חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

סיכום

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

תקציר

מערכת העצבים מתוארת לעתים קרובות כמרכיב ומקודד היטב בגוף גם אם היא מערכת איברים במידה ניכרת נוזל שמגיבה לגירויים חיצוניים, באופן עקבי, סטריאוטיפי, תוך שמירה על גמישות ופלסטיות מדהימה. בניגוד למערכת העצבים המרכזי (CNS), מערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי, אבל אנחנו רק עכשיו התחלנו להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש בדג זברה כמערכת מודל, יש לנו הזדמנות חסרת תקדים לכמה מחקרי משובי עם in vivo הדמיה ומניפולציה גנטית. עצבים היקפיים מורכבים מהאקסונים מוקפים בשכבות של גליה ורקמות חיבור. אקסונים הensheathed ידי myelinating או אי myelinating-תאי שוואן, שהם בתורם עטוף לתוך fascicle ידי נדן סלולרי נקרא perineurium. בעקבות פציעה, יש עצבים היקפיים למבוגרים יכולת יוצאת דופן לרמהפגום יש פסולת axonal ומטרות מחדש innervate. כדי לחקור את התפקידים של כל גליה ההיקפית בהתחדשות PNS, אנו מתארים כאן assay חיתוך רוחב האקסון המשתמש בליזר צבע זמין מסחרי חנקן נשאב לaxotomize עצבים מוטוריים בדג זברה מהונדס חי. בנוסף, אנו מתארים את השיטות לכמה ניסויים אלה לזמן לשגות הדמיה של עצבים פגועים ושליטה. פרדיגמה ניסויית זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את התפקיד שמחזה גליה בהתחדשות עצב, אבל יכול להיות גם הפלטפורמה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים תיקון מערכת עצבים.

מבוא

דג הזברה נעשתה שימוש נרחב ללמוד פיתוח של מערכת העצבים בגלל השקיפות האופטית שלהם וקלות transgenesis, שכאשר יחד, לאפשר הדמיה מרהיבה של התנהגויות תא דינמיות בעובר חי. בנוסף, משום שדג זברה ויונקים חולקים כמעט את כל הגנים הדרושים להיווצרות מערכת עצבים, מידע תאי ומולקולרי שנאסף באורגניזם המודל הזה הוא שאפשר להתייחס באופן ישיר לבעלי חוליות אחרים. אמנם רב עוצמה למחקרים התפתחותיים עצביים, דג הזברה והתכונות הייחודיות שלה יש פוטנציאל גם להבהיר את המנגנונים ששומרים ולבנות מחדש את מערכת העצבים לאחר פציעה. זחלי דג הזברה לשמור על השקיפות שלהם לשלבים מאוחרים של זחל ופיגמנטציה ניתן לחסום ביעילות גם עם השימוש במעכבים פרמקולוגיים של ייצור המלנין או מוטציות גנטיות שאין תאי פיגמנט. כך, באמצעות אורגניזם מודל זה ללמוד פציעה וregeneratיון בבעלי חיים מבוגרים יותר אפשרי ומציע הזדמנות הייחודית לחקור ישירות את המנגנונים התאיים ומולקולריים שלשקם את מערכת העצבים. בכתב יד זה, אנו מתארים כיצד ביעילות ובreproducibly לפגוע בעצבים בPNS של זחלי דג הזברה. הפרדיגמה פגיעה זו משאיל את עצמו ללימוד לא רק התנוונות, אלא גם את התגובות של גליה היקפית ותאים של מערכת חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה במהלך התחדשות.

