בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

Summary

בקרת חמצן מיקרופלואידית מעניקה יותר מסתם נוחות ומהירות על פני תאים היפוקסיים לניסויים ביולוגיים. במיוחד כאשר הוא מיושם באמצעות דיפוזיה דרך ממברנה, חמצן מיקרופלואידי יכול לספק אפנון פאזה נוזלית וגזית בו זמנית ברמת המיקרו-סקאלה. טכניקה זו מאפשרת ניסויים דינמיים רב-פרמטריים קריטיים לחקר פתופיזיולוגיה של איים.

Abstract

חמצון וניטור סימולטני של גורמי צימוד גירוי הפרשת גלוקוז בטכניקה אחת הוא קריטי לדוגמנות מדינות pathophysiological של היפוקסיה איון, במיוחד בסביבות השתלה. טכניקות קאמריות חוסר חמצן רגילים לא יכולות לווסת את שני הגירויים באותו הזמן ולא מספקות ניטור של גורמי צימוד גירוי הפרשת גלוקוז בזמן אמת. כדי לתת מענה לקשיים אלה, אנחנו מוחלים טכניקת microfluidic רב שכבתית לשלב גם מימיים ומודולציות שלב גז דרך קרום דיפוזיה. זה יוצר כריך גירוי סביב איי microscaled בתוך polydimethylsiloxane השקופה המכשיר (PDMS), המאפשר ניטור של גורמי הצימוד האמורים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, קלט הגז נשלט על ידי זוג microdispensers, מתן מודולציות של חמצן בין 0-21% כמותית, משנה דקה. היפוקסיה לסירוגין זה מיושמת לחקור תופעה חדשה של אינפשית מראש לא. יתר על כן, חמוש במיקרוסקופ מולטי, היינו יכול להסתכל על סידן מפורט ודינמיקת ערוץ _K-ATP במהלך אירועי חוסר חמצן אלה. אנחנו מדמיינים היפוקסיה microfluidic, במיוחד טכניקת שלב הכפול בו זמנית זו, ככלי רב ערך בלימוד האיים, כמו גם רקמות רבות vivo לשעבר.

Introduction

היפוקסיה דינמית חשובה בביולוגיה, במיוחד עבור השתלות איון

היפוקסיה דינמית היא פיסיולוגי חשוב, כמו גם פרמטר pathophysiological בהרבה רקמות ביולוגיות. שינוי בחמצן, לדוגמא, הוא אות התפתחותית חזקה באנגיוגנזה. יתר על כן, דפוסי מרחב ובזמן בהיפוקסיה לווסת HIF1-alpha וממלא תפקידים במחלות כמו סרטן לבלב. היפוקסיה היא גם גורם בלבול משפיע על תוצאות השתלת איון. לאחרונה, temporally תנודות של היפוקסיה, או היפוקסיה לסירוגין (IH) הוכיחו יתרונות באיונים "נפשית מראש" ^1. עם זאת, השפעות היפוקסיה הן סטטי והחולפים על פיזיולוגיה איון עדיין לא הבינו היטב או למדו, בעיקר בשל העדר הכלים המתאימים לשלוט microenvironment של איון.

איים הם vascularized גם in vivo

איי לבלב הם 50-400 אגרגטים spheroidal מ 'של תאים האנדוקרינית, כוללים תאים בטא ואלפא תאים שאחראים על הומאוסטזיס הגלוקוז; 56. כאשר איונים נחשפים לגירוי גלוקוז בדם, הספיגה וגליקוליזה להוביל לייצור ATP, אשר פותח אשלגן ATP רגיש ערוצים _(K-ATP) ותוצאות בזרימת סידן שמפעילה את exocytosis גרנולות אינסולין. החמצן הוא חשוב לנהוג תהליך חילוף חומרים בכבדות זה והפרשת אינסולין מושפעת באופן משמעותי על ידי הדינמיקה של זרימת דם ואספקת חמצן בנוסף לשיפועי גלוקוז. איונים בקלות לבצע תגובת גלוקוז אינסולין זה in vivo כפי שהם perfused ביותר בלבלב, כל אחד באורך תא אחד מכלי נימים. עם זאת, הרשת הצפופה של נימי דם intraislet הוסרה על ידי collagenase במהלך ^2,3 בידוד איון. כתוצאה מכך, אספקת חמצן וחומרי מזון מוגבלות להיקף 100 מיקרומטר בשל מגבלות דיפוזיה.

