למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת העצבים מתוארת לעתים קרובות כמרכיב ומקודד היטב בגוף גם אם היא מערכת איברים במידה ניכרת נוזל שמגיבה לגירויים חיצוניים, באופן עקבי, סטריאוטיפי, תוך שמירה על גמישות ופלסטיות מדהימה. בניגוד למערכת העצבים המרכזי (CNS), מערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי, אבל אנחנו רק עכשיו התחלנו להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש בדג זברה כמערכת מודל, יש לנו הזדמנות חסרת תקדים לכמה מחקרי משובי עם in vivo הדמיה ומניפולציה גנטית. עצבים היקפיים מורכבים מהאקסונים מוקפים בשכבות של גליה ורקמות חיבור. אקסונים הensheathed ידי myelinating או אי myelinating-תאי שוואן, שהם בתורם עטוף לתוך fascicle ידי נדן סלולרי נקרא perineurium. בעקבות פציעה, יש עצבים היקפיים למבוגרים יכולת יוצאת דופן לרמהפגום יש פסולת axonal ומטרות מחדש innervate. כדי לחקור את התפקידים של כל גליה ההיקפית בהתחדשות PNS, אנו מתארים כאן assay חיתוך רוחב האקסון המשתמש בליזר צבע זמין מסחרי חנקן נשאב לaxotomize עצבים מוטוריים בדג זברה מהונדס חי. בנוסף, אנו מתארים את השיטות לכמה ניסויים אלה לזמן לשגות הדמיה של עצבים פגועים ושליטה. פרדיגמה ניסויית זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את התפקיד שמחזה גליה בהתחדשות עצב, אבל יכול להיות גם הפלטפורמה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים תיקון מערכת עצבים.
מבוא
דג הזברה נעשתה שימוש נרחב ללמוד פיתוח של מערכת העצבים בגלל השקיפות האופטית שלהם וקלות transgenesis, שכאשר יחד, לאפשר הדמיה מרהיבה של התנהגויות תא דינמיות בעובר חי. בנוסף, משום שדג זברה ויונקים חולקים כמעט את כל הגנים הדרושים להיווצרות מערכת עצבים, מידע תאי ומולקולרי שנאסף באורגניזם המודל הזה הוא שאפשר להתייחס באופן ישיר לבעלי חוליות אחרים. אמנם רב עוצמה למחקרים התפתחותיים עצביים, דג הזברה והתכונות הייחודיות שלה יש פוטנציאל גם להבהיר את המנגנונים ששומרים ולבנות מחדש את מערכת העצבים לאחר פציעה. זחלי דג הזברה לשמור על השקיפות שלהם לשלבים מאוחרים של זחל ופיגמנטציה ניתן לחסום ביעילות גם עם השימוש במעכבים פרמקולוגיים של ייצור המלנין ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה והרכבה של עוברי דג הזברה לאבלציה והדמית חיה
- הכן מלאי של 0.8% הנמוך להמיס agarose במי ביצה. Aliquot לתוך 13X 100 מ"מ צינורות תרבות חד פעמי ולאחסן ב 4 ° C עד צורך.
- דג הזברה מבוגר צלב המכיל transgenes משולב ביציבות לתייג fluorescently הנוירונים מוטוריים וסוגי תאי גלייה של עניין. איסוף עובר דג הזברה במי ביצה ומניחה ב28.5 מעלות צלזיוס חממה להיערכות נכונה בהמשך 3.
- בכ 24 שעות לאחר הפריה (hpf), להסיר את המים ביצה ולהוסיף 0.002% 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Assay המתואר כאן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התגובה של תאי גלייה ואוכלוסיות תאי עצב אחרים הקשורים לפציעת axonal in vivo. סרט 1 מציג דוגמה לפגיעה בעצב שנוצר באמצעות שיטה זו והתגובה של סביבת תאי גלייה. ניסוי זה בוצע ב Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) דג הזברה, שבו גליה perineurial להביע קרום ממוקד EGFP ומנוע נוירונים המפורש cytosolic DsRed. הפגיעה נעשתה לאורך ההקרנה מקורי של עצב מוטורי תא מטען בדג זברה לחיות 6 DPF, והעצב היה בהמשך הזמן לשגות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים ביותר של עיצוב ניסיוני זה הם: 1) כמו שצריך זחלים גובר על פגיעה ולאחר מכן in vivo הדמיה ו2) כיול לייזר ובחירת הגדרות צריכת החשמל הנכונה על מנת ליצור חיתוך רוחב עצב נקי שגורם לנזק נוסף רקמות מינימאלית . כדי להבטיח axotomy מוצלח בתחום ההדמיה vivo וניתוח שלאחר מכן, הר זחלים מרובים באחת מנות תחתיות זכוכית בודדות או בצלחת תחתית זכוכית עם חוצצים. לאחר כיול לייזר, מומלץ לבדוק את הגדרות צריכת חשמל שונות בזחל בדיקה כדי לזהות את הפרמטרים האופטימליים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות למעבדת Kucenas לדיונים חשובים וQuorum Technologies, Inc לתמיכה טכנית מעולה. העבודה נתמכה על ידי הקרן למצוינות בUVa מדע והטכנולוגיה (FEST) (SK).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| נקודת התכה נמוכה agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview כלי תרבית תאים, תחתית זכוכית, סטרילית, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| כלי פטרי תחתית זכוכית באר אחת 35 x 10 מ"מ, עובי 12 מ"מ | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint מערכת לייזר עם כל הרכיבים | Andor Technology - נרכשה באמצעות Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint לייזר קורמרין צבע (435 ננומטר) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
מקורות
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and no....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
