הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50612

⸱

4 בספטמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering, McGill University, 2Montreal Heart Institute

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לpermeabilization הזמני של תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת ההעברה של חומר וביומולקולות גנטיים לתאי יונקים חסיד על ידי הניצול של כוחות מכאניים כדי לשבש את קרום הפלזמה.

תקציר

טכניקות transfection התא שונות קיימות ואלה יכולים להיות מחולקים לשלוש קטגוריות רחבות: ויראלי, כימי ומכאני. פרוטוקול זה מתאר שיטה מכאנית לpermeabilize temporally תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי שיכול להקל על העברת בדרך כלל מקרומולקולות שאינן חדירות לתאים. אנו מאמינים כי טכניקה זו עובדת על ידי הקניית כוחות גזירה על קרום הפלזמה של תאים חסיד, וכתוצאה מכך היווצרות הזמנית של micropores. ברגע שהנקבוביות הללו נוצרו, התאים ולאחר מכן חדירים לחומר גנטי וביומולקולות אחרת. הכוחות מכאניים המעורבים אין להפעיל את הסיכון של תאים באופן קבוע מזיקים או ניתוק מהמצע שלהם. יש, אם כן, טווח צר של דינמיקת גז אינרטי בי הטכניקה היא יעילה. סילון גז אינרטי הוכיח יעיל בpermeabilizing שורות תאים חסיד שונות, כולל הלה, HEK293 ותאי האנדותל של אב העורקים בבטן אנושי. פרוטוקול זה הוא מתאים לעמermeabilization של תאים חסיד הן במבחנה, כפי שכבר הוכיחו, in vivo, מראה שהוא עשוי לשמש למחקר ופוטנציאלי ביישומים קליניים בעתיד. כמו כן, יש את היתרון של permeabilizing תאים בצורה מרחבית מגבילה, אשר יכול להוכיח להיות כלי מחקר חשוב.

מבוא

עם ההתפתחות של ביו וההבנה של מכניקת תא, המשלוח של ביומולקולות לתוך תאים הפך להיות חיוני לתחומי מחקר רבים וטיפולים רפואיים. טכניקות שונות פותחו כדי להציג את המולקולות זרות דרך קרום הפלזמה ולתוך cytosol התא. יכולים בדרך כלל להיות מסווגים אלה כמו גם: טכניקות ויראלי, כימיים או מכאניות. טכניקות ויראלי יכולות transfect חומר גנטי כמו רנ"א ודנ"א באמצעות וקטורים ויראליים 1. טכניקות ויראלי נוטות להיות בעלי יעילות גבוהה בשורות תאים מסוימות, עם זאת יש להם את הפוטנציאל לתגובות חיסוניים ודלקתיות 2 הם. שיטות transfection הכימי נפוצות כוללות משקעים סידן פוספט 3, exotoxins חיידקי 4 וlipofection 5. טכניקות אלו הוכחו כיעילים, אך בעיות מסוימות מתעוררות כגון רעיל לתא ושאינו ספציפי. יתר על כן, בטכניקות כגון פוספט סידןממטרים דואר כבר נמצאו יעילות transfection עד 70% אלא רק בשורות תאים מסוימות, רק לעתים נדירות בתאים ראשוניים 6. זה ראוי לציון כמו מאמצי מחקר הגדלת מתבצעים הכניסו לתוך תאים ראשוניים, במיוחד במקרה של עיצוב טיפולים שונים לשימוש קליני והמחקר של תפקוד ה-DNA.