את PNS הוא רשת מורכבת של עצבים תחושתיים ומוטורי שיש צורך להעביר מידע בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת העור, איברים והשרירים בגוף, המאפשר לאורגניזם כדי אינטראקציה עם סביבתו ולשרוד. לאורך העצבים האלה, גליה היקפית, כולל תאי myelinating ולא myelinating-שוואן וגליה perineurial, כמו גם רקמות חיבור, לשים בארגז את האקסונים והסוף של דבר יוצר את העצב הבוגר. פציעה של עצבים אלה יוזמת תהליך kNown כWallerian ניוון ^10. מנגנון זה של פיצול axonal, גיוס חיסונית, שחרור מפסולת והתחדשות הוא מאוד סטריאוטיפי וגנטי מוסדר ^1. מחקרים קודמים במערכות יונקים שתיארתי את התפקידים של תאי שווא במהלך הניוון עצבי ^{ו1 ההתחדשות, 2, 6, 8.} במחקרים של רקמות קבועה או תרבית תאים הללו, תאי שוואן גויסו לא רק מקרופאגים לאתר פציעה כדי לסייע בפינוי פסולת, אלא גם סייעו במיאלין phagocytosis עצמם. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיבי מאוד, יש לנו שלא היו מעולם תגובות גליה מדמיינים לפציעת האקסון ההיקפית in vivo בזמן אמת, ולא מחקרים אחרים בדקו את הקשר בין המעמדות של גליה היקפית השונות במהלך אירועים אלה.

לאחרונה, מספר מעבדות חקרו ניוון Wallerian באמצעות דג הזברה ופציעת האקסון לייזר בתיווך דומה למה שאנו מתארים כאן ^{4, 5, 7, 9. בחלק מהמחקרים אלה, האקסונים חושיים שטחיים היו axotomized בזחלים צעירים באמצעות מובנה מותאם אישית, מיקרוסקופ 4 שני הפוטונים confocal, 5, 9. במחקר אחר, שהוא מאוד דומה לשלנו, האקסונים עמוקים בתוך העצב המוטורי הגחון היו transected בזחלים בן 5 יום באמצעות מערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי 7. בשתי להגדיר קופצים הניסיוניים הללו, הדגש היה על ניוון Wallerian ושני האקסונים ותאים חיסוניים הם צלמו. להרחבה על מחקרים אלה, שאנו מתארים פציעת אקסונים מוטוריים בזחלים מבוגרים עם, עצבי myelinated בוגרים יותר וassay התגובה של כל גליה עצבים ההיקפית הקשורים בניוון והתחדשות.}

כדי לעשות זאת, אנחנו transect עצבים מוטוריים ב6 ולאחר הפריה 7 יום (DPF) זחלים ולדמיין את התגובות של אוכלוסיות גליה בודדות, כמו גם לחקור את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה לאורך אקסונים פגועים. באמצעות טרה כפולה ומשולשתקווי nsgenic שגליה היקפית תווית, כולל תאי שוואן וגליה perineurial, כמו גם כסמן לאקסונים, אנו משתמשים במערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי בהיקף של חנקן נשאב צבע לייזר (אורך הגל nm 435) המחובר למערכת confocal דיסק ספינינג כדי ליצור transections האקסון. זה מאפשר ניסיוני הגדרתנו לדמיין חיה דג הזברה, הזחל, לפגוע בשטחים ספציפיים היקפיים מוטוריים האקסון וזמן לשגות תמונה את התגובות של אוכלוסיות שונות גלייה לפציעת האקסון ומערכת היחסים שלהם אחד לשנייה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר ליצירת פציעות עצב בדג זברה בגילים שונים, עם קווים מהונדסים שונים או מוטציות גנטיות כדי לענות על שאלות מדעיות שונות.