הצלחה צעד "> טכניקות נוכחי מוגבלות ביצירה מחדש של microenvironment איון

הדינמיקה של איון מחדש האם של החמצן וגלוקוז, מפתח לדוגמנות תנאים פיסיולוגיים וpathophysiological, קשה להשיג עם תאי חוסר חמצן סטנדרטיים הדורשים זרימה משוכללת וחוסר ניטור רציף של פונקציות איון. יתר על כן, טיפולי השתלה לסכרת מסוג לחשוף איים מבודדים להיפוקסיה במערכת השער הכבד ⁴ שבו יש הרבה יותר נמוך ת.ד. ₂ (<2%, 5-15 מ"מ כספית) בהשוואה ללבלב פיסיולוגי (5.6%, 40 מ"מ כספית). לאחר השתלה, שתלי איון לקחת שבועיים או יותר כדי להיות revascularized. הוכח כי חשיפת חוסר חמצן פוגעת במנגנון צימוד גלוקוז האינסולין של איון. בין גורמי צימוד גירוי הפרשה, סידן איתות, פוטנציאל של המיטוכונדריה, ואינסולין קינטיקה יכולה להיות בקלות לנטר באמצעות מיקרופלואידיקה. טכניקת microfluidic הקודמת שלנו הוכיחה מחדש את זהאל זמן ניטור עם אפנון מדויק של microenvironment המימית סביב איון בודד ^5,6. עם זאת, כימות של ליקוי חוסר חמצן של איון היא מתוסכלת מחוסר טכניקות גירוי וניטור בו זמנית. לכן, שילוב של שליטת microfluidic של חמצן וניטור איון יכול לשפר מחקרי היפוקסיה איון.

מיקרופלואידיקה יכול לשחזר ולווסת את microenvironment המימית וחמצן

הטכניקה סטנדרטית ללימודי רקמה והיפוקסיה התרבות הייתה מבוססת על תאי חוסר חמצן. באופן כללי, תאי חוסר חמצן מספקים ריכוזי חמצן יחיד עם זמני איזון ב~ 10-30 דקות, עולים בקנה אחד עם היפוקסיה הדינמית בקנה מידת דקה. שני מחקרים שנעשה לאחרונה בשימוש תאים מותאמים אישית קטנים לחשיפת היפוקסיה לסירוגין על כל עכברים, עם תוצאות סותרות בתגובה לאינסולין-Induced גלוקוז ^7,8. יש לזכור כי ברמת החיה שלמה, חמצן respired הוא לא ישירות טראןאמור איון הנימים ת.ד. _2, בשל בקרות במערכת הנשימה. יתר על כן, אין לי מחקרים אלו רמות חמצן סטנדרטיות, ולא שהם מספקים אמצעים בזמן אמת ברמת הרקמה של איים.

מצד השני, מיקרופלואידיקה חמצן יכול לעלות על המגבלות האלה על ידי השליטה חמצן באמצעות רשתות ערוץ גז. יתר על כן, מיקרופלואידיקה תואם הדמיה לחיות באפנון חמצן, הישג כרגע לא אפשרי עם תאי חוסר חמצן רגילים. מספר מיקרופלואידיקה אלה הרומן מתקרב לנצל את חדירות הגז של polydimethylsiloxane לפזר ריכוזי חמצן לתוך microchannels שזורמות תקשורת על תאי יעד ^9-14. גם מכשירים אלה משולבים ריכוזים מרובים בדידים חמצן, חיישני חמצן הקרינה מבוססת, ואפילו דור חמצן כימי על שבב.

יש לי מיקרופלואידיקה מבוסס solvation נוזלי יתקשה להחזיק הדרגתיים יציב, רציף כמו שאנילא תלוי בערבוב הסעה שהיא רגישה לתנאי זרימה. לשם השוואה, הטכניקה שאנו משתמשים כאן מתמקדת בהפחתת נתיב דיפוזיה של אספקת חמצן. Solvation הגז וזרימת גזירה בוטלו על ידי ישירות לשדר חמצן על פני קרום שנזרע עם תאים או רקמות איון. פעולה זו מסירה את מיקרופלואידיקה הנוסף הנדרש כדי לשלוט solvation ומונעת לחץ גזירה מיותר לאיים, שעצמו יכול לעורר שחרור אינסולין. פלטפורמה זו נעשתה שימוש כדי להדגים מיני חמצן תגובתי (ROS) עד ויסות בקצות שני hyperoxic וחוסר חמצן (2-97% O ₂₎ בתא התרבות ^1,15. בגלל המשלוח הישיר של חמצן ופינוי של זרימת גזירה, הפלטפורמה הבוסס על דיפוזיה שלנו מספקת את הפתרון האופטימלי לחקר microfluidic היפוקסיה איון.