שיבוש זמני של קרום התא באמצעות גירויים מכאניים הוא חלופי להחדרת מולקולות זרות לתוך תאים. טכניקות כוללות: microinjection של מולקולות 7, electroporation באמצעות שדה חשמלי כדי לשבש את הקרום 8,9, sonoporation באמצעות גלי אולטרסאונד כדי לשבש את קרום התא 10-12, הפצצת חלקיקים כפי שהודגם על ידי "אקדח הגן", שיורה בחלקיקים קשורים עם גנים לתוך התא 13, ולאחרונה, את היישום של מתח גזירה נוזל שהוכח permeabilize temporally תאי יונקים 14,15. למרות שמכונאישיטות אל חלק מהנושאים הנ"ל להימנע, הם מלווים בדרך כלל על ידי יעילות והגדרות מאוד מורכבות ומיוחדות יותר. לפיד אטמוספרי הפרשות זוהרים לחץ (APGD-t) פותח במקגיל עם המטרה הראשונית של functionalizing משטחים וניתוק תאים חסיד במבחנה 16. דרך מקרה, התגלה כי כתם חי / מת בשימוש היה איכשהו שנלקח על ידי תאים מבלי שהוסיף סוכן permeabilizing. יתר על כן, זה נראה שהתרחש רק באזורים המוגבלים של הבארות שקרתה לי להתאים את נתיב הלפיד. חקירת יכולות permeabilization של APGD-t המשיכה במחקרים בקרה, נמצא כי סילון גז אינרטי הספק של הפלזמה ללא עירור היה גם מסוגל permeabilize תאים. זאת בניגוד להשערה הראשונית כי המינים תגובתי נוצרו על ידי סילון הפלזמה באופן זמני לקוי תפקוד הקרום והציעה שפשוט mechaniכוחות קאל היו מספיקים כדי לגרום permeabilization תא. מכאן, המשך לימודים במעבדה שלנו כדי לנסות ולכמת ולאפיין את יעילות permeabilization של סילון גז אינרטי, כמו גם מבט על יכולות transfection 16.

באמצעות מחקרים אלה, זה כבר גילה כי micropores לעשות בצורת עובדה בקרום הפלזמה, ונקבובי אלה נוטים לאטום בתוך כ 5 שניות 15. אנחנו הוכיחו התועלת של הטכניקה במבחנה in vivo בקרום chorioallantoic של עובר אפרוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פיתוח של תכנית LabView

  1. זרימה המונית בקר (MKS M100B Mass-Flo Controller) מחובר לקו גז הליום כדי להבטיח זרימת גז שיעור מדויק. יחידה זו נשלטת על ידי מתח הזנה, הנעה בין 0 ל 5 V. לולאת שליטה בתכנית LabView קובעת את המתח הנדרש בכל זמן נתון. ממשק בין המחשב ואת הזרימה ההמונית בקר מבוצע על ידי מכשיר רכישת נתונים (USB-6009 NI), ו12 V אספקת חשמל מספקת חשמל לזרימה ההמונית בקר.
  2. שתי שקופיות ליניארי המיצוב משמשות כדי לשלוט על התנועה של צלחת 6 היטב, אחד לכל כיוון. כל מכלול מורכב מעצרת Unislide Velmex MA15-סדרה יחד עם מנוע דריכה ושני המכלולים נשלטים על ידי Velmex VXM אחד דורך מוטורי Controller. הבקר מאפשר ריצה ידנית של כל מנוע או מקבל מחרוזת של פקודות סידוריים חיצוניות, השילוב של אשר מאפשר עבור p תנועה הספציפיatterns. כמה דפוסים ניתן לתכנת לתכנית LabView, המחייבים את המשתמש על מנת לספק רק את מהירות לפיד הרצויה, כמו גם את ממדי הנתיב.

2. הכנת הציוד

  1. פתח את שני הצילינדרים הליום והרגולטור.
  2. הפעל את בקר המנוע.
  3. פתח את תכנית LabView ולאמת את כל התנאים.
  4. ודא שהפלטפורמה היא מרוכזת. כדי לבדוק זאת, נראה בכל שלב מוטורי ולוודא שכל קרון הוא לא ליד כל קצה במה. או שיש לי מרכז תכנית הכרכרות או להתאים באופן ידני על ידי שימוש בפקדי הריצה על החלק הקדמי של בקר המנוע.
  5. אם זה הריצה הראשונה של היום, מומלץ להפעיל את התכנית פעם אחת ללא תאים, כדי להבטיח את ההתקנה הוא עובדת בצורה נכונה.