פרוטוקול

1. הכנה והרכבה של עוברי דג הזברה לאבלציה והדמית חיה

1. הכן מלאי של 0.8% הנמוך להמיס agarose במי ביצה. Aliquot לתוך 13X 100 מ"מ צינורות תרבות חד פעמי ולאחסן ב 4 ° C עד צורך.
2. דג הזברה מבוגר צלב המכיל transgenes משולב ביציבות לתייג fluorescently הנוירונים מוטוריים וסוגי תאי גלייה של עניין. איסוף עובר דג הזברה במי ביצה ומניחה ב28.5 מעלות צלזיוס חממה להיערכות נכונה בהמשך ^3.
3. בכ 24 שעות לאחר הפריה (hpf), להסיר את המים ביצה ולהוסיף 0.002% 1-2-פניל thiourea (PTU) במי ביצה. להחזיר עוברים לחממה.
4. בין 24 ו 96 hpf, עוברים צריכים להיות מוקרנים לנוכחות של transgenes הרצוי בהיקף ניתוחים ניאון. הנח עוברים שנבחרו במי ביצת PTU טריים ולחזור לחממה.
5. כאשר זחלים הגיעו לאחר הפריה 6 ימים (DPF) (או גיל רצוי), להסיר אותם מהחממה, בחר כמה זחלים להרכבה, ולהעביר אותם לצלחת קטנה יותר.
6. הסר את המים מהקערה ולהחליף באופן מיידי לכ 0.02% Tricane במי ביצת PTU. לאפשר זחלים לשבת בהרדמה כ 5 דקות.
7. הנח aliquot של 0.8% הנמוך להמיס agarose בכוס עם מי ברז ומיקרוגל למשך 30 שניות, או עד שהוא נמס agarose. לאפשר את הכוס כדי לקרר עד agarose בצינור התרבות מרגיש פושר למגע (לא חם מדי).
8. בחר זחל מורדם ולהעביר אותו לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ בודד או רב כן. הסר את כל מים שהועברו לפגייה, ואז לכסות באופן מיידי את הזחל עם agarose החם מספיק כדי למלא את חלק זכוכית בעל תחתית של המנה, אבל לא ליצור כיפה גדולה.
9. כagarose מתקשה, להשתמש באיזמל מנתחים כדי למקם את הזחל על צידו בתחתית הצלחת, ואז להטות את הזחל רק מעט על הגב שלה. זה הכרחי לפציעה והדמיה שלאחר מכן, כיהזחל רכוב להיות נוגע ללב את הכוס על תחתית הצלחת. השתמש באיזמל המנתחים כדי לשמור את הזחל בתפקיד זה עד agarose הוא הגדילו והזחל הוא משותק.
10. לאחר agarose הוא התקשה באופן מלא, פיפטה לאט מים Tricane מספיק (זה יכול להיות אותו הדבר Tricane משמש להרדמה) לתוך הצלחת כדי לכסות את agarose וזחל לחלוטין.