גירוי וניטור multimodal

מיקרופלואידיקה מבוסס דיפוזיה גם מביא יתרונות נוספים כאשר מותאם ללימוד מיל איוןcrophysiology. באמצעות קרום כמחסום דיפוזיה, הנוזל יכול להיות מבודד ממודולציות החמצן, מה שמאפשר בקרה של גירויים גלוקוז מימיים באופן עצמאי מגירויי חוסר חמצן. זה יוצר גירוי בו זמנית כמו כריך שמרחבית משלוח פיני נקודות לאיים. יתר על כן, כפי שהגז הוא מווסת temporally דרך microinjectors הממוחשב, אנו יכולים לווסת את ריכוז החמצן 21-0% דיגיטלי עם זמן חולף פחות מ60 שניות. הבקרות דינמיות של החמצן וגלוקוז microenvironment במיקרוסקופ מאפשרות פרוטוקול מולטי זמן אמת זה יהיה אפשרי או בלתי רגיל מסורבל לא באמצעות תאי חוסר חמצן רגילים. שימוש במכשיר זה, סידן איתות (פורע-AM), פוטנציאל של המיטוכונדריה (Rhodamine 123), וקינטיקה אינסולין (ELISA) היו במעקב כדי לספק תמונה של תגובת הגלוקוז האינסולין הדינמית תחת היפוקסיה מלאה.

Protocol

1. הכנת איי העכברים

1. לנתח עכברי C57BL/6 ולבודד איים על ידי עיכול קולגנאז והפרדת שיפוע צפיפות Ficoll. (עיין במאמרים של JOVE המוזכרים^ב-2,3).
2. דגירה של איים במדיום RPMI-1640 המכילים 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-20 מ"מ HEPES בצלחות פטרי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂). לאחר בידוד, איי תרבית למשך 24 שעות לפני השימוש בניסויים. השתמש באיים תוך 1-2 ימים כדי להבטיח תוצאות עקביות.

2. יצירת הפלטפורמה המיקרופלואידית

1. צור את גיאומטריות המיקרו-מבנה על מסכות פוטו שקיפות עבור כל שכבת מכשיר: 1) כניסה ויציאה, 2) שכבה מיקרופלואידית של גלוקוז עם תא פריפוזיה (קוטר 8 מ"מ x 3 מ"מ, 150 מיקרוליטר), 3) ממברנה של 200 מיקרומטר עם מיקרו-בארות (קוטר 500 מיקרומטר, עומק 100 מיקרומטר), ו-4) שכבות מיקרופלואידיות של גז.
2. כדי לייצר את שכבת הכניסה והיציאה, יש לשפוך PDMS נטול גז ומעורבב מראש לגובה של 1.5 מ"מ בצלחת פטרי ריקה ולרפא בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
3. כדי לייצר את השכבה המיקרופלואידית של הגלוקוז, סובב שתי שכבות של 350 מיקרומטר של SU8-2150 ליצירת שכבה אחת של 700 מיקרומטר על פרוסת סיליקון 4 אינץ'.
   1. חשוף אור UV דרך מסכת הפוטו המתאימה כדי להעביר דפוס מיקרו-ערוצים ל-SU8 לאחר הפיתוח, וליצור מאסטר בגובה 700 מיקרומטר.
   2. יוצקים PDMS נטולי גז ומעורבבים מראש על מאסטר זה לגובה של 3 מ"מ ומרפאים ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חותכים את ה-PDMS הזה לצורה בעזרת סכין גילוח.
   3. ניקוב פתחי כניסה/יציאה בקוטר 2 מ"מ וכן תא בקוטר 8 מ"מ.
4. כדי לייצר את הממברנה של 200 מיקרומטר עם מיקרו-בארות, סובב SU8-2100 עד 100 מיקרומטר. החל את אותה ליתוגרפיה של UV כדי להעביר דפוסי מיקרובאר על מאסטר זה בגובה 100 מיקרומטר.
   1. סובב PDMS נטול גז ומעורבב מראש על מאסטר זה ב-900 סל"ד למשך 30 שניות וריפוי ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סובב שכבה שנייה על גבי הראשונה תוך שימוש באותם תנאים, וכתוצאה מכך קרום PDMS של 200 מיקרומטר המכיל דפוסי מיקרו-באר.
   2. ניקוב יציאות כניסה/פלט בקוטר 2 מ"מ דרך ממברנה זו
5. כדי לייצר את שכבת הגז המיקרופלואידית, סובב SU8-2100 עד 100 מיקרומטר. החל את אותה ליתוגרפיה UV כדי להעביר דפוסי מיקרופלואידיקה של גז על מאסטר זה בגובה 100 מיקרומטר.
   1. יוצקים PDMS נטולי גז ומעורבבים מראש על מאסטר זה לגובה של 1.5 מ"מ ומרפאים ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חותכים את ה-PDMS לצורה בעזרת סכין גילוח.
   2. ניקוב יציאות כניסה/פלט בקוטר 2 מ"מ דרך שכבה זו
6. כדי לחבר את השכבות המרובות, הכינו אותן על ידי ניקוי עם סקוטש, חשיפה לקשת עטרה ולאחר מכן יישור ידני בסדר הבא.
   1. הצמידו את הממברנה לשכבת הגז התחתונה כשהמיקרו-בארות פונות כלפי מעלה.
   2. קשר את הגלוקוז המיקרופלואידי על גבי קרום המיקרווול.
   3. חבר את שכבת הכניסה והיציאה בחלקו העליון, ועוטף את כל המכלול.
   4. מחזקים את ההדבקה על ידי הוספת משקל של 1 ק"ג מעל ואפייה בחום של 100 מעלות למשך 3 שעות.
7. בדוק דליפה של המכשיר שהושלם על ידי העמסת מים לשכבה המימית, ולאחר מכן טבילת המכשיר כולו מתחת למים. לאחר מכן, הזרימו אוויר דרך שכבת הגז בעזרת מזרק ריק.
8. עקר מכשירים נטולי דליפות עם 70% אתנול דרך השכבה המימית ולאחר מכן שטוף עם מאגר PBS, שבו המכשיר מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. הגדרת מיקרו-מתקן

