הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

46.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50638

⸱

17 באוקטובר 2013

 , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

תקציר

ספקי משנה מיקרומטר (nanocarriers; NCS) לשפר את היעילות של תרופות על ידי שיפור מסיסות, יציבות, זמן מחזור, מיקוד, ושחרורו. בנוסף, חוצים מחסומים סלולריים בגוף הוא קריטי עבור שני המשלוח האוראלי של NCS הטיפולי למחזור הדם והתחבורה מהדם לרקמות, שבו יש צורך בהתערבות. תחבורת NC פני מחסומים סלולריים מושגת על ידי: מסלול paracellular (i), באמצעות שיבוש זמני של צמתים שמשתלבים תאים סמוכים, או (ii) את מסלול transcellular, שבו חומרים הם הפנימו על ידי אנדוציטוזה, מועבר על פני גוף התא, ומופרש על פני התא ההפוך (transyctosis). משלוח פני מחסומים סלולריים ניתן להקל על ידי צימוד הרפוי או הספקים שלהם עם סוכני מיקוד שלהיקשר באופן ספציפי לסמנים על פני קרום תא המעורב בהובלה. כאן, אנו מספקים שיטות למדידת WHI המידה ומנגנון של תחבורת NC על פני מחסום תא מודל,פרק מורכב מmonolayer של תאי האפיתל במערכת העיכול (GI) גדל על קרום נקבובי נמצא בכנס transwell. כינונה של מחסום חדירות אושר על ידי מדידת התנגדות חשמלית transepithelial (Teer), תחבורת transepithelial של חומר שליטה, וimmunostaining של צמתים הדוקים. כדוגמא, ~ 200 NCS פולימר ננומטר משמשים, אשר נושא מטען טיפולי והם מצופים בנוגדן שמכוון הקובע על פני קרום תא. הנוגדנים או המטען טיפולי מתויג עם 125 למעקב radioisotope וNCS שכותרתו מתווספים לחדר העליון מעל monolayer התא לתקופות שונות של זמן. NCS הקשורים לתאים ו / או מועברים לתא הבסיסי ניתן לאתרם. מדידה של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר המושפל. מסלול paracellular נבחנים על ידי קביעת שינויים אפשריים הנגרמים על ידי תחבורת NC לפרמטרי המחסום שתוארו לעיל. i תחבורת Transcellulars נקבע על ידי עסק בהשפעה של ויסות מסלולי אנדוציטוזה וtranscytosis.

מבוא

מחסומים נייד במעשה גוף כשער בין הסביבה החיצונית והתאים פנימיים. זהו המקרה לרירית אפיתל להפריד את פני השטח החיצוני החשופים של מערכת העיכול (GI) בדרכי ו1-3 זרם הדם. מחסומים נייד גם לייצג את הממשק שבין זרם הדם וparenchyma ומרכיבים תאיים של רקמות ואיברים. זהו המקרה לרירית האנדותל הפנימית בכלי דם, כגון מחסום דם הריאה, מחסום דם המוח, וכו '1 היכולת לחצות מחסומים סלולריים אלה בגוף היא חיונית לאספקה ​​יעילה של סוכנים טיפוליים ואבחון למחזור הדם ורקמות / איברים שבו יש צורך בהתערבות.

כדי לשפר את המסירה של סוכנים טיפוליים או אבחון, ניתן לטעון תרכובות אלה לnanocarriers תת מיקרומטר (NCS). אפשר לנסח רכב משלוח סמים אלו עם מגוון רחב שלchemistries ומבנים כדי לייעל את מסיסות תרופה, הגנה, הפרמקוקינטיקה, שחרור, וחילוף חומרים של 4,5. NCS יכול להיות גם פונקציונליות עם זיקה או מיקוד moieties (למשל נוגדנים, סוכרים פפטידים, aptamers, וכו ') כדי להקל על הדבקה לאזורים בגוף שבו נדרש הפעולה הטיפולית 2,6. מיקוד של NCS לגורמים הביעו על פני השטח של מחסומים סלולריים יכול עוד יותר להקל על תחבורה אל ו / או על פני רפידות אלה 2,6.