2. כיול ובדיקת לייזר

1. הפעל את כל מכשור confocal מיקרוסקופ, לייזרי דיודה מתאימות לtransgenes דג הזברה מרגש, וחנקן נשאב לייזר הצבע. הקפד קרן "הריקה" מפצל הוא במקום, מחליש לייזר הוא פתוח באופן מלא, ותא צבע coumarin ננומטר 435 נמצא במקום. במחשב, לפתוח את תוכנת הדמיה.
2. הזז מטרת טבילה במי 1.2NA 63x למקום ולהחיל טיפה קטנה של מדיום טבילה למטרות מים על המטרה. מטרת 63x תאפשר לדיוק טוב לייזר אבלציה, ומימייmmersion מאפשר מרחק עבודה גדול יותר, שיש צורך בעבודה עם זחלי דג הזברה DPF 6-7.
3. השג שקופיות זכוכית עם צד אחד שיקוף לשימוש עבור כיול של לייזר. הנח את השקף, צד המראה, על הבמה מיקרוסקופ.
4. שימוש בעינית תחת תאורת brightfield, למצוא ולהתמקד בשריטה או לחרוט במראה. אור brightfield יהיה נוצץ במורד לשקופית הזכוכית, אבל יעבור רק דרך למטרה במקומות שבם המראה כבר שרוט או חרוטים משם, וגורם למראה כדי להסתכל דרך העינית שחור, ואת התחריטים נראים כמו כתמים או קווים של אור.
5. צפה ולמקד את התחריטים על מסך המחשב באמצעות תוכנת הדמיה. פתח את החלון ששולט כיול לייזר והגדרות צריכת חשמל. הגדר את מספר הפעימות ל "1" וצלחת להנחתת% הולכה "3". מספר פולסים מייצג את מספר הפעמים שהליזר יהיה אש בתוך כל אזור של עניין (ROאני) ו% העברת מייצג את כוח לייזר. הקפד הגדרת הכיול הנכונה נבחרה למטרת הטבילה במי 1.2NA 63x.
6. בחר בכלי האליפסה בסרגל הכלים הראשי, ולחץ על התמונה על מסך מחשב כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה חוזר אחד. לעשות את זה 3 פעמים נוספות עד שיש 4 ROIs המעגלי מחולקת באופן אקראי על גבי תמונה.
7. מערכות מסוימות עשויות לכלול תכונת בטיחות שלא יאפשר לירות לייזר אם נתיב האור לoculars פתוח. אם זה המקרה, באופן ידני לסגור את נתיב האור לoculars בשלב זה.
8. לירות לייזר. הפעולה זו תיצור 4 תחריטי נקודה קטנים, 1 בתוך כל החזר על השקעה חוזר. אם לייזר לא לירות, לבדוק כדי להיות בטוח שהליזר מופעל ומחובר כראוי, וכי נתיב האור לoculars סגור. אם את שריפות לייזר אך לא תחריט נראית, לבדוק כדי להיות בטוח "הריק" קרן המפצל נמצא במקום. אם הכל נמצא במקומו, להגדיל את כוח לייזר ו" FRAP "עד AR התחריטיםדואר גלוי. אם כוח לייזר הגדרה גדולה מ 10 יש צורך לחרוט את הכוס, זה עשוי להצביע על לייזר הפלזמה המחסנית צריכה להיות מוחלפת.
9. אם הכתמים מופיעים במרכז חרוט בתוך ROIs שנבחר, לא כיול הוא הכרחי (המשך 2.12). אם הכתמים לא מרוכזים, הגדרת הכיול צריכה להיות מעודכנת.
10. לכייל, לחץ על עדכון הגדרת הכיול. לייזר יירה ותמונה תופיע המכילה נקודה אחת חרוטה. אם הנקודה לא מופיעה, לבטל את הכיול, להגדיל את כוח לייזר, ולהתחיל את הכיול מחדש.
11. לחץ במרכזו במקום. לייזר יהיה לירות שוב, ונקודה נוספת תופיע. לחץ על נקודה זו, ולחזור על תהליך זה עד שהכיול הושלם ו9 נקודות מופיעות בצורה רשת. חזור על שלבים 2.6-2.9 כדי לבדוק שהכיול היה מוצלח.
12. הסר את שקופיות זכוכית מבמת מיקרוסקופ ולנקות אובייקטיביים. פתח את נתיב האור לOCUלארס, ולהחליף את מפצל האלומה "הריק" עם מפצל האלומה "100% החולה".

3. חיתוך רוחב עצב באמצעות אבלציה לייזר והדמיה Confocal זמן לשגות של התנהגויות תא גלייה