1. השג 2 מיקרו-דיספקנסרים, ספקי כוח 5 V ו-20 V DC, ולוח I/O דיגיטלי לבניית מערך ערבוב ואספקת החמצן.
   1. חבר את כבלי הבקרה של המיקרו-דיספנסרים ליחידות הדרייבר הכלולות.
   2. חבר את הדרייברים ללוח הקלט/פלט הדיגיטלי ביציאות המתאימות לפקדי Labview.
   3. חבר את ספקי הכוח של 5 וולט ו-20 וולט למגעים המתאימים ביחידות ההנעה.
   4. חבר את ה-I/O הדיגיטלי למחשב נייד כדי לבצע קודי Labview לבקרת גז (נספח).
2. חבר מיקרו-דיספנסר אחד לחנקן ואחר לאוויר דחוס, שניהם עם 5% CO₂. הגדר את שני הגזים ל-2 psi. חבר את יציאות המכשירים בצומת T לפני הכניסה למכשיר המיקרופלואידי.
3. באמצעות מכשיר שנבדק דליפה, אפיינו את התגובה החולפת של אפנון החמצן על ידי רכיבה על המיקרו-דיספנסרים בין 5-21% חמצן, תוך מדידת חמצן מומס במים עם חיישן חמצן סיב אופטי (ראה רשימת ציוד ותוצאות מייצגות).

4. הגדרה במיקרוסקופיה

1. התקן את המכשיר לבמה המחוממת במיקרוסקופ ההפוך.
2. חבר גזים של 0% ו-21% O₂ למכשיר וכיול עם חיישן החמצן.
3. חבר את יציאת הפלט של מיקרופלואידיקת הגלוקוז לקולט שברים.
4. הכן את מאגר הקרבונט של קרבס רינגר (KRB): 129 מ"מ NaCl, 5 מ"מ NaHCO₃, 4.7 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ KH₂PO₄, 1 מ"מ CaCl₂·2H₂O, 1.2 מ"מ MgSO₄·7H₂O, 10 מ"מ HEPES pH 7.35-7.40, 2 מ"מ גלוקוז בסיסי ו-5% FBS.
5. הכינו שתי תמיסות חיץ המכילות גלוקוז של 2 מ"מ ו-14 מ"מ בהתאמה בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל שטופים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
6. חבר משאבה פריסטלטית כדי למשוך חיץ במהירות של 250 מיקרוליטר לדקה לתוך הצינור. הזרם את הצינור על פלטה חשמלית של 37 מעלות צלזיוס לפני הכניסה למכשיר המיקרופלואידי.
7. כדי להכתים את האיים, הוסף Fura-2 AM ב-DMSO ו-Rh123 ב-100% אתנול ל-2 מ"ל של KRB כדי להגיע לריכוזי צבע סופיים של 5 מיקרומטר ו-2.5 מיקרומטר, בהתאמה.
8. מרימים איים עם פיפטה של 10 מיקרוליטר ודוגרים בצבעים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
9. טען כ-20 איים לתוך המכשיר דרך כניסת המיקרו-ערוץ של הגלוקוז. כוון את האיים לתא על ידי תחול מאגר מהשקע בחזרה לכניסה.
10. יש לערבב את האיים במאגר למשך 10 דקות כדי לשטוף עודפי צבעים.