התפקיד של סלקטיבי שינוע חומרים בין שתי סביבות דורש תכונות ייחודיות מסוימות בקרב שכבות תאים. מאפיין אחד כזה הוא קוטביות בתא, שבו קרום הפסגה מול לומן של חללים משתנה מקרום basolateral המכוון כלפי interstitium הרקמות, ביחס למורפולוגיה קרום ורכב שומנים, מובילים, וקולטני 2. תכונה נוספת כרוכה junctio אינטרNS חיבור תאים סמוכים. רגולציה של החלבונים היוצרים צמתים הדוקים, מולקולות במיוחד junctional הידבקות (קונפיטורות), occludins, וclaudins, לווסת את תפקוד המחסום כדי לאפשר באופן סלקטיבי או לא הובלת חומרים בין תאים, המכונים תחבורת paracellular, המאפשר מעבר של חומרים מהלום ל שטח basolateral 3. עקידת אלמנטים רבים טבעיים וסינטטיים (לויקוציטים, מולקולות, חלקיקים, ומערכות אספקת סמים) לחסמים סלולריים בגוף יכולה לגרום לפתיחת תא לצומת, אשר עשוי להיות ארעי ויחסית לא מזיק או ממושך יותר, ולכן, לא בטוח עם גישה של חומרים בלתי רצויים על פני המחסום 2,5,7-9. כתוצאה מכך, מסלול זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (Teer) ודיפוזיה פסיבית paracellular של מולקולות (זליגת paracellular במסמך זה נקרא), לפיה ירידה בהתנגדות לזרם חשמלי או דליפת paracellular המוגברת של ineמתחם rt לחלל basolateral מצביע על פתיחת צמתים תא, בהתאמה 5,10,11. כדי להשלים את השיטות הללו, כל אחד מחלבוני הצומת ההדוקים המפורטים לעיל יכול להיות מוכתם על מנת להעריך את היושרה שלהם, שבו צריכים להופיע כתמים מרוכזים בגבולות תאי תאים בכל רחבי הפריפריה התא 5,10,12.

לחלופין, מערכות אספקת סמים, כי יעד גורמי תא שטח מסוימים, כגון אלה הקשורים לבורות מצופים clathrin או invaginations קרום בצורת בקבוק שנקרא caveolae, עלולות לעורר ספיגת ועי לתוך תאים על ידי אנדוציטוזה, מתן שדרת עבור משלוח סמים לתאים תאיים 5, 13. בנוסף, אנדוציטוזה עלולה להוביל לסחר בשלפוחית ​​על פני גוף התא לשחרור בצד basolateral, תופעה הידועה בtransyctosis, או תחבורת transcellular 14. לכן, ידע של קינטיקה והמנגנון של אנדוציטוזה ניתן להשתמש כדי לנצל תאייםnd משלוח הסמים transcellular, שמציע מצב בטוח יחסית ושליטה מלאה של משלוח בהשוואה לתוואי paracellular. (אנדוציטוזה כמו במקרה של מולקולת הידבקות תא (רמ"א בתיווך)) המנגנון של אנדוציטוזה ניתן להעריך עם מאפננים של מסלולים קלאסיים (clathrin ואנדוציטוזה בתיווך caveolin, וmacropinocytosis) או מסלולים שאינם קלאסיים 5,13,15 .