1. הסר את הבמה משמשת כדי להחזיק את שקופית הזכוכית ולהחליף עם במה מתאימה לקיום 35 מנות תחתיות מ"מ זכוכית. תמשיך להשתמש במטרת הטבילה במי 1.2NA 63x.
2. תחול ירידה קטנה של מדיום טבילה במים למטרה, ומניח את הצלחת עם זחל רכוב על הבמה. לייצב את המנה עם קליפים.
3. שימוש בעינית ותאורת widefield, להתמקד הזחל ולאתר את העצבים המוטוריים. סרוק את העצבים בhemisegments 10-20 ובחר עצב מוטורי לחיתוך רוחב.
4. להביא את תצוגה חי של העצב על מסך המחשב באמצעות תוכנת הדמיה. בחר Z-מטוסים ולרכוש תמונה של אקסונים ותאי גלייה של העצב לא נפגע.
5. הכן את הגדרות זמן לשגות הדמיה בתוכנת ההדמיה כדי ללכודZ-תחזיות של כל סוגי התאים במרווחי דקות 5-30, בהתאם לניסוי. הדרך הטובה ביותר הוא ליצור את כל ההגדרות הנחוצות לזמן לשגות לפני ביצוע אבלציה, כך שאין עיכוב בהתחלת הזמן לשגות פעם אחת הפגיעה היא מוחלטת.
6. הסר את מפצל האלומה "100% החולה" ולהחליפו "הריק". לסגור את נתיב האור לoculars.
7. לחזור לתצוגה חי של העצב. השתמש בערוץ הניאון המתאים כדי להציג את האקסונים שיהיה transected.
8. שימוש בכלי האליפסה, ליצור החזר על השקעה אליפטי דקה באזור לablated, ולאחר מכן ליצור ROIs הקטן בתוך האזור שנבחר.
9. בחלון ששולט בהגדרות לייזר, להגדיר את מספר הפעימות ל" 2 "ואת הצלחת להנחתת% הולכה" 18 ". לירות לייזר בתוך ROIs נבחר. אם שרידי הקרינה בתוך ROIs, להגדיל את כוח לייזר, לחכות כ -10 שניות, ולירות לייזר שוב. לעשות את זה עד שתגיע להגדרה שגורמת fluorescence להיעלם בתוך ROIs.
10. לחכות 10 שניות או יותר ולבדוק את שטח ablated שוב לקרינה. היזהר שהחזר על השקעה עשויה בתחילה יופיע ablated, כאשר הוא בעצם photobleached. אם מחזיר הקרינה, להגדיל את כוח לייזר ולירות לייזר שוב. חזור על פעולה זו עד שתפרחת נעלמה בתוך ROIs ואינו חוזרת בתוך 10 שניות. עדיף להתחיל עם כוח לייזר פחותים ולהגדיל את כוח הדרוש ל. כוח לייזר הדרוש עשוי להשתנות בהתאם למערכות שונות מיקרוסקופיה, גיל של צבע coumarin, דגימת הרכבה, גיל הזחלים, ועובי של הרקמה. ברגע שכוח לייזר אידיאלי כבר נקבע, הגדרת כוח זה עלול לשמש שוב על עצבים שלאחר מכן באותו הניסוי.
11. לאחר אבלציה הושלמה, תתחיל הדמיה זמן לשגות.
12. כשהזמן לשגות הוא מוחלט, להשתמש בתוכנת הדמיה כדי לאסוף נתונים וליצור צבע משולב Z-תחזיות עבור כל נקודת זמן. ליצור סרט QuickTime כדי לנתח את ההתנהגותשל אקסונים ותאי גלייה בו זמנית.

תוצאות

Assay המתואר כאן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התגובה של תאי גלייה ואוכלוסיות תאי עצב אחרים הקשורים לפציעת axonal in vivo. סרט 1 מציג דוגמה לפגיעה בעצב שנוצר באמצעות שיטה זו והתגובה של סביבת תאי גלייה. ניסוי זה בוצע ב Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) דג הזברה, שבו גליה perineurial להביע קרום ממוקד EGFP ומנוע נוירונים המפורש cytosolic DsRed. הפגיעה נעשתה לאורך ההקרנה מקורי של עצב מוטורי תא מטען בדג זברה לחיות 6 DPF, והעצב היה בהמשך הזמן לשגות...

דיון

השלבים הקריטיים ביותר של עיצוב ניסיוני זה הם: 1) כמו שצריך זחלים גובר על פגיעה ולאחר מכן in vivo הדמיה ו2) כיול לייזר ובחירת הגדרות צריכת החשמל הנכונה על מנת ליצור חיתוך רוחב עצב נקי שגורם לנזק נוסף רקמות מינימאלית . כדי להבטיח axotomy מוצלח בתחום ההדמיה vivo וניתוח שלאחר מכן, הר זחלים מרובים באחת מנות תחתיות זכוכית בודדות או בצלחת תחתית זכוכית עם חוצצים. לאחר כיול לייזר, מומלץ לבדוק את הגדרות צריכת חשמל שונות בזחל בדיקה כדי לזהות את הפרמטרים האופטימליים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
נקודת התכה נמוכה agarose	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview כלי תרבית תאים, תחתית זכוכית, סטרילית, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
כלי פטרי תחתית זכוכית באר אחת 35 x 10 מ"מ, עובי 12 מ"מ	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint מערכת לייזר עם כל הרכיבים	Andor Technology - נרכשה באמצעות Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint לייזר קורמרין צבע (435 ננומטר)	Andor Technology	MP-27-435-DYE