3. הכנת גובה גז Jet נימי Nozzle

  1. הסר את נימי מבעל ולהתמקד בחיוג הגובה.
  2. הנח את o צלחת 6 היטבn הפלטפורמה.
  3. להחליף ולהקטין את נימי סילון גז לתחתית הבאר עד שהוא פוגע להחליק את המכסה. אבטח את הנימים בבעל.
  4. שימוש בחיוג הגובה, להעלות את נימי מ"מ 3. סמן גובה זה על בסיס הנימים.
  5. להעלות את הנימים לגובה בטוח ולאחר מכן להסיר את צלחת 6 באר.

4. תא permeabilization פרוטוקול

  1. שורת תאים חסיד תרבות למפגש בכיסוי זכוכית מחליקה בצלחת 6 היטב תוך שימוש בטכניקות culturing סטנדרטיים. לתאי הלה, 6 צלחות היטב זרע עם 2 x 10 5 תאים לכל היטב דגירה ל48 ​​שעות לפני הטיפול.
  2. הכן את הנפח מתאים של תמיסה המכילה את הווקטור הרצוי. לhrGFPII-1, ריכוז של 50 ng / μl ב 1x PBS מספק אות ניאון חזקה בתאי הלה 24 שעות לאחר transfection. ללימודים dextran, 80 מיקרוגרם / מיליליטר של 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa מומלץ. מכאן ואילך, פתרון זה יכונהשל "פתרון וקטור".
  3. הסר תקשורת תרבית תאים מהיטב ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
  4. פיפטה 1,370 μl של פתרון וקטור מוכן בשלב 4.2 לטוב. זה אמור לגרום לעומק נוזל של כ 1.3 מ"מ.
  5. הנח גם מכיל את פתרון הווקטור במרכז הבמה. מנמיכים את נחיר סילון גז לרמה המסומן בעבר שמעיד על גובה פייה של 3 מ"מ מעל השקופית.
  6. הגדר קצב זרימת הליום בתכנית LabVIEW ובחר את דפוס תנועה הרצויה לשימוש. בחר "הפעלה" כאשר מוכן להתחיל את פרוטוקול permeabilization. יהיה תקופת פיגור ראשונית שבמהלכו הזרימה ההמונית בקר נערך לספק את קצב הזרימה הנדרש. ברגע שכבר הגיע לקצב הזרימה המתאים, התכנית LabVIEW תפעיל מנועים stepper לנוע גם בדפוס permeabilization הרצוי. ברגע שהפלטפורמה הפסיקה, לחכות כ 30 שניות ולהסיר את פתרון הווקטור.הערה: permeabilization האופטימלי מתרחש ליד לחץ דינמי של 100-200 אבא ביציאת הזרבובית, תלוי בקוטר הנימים.
  7. לשטוף היטב שלוש פעמים עם 1X PBS.
  8. מלא גם עם תקשורת ותרבות טריות.
  9. חזור על שלבים 4.3-4.6 למספר רצוי של ניסויים. הערה: הקפד לכלול דגימות בקרה אשר מורכבת של בארות שמלאות בפתרון הווקטור בלי סילון הגז שנדרס. השאר את הפתרון בבארות שליטה לכ 1 דקות ולאחר מכן להמשיך לצעדים 4.5 ו4.6.
  10. אם מפעיל ניסוי transfection hrGFP, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל24 שעות כדי לאפשר לחומרי transfected להיות עיבד ידי התאים. אם מפעיל ניסוי permeabilization dextran, לחזור צלחת 6 היטב לחממה ל15 דקות.