בעוד סחר תאיים לעתים קרובות למד בבארות או coverslips סטנדרטיים, היעדר תא basolateral מונע קיטוב תא ואת היכולת ללמוד תחבורה פני שכבות תאים. כדי להתגבר על מכשול זה, תחבורה ברחבי monolayers התא נחקרה ארוכה באמצעות transwell מוסיף 10,11,16,17, שמורכב מחדר עליון (פסגת), קרום חדיר נקבובי שבו תאים לצרף ולהקים monolayer הדוק, ונמוך יותר קאמרי (basolateral) (איור 1). בתצורה זו, תחבורה ניתן למדוד בקודקוד לכיוון basolateral על ידי מתן טיפול לחדר העליון, בעקבות ההובלה דרך monolayer התא והקרום הנקבובי הבסיסי, ולבסוף איסוף הבינוני בתא התחתון לכימות של חומר מועבר. תחבורה בכיוון basolateral לפסגה גם ניתן למדוד על ידי ממשל ראשוני לתא התחתון והאוסף הבא מהעליון קאמרי 5,10,12,16. טכניקות שונות קיימות כדי לאמת את היווצרות מחסום חדירות על transwells, כולל Teer ומבחני תחבורת paracellular, כפי שתוארו לעיל. בנוסף, המסנן החדיר שבו תאים בתרבית ניתן להסיר בניתוח הדמיה (למשל על ידי הקרינה, confocal, מיקרוסקופית אלקטרונים), כהוכחה נוספת של מודל monolayer תא, כמו גם את המנגנון של תחבורה. בחירה של סוג הקרום, שהוא זמין בגדלים שונים נקבוביות, חומרים ופני שטחים, תלויה בפקטו השוניםrs כגון גודל של חומרים או חפצים כדי להיות מועברים, סוג התא, ואת שיטת הדמיה 16,18-20. Transwell מוסיף גם להקל כימות מבוקר ומדויק של תחבורה בהשוואה למערכות של יונקים מורכבים, כאמצעי אחסון של התאים ועל פני השטח של תאים ידועים קבועים. בעוד גורמים רבים המעורבים בin vivo משלוח בוטלו, לרבות הנוכחות של ריר מעיים, מאמץ גזירה, אנזימי עיכול, תאי מערכת החיסון, וכו ', בקנה מידה הקטן הזה במודל מבחנה מספקת מידע ראשוני שימושי לגבי תחבורה.

כדוגמא כדי להמחיש את ההתאמה של שיטות אלה ללמוד תחבורת NC פני מחסומים סלולריים 10,11,16,17, אנו מתארים כאן מקרה שבו הפוטנציאל להובלת NC פני האפיתל במערכת העיכול היה במתכונת על ידי בחינת מעבר משלוח סמים מודל של מערכת באמצעות monolayer של אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל האנושי (קאקו-2) תאים. לצורך, ג זואמות היו בתרבית במוסיפה transwell, על terephthalate 0.8 מיקרומטר הנקבובית פוליאתילן מסנן (PET) (קוטר 6.4 מ"מ), שהוא שקוף וניתן להשתמש בם להדמיה מיקרוסקופית. מעמדו של מחסום החדירות אומת על ידי מדידת Teer, תחבורת הפסגה לbasolateral של חומר שליטה, אלבומין, והדמית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלמנט של צמתים ההדוקים, חלבון occludin. מודל של פולימר הממוקד NC משמש, בהיקף של 100 ננומטר, חלקיקי פוליסטירן, לא מתכלים. NCS הם מצופים על ידי ספיחת משטח עם נוגדן מיקוד לבד או שילוב של נוגדני מיקוד ומטענים טיפוליים, שבו גם מרכיב יכול להיות מתויג עם 125 למעקב radioisotope. בדוגמא שנבחרה, הנוגדנים מזהה הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1), חלבון לידי ביטוי על פני השטח של אפיתל במערכת העיכול (וגם אחרים) תאים, אשר הוכח כדי להקל תאיים וo תחבורת transcellular ספקים ו סמים ומטעניהם 21. המטען הוא אלפא Galactosidase (α-Gal), אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעת אחסון lysosomal גנטי 22.