5. הפעלת גירוי חמצן וגלוקוז בו זמנית

1. ספק דופק גירוי גלוקוז עם 5 דקות של קו הבסיס שנקבע על ידי KRB2, ולאחר מכן 15 דקות של גירוי של 14 מ"מ, ולאחר מכן שטוף במשך 15 דקות ב-KRB2.
2. שיא אורך גל עירור של 340/380 ננומטר עבור Fura-2 ופליטת 534 עבור Rh123.
3. בצע מדידות של פולס רגיל (14 מ"מ נורמוקסי) לפני כל ניסוי.
4. עבור אפנון חמצן (היפוקסיה/היפוקסיה לסירוגין), יש להחיל את זרימת החיץ רק במהלך שלבי הגירוי והכביסה ולא לזרום בשלבים אחרים, כדי למזער הפרעות הסעה.
5. אסוף שפכים מיציאת הגלוקוז במרווחים של דקה אחת לבדיקת אינסולין ELISA.

Results

מרכזית בטכניקת היפוקסיה זו של האי היא היכולת לווסת גירוי פאזה מימי וגזי באותו תא מיקרופלואידי, עם ארעיות בקנה מידה דק. איור 1 הוא תוצאה מייצגת של א) גירויים כפולים ו-ב) מודולציות מהירות שנמדדו בתוך תא האי. אפנון מימי, המוצג על ידי הכנסת פלואורסצאין לתא, משיג שיווי משקל תוך שלוש עד ארבע דקות של ערבוב. יתר על כן, ניתן להגביר את החמצן מ-5-21% עם ארעיות מהירות, מה שמאפשר מחזור של חמצן בפרקי זמן קצרים של 2 דקות. ניתן להשיג גם עומקים ותדירויות שונות של רכיבה על אופניים כפי שמוצג באיור 2.

<...

Discussion

השיטות המרובות המשולבות בטכניקת היפוקסיה זו מציגות מספר נקודות שצוינו כאן לפתרון בעיות. ראשית, האיים המבודדים ממשיכים להתפרק ולהתפרק בתרבית עקב אנזימי עיכול מתאי אצינאר. סטנדרטיזציה של ניסויים ל-1-2 ימים לאחר בידוד האיים היא קריטית להשגת תוצאות עקביות. שנית, הזרימה המימית נעצרה במהלך היפוקסיה והיפוקסיה לסירוגין כדי למנוע פינוי הסעה בגבול שבין זרימה למינרית לדיפוזיה. נראה שזה מגביל את משך ההתניה המוקדמת של האי. שילוב עתידי של חילופי גזים בתעלה המימית יכול לבטל את המרווח הקטן הזה ועדיין לאפשר אפנון גז מהיר בממברנה. שלישית,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>מגיב / חומר< חזק >
ספינר	לורל	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150 / SU8-2100
לוח חם דיגיטלי	PMC לוחית נתונים	722A
UV ריפוי מנורת	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
שרביט קורונה	ETP	BD-20AC
תא ואקום	Bel-Art	420220000
מיקרו-דיספנסרים	חברת Lee	IKTX0322000A
5 וולט ו-20 וולט	DC רדיו שקל
NI USB	מכשיר לאומי	NI USB-6501
מדחום	אומגה הנדסה, בע"מ.
משאבה פריסטלטית	גילסון	Minipulse 2
חיישן חמצן	אופטיקה אוקיינוס	אספן שברים NeoFox
	גילסון	203
פיפטה	פישר מדעי	Finnpipette II 100μ l
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך	Leica	DMI 4000B
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר Scientific
בדיקות מולקולריות	צבע פלואורסצנטי
בדיקות מולקולריות	צבע פלואורסצנטיות
מדיה תרבות	סיגמא-אולדריץ'	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'
סרום בקר אלבומין	סיגמא-אולדריץ'
30 בצינורות סיליקון	Cole-Parmer		1/16 אינץ' x 1/8 ב-1.5
מ"ל צינורות אפנדורף	פישר סיינטיפיק
Y-connectors	Cole-Parmer		מחברי מזרק 1/16 אינץ' ו-4 מ"מ
	תקע לואר נקבה Cole-Parmer		1/16
במחברים ישרים	Cole-Parmer		1/16
במחבר מרפק	Cole-Parmer		1/16 אינץ'