5. תא הדמיה

  1. אם תרצה, מייד לפני הדמיה, counterstain עם כתם חי / מת מתאים כדי להעריך את המוות של תאים.
  2. תאי תמונה עם appropמיקרוסקופ riate לחקור יעילות transfection / permeabilization.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Permeabilization של תאי הלה עם 10 dextran פלואורסצנטי הירוק kDa באמצעות סילון גז הליום עם 0.86 מ"מ נימי קוטר פנימיים מוצג באיור 1. תאים היו counterstained מייד לאחר permeabilization עם פתרון 2 μl / מיליליטר EthD-1 (LIVE / DEAD הכדאיות / Cytotoxicity Kit) כדי לחזות מוות של תאים. מייד לאחר counterstaining, מכסה מחליק היו רכובים וצלם. נתון זה מראה את תוצאות של הפעלת סילון גז הליום בשלושת לחצים לשקע שונים בהשוואה למדגם שליטה. שים לב שרוחב מסלול permeabilization ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

permeabilization סילון גז אינרטי הוא טכניקה שימושית עבור transfection תא חסיד. הוא מספק את היכולת להעביר ביומולקולות לתוך תאים תוך השימוש בכוחות מכאניים, שמבטל את הצורך בכימיקלים מזיקים או וקטורים ויראליים. הטכניקה שעלול לתת לחוקרים וקלינאים דרך יעילה ופשוטה יחסית לtransfect בדיוק תאים. הסלקטיביות של permeabilization היא גם ייחודית ומאפשר לחוקרים לטיפול רק תאים מסוימים במושבה אחת אשר יכול להיות שימושי ביישומים מרובים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להודות למקורות המימון הבאים: מכון קנדי ​​לבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר (NSERC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Vitality hrGFPII-1Agilent Technologies Canada240143-57חלבון פלואורסצנטי ירוק לניסויי טרנספקציה על תאי HeLa
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, FixableLife Technologies Inc.D22910דקסטרן לניסויי חדירות
LIVE/DEAD כדאיות/ערכת ציטוטוקסיותTechnologies Inc.L3224לצביעה נגדית של תאי יונקים
Prolong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930להרכבת שקופיות בעת הדמיית
Ultra High PurityHelium Praxair Canada Inc.HE 5.0UH-T 
Hyclone DMEM/ מדיה גבוהה של גלוקוז - 500 מ"לThermo ScientificSH30022.01לתאי HeLa
סרוםבקר עוברי Invitrogen26140079למדיה DMEM
פניצילין-סטרפטומיצין,Invitrogenנוזלי 15140-122למדיה DMEM
מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 1xמיוצר במעבדה
 <חזק>טבלה 1. רשימת הריאגנטים הנדרשים
6-Well Clear TC-Treated MicroplatesCorning3506 
#1 22 x 22 כיסוייםפישר12-542B 
נימי זכוכיתWorld Precision Instrumentsמידע על גודל WPI
(מ"מ): 1, 0.86, 0.68, 0.5 הזמנה #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
בקר Mass-FloMKSM100B01314CS1BVבקר זרימת מסה, סדרה M100B, דורש ספק כוח חיצוני של 12 וולט
USB-6009 DAQ DeviceNational Instruments779026-01 
מכלול UniSlide עם מנוע צעד ובקרמכלולי MA15 UniSlide מסדרת Velmex שתיים, מצוידים במנועי צעד Vexta 1.8° המסופקים על ידי Velmex, ונשלטים על ידי בקר מנוע צעד VXM
<חזק>טבלה 2. רשימת הציוד הנדרש
Life מזהה  

מקורות

  1. Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
  2. Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
  3. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
  4. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
  5. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
  6. Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
  7. Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
  8. Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
  10. Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
  11. Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
  12. Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
  13. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
  14. Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
  15. Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
  16. Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
  17. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
  18. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חדירות תאייםתאים נצמדיםסילון גז הליוםבקר זרימה מסיתחדירה מרחביתיצירת מיקרו-נקביםמיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציהקצב זרימת גזפיית קפילרה
Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.