתן לתקן תמונות עם מודול SimulPix לאופקי, אנכי, והתאמות סיבוב.

Results

Assay הידבקות זרימת צלחת קאמרית במקביל היה בשימוש כדי להדגים מערכת כפולה פליטת המצלמה פיצול שבו זמנית נתפסה רצפי תמונה בזמן אמת בשני ערוצי פליטה (איור 1). מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה זוהתה 20-BT תאים שכותרתו fluorescently עם CD24 אנטי אנושי וHECA-452 (גילוי אנטיגנים sialofucosylated) נוגדנים חד שבטיים ונוגדנים משני מתאימים (איור 2). כמה תאים מתגלגלים מוצג אותות אדומים (CD24) עדיין בלתי ניתן לגילוי אותות ירוקים (HECA-452), אחרים מוצגים אותות ...

Discussion

מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה יש הרזולוציה מרחבית, זמנית, ואופטית הדרושות כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהות ביישומים שבם תא או תנועה מולקולרית הוא מהיר. ביצירת תוצאות הנציג, פרמטרים במערכת הכפולה פליטת המצלמה הפיצול, כולל הגדרות תוכנה והגדרות מצלמה, היו מותאמים כדי להשיג רצף תמונה ממוזג שבו מתגלגל ותאים חסיד היו מרחב ובזמן מיושר. צעד אופטימיזציה זו הוא קריטי, כמו חוסר יכול לגרום לתמונות שלא להעביר כראוי את התופעה הפיסית תחת חקירה, למשל תא בודד שנצפה לגלגל בשני הערוצים הי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E	מתנה מד"ר ר. סקשטיין (Brigham and Women' בית החולים, בית הספר לרפואה של הרווארד)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
פניצילין-סטרפטומיצין	Thermo Scientific	SV30010
0.25% טריפסין / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 נוגדן חד שבטי	BD Biosciences	555946
נוגדן חד שבטי CD24 אנטי אנושי	BD Biosciences	555426
נגד חולדות IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
<חזק>ציוד
EXi מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כחולה מצלמת CCD דיגיטלית	Q הדמיה	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 מצלמת CCD דיגיטלית	Q הדמיה	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 פוטומטריה מפצל פליטה		DC2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 תוכנה	Norpix