NCS המצופה, של כ -200 ננומטר בגודלם, מתווספים לתא apical מעל monolayer התא וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות משתנות של זמן, שלאחריו 125 אני בNCS ניתן לאתרם קשור לmonolayer ו / או התא מועבר לתא basolateral מתחת לתאים. קביעה נוספות של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר והערכה המושפל תחבורת NC המצופה. המנגנון של תחבורה מוערך יותר על ידי בחינת שינויים במחסום החדירות הנוגעים לתוואי paracellular, באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, תוך הובלת transcellular נקבעת על ידי בחינת שינויים בתחבורה כאשר ויסות מסלולים של אנדוציטוזה וtranscytosis.

ontent "> שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי דגמי מחסום סלולארי, במידה ושיעור ההובלה של מערכת אספקת סמים, ואת המנגנון של תחבורה כזה, לחלוטין ומאפשר הערכה של הפוטנציאל עבור משלוח סמים על פני מחסומים סלולריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Culturing חד שכבתי נייד בהוספת Transwell

  1. בשכונת סטרילי, רמת בטיחות ביולוגית 2 תא תרבות, מקום 0.8 מ"מ הנקבובית PET transwell מוסיף לתוך צלחת 24 גם (4 בארות לכל מצב, למובהקות סטטיסטיות) עם מלקחיים. כל החומרים שנכנסו למכסת המנוע צריכים להיות מעוקרים עם אתנול.

הערה: הגודל הנקבובית של המסנן צריך להיות שנבחר בהסכם לגודל הממוצע של NC בשימוש, כדי לאפשר תחבורה על פני הממברנה. כמו כן, לתוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, כל תנאי ניסוי דורש מינימום של ארבע חזרות (בארות) בתוך אותו הניסוי, ומינימום של 3 ניסויים בלתי תלויים.

  1. הכן את המדיום סלולרי תרבות המכיל מדיום DMEM בתוספת גלוקוז 4.5 גר '/ ל', 15% בסרום שור עוברי, ו -1% סטרפטוקוקוס עט, וחום ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. לדלל אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל אנושי (קאקו-2) תאים במדיום סלולרי ומקום200-400 μl של פתרון התא לתוך התא העליון (הפסגה) של להכניס transwell, בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. למלא את התא התחתון (basolateral) עם 700-900 μl של מדיום סלולרי.
  3. תרבות תאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולחות 95% עבור 16-21 ימים, והחליפו את המדיום בתא העליון ותחתון בכל 3-4 ימים, תוך שימוש באמצעי האחסון שצוין בשלב 1.3. החלף בינוני לפי הסדר הבא כדי לשמור על הלחץ מעל (ולא מתחת) monolayer התא: לשאוב את המדיום מהתא התחתון, לשאוב את המדיום מהחדר העליון, למלא את התא העליון עם מדיום חדש, ולמלא את התא התחתון עם מדיום חדש.

2. אימות של GI אפיתל חדירות המחסום באמצעות Transepithelial חשמל ההתנגדות (Teer) וImmunostaining של צומת הדוקים

  1. עבור אחסון לטווח קצר (פחות מ -2 שבועות), לצלול אלקטרודות STX100 בsolu אלקטרוליטtion (.1-.15 M KCl או NaCl). חבר את כבל האלקטרודה ליציאת האלקטרודה במד EVOM וולט אוהם, כך שהמערכת היא קצרה חשמלית באופן פנימי, והוא שמר על הסימטריה האלקטרודה. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף עם DH 2 O ולאחסן אותו במצב יבש, כהה.
  2. כדי לעקר את האלקטרודות, לטבול באתנול במשך 15 דקות ולאפשר לאוויר יבש ל15 שניות. לחלופין, ניתן לאחסן את האלקטרודות במכסת מנוע UV. יש לשטוף את האלקטרודות בתמיסה סטרילית אלקטרוליט (תמיסת מלח חיץ פוספט, PBS) או .1-0.15 פתרון M KCl או NaCl, לפני כל מדידת התנגדות.
  3. עם מד וולט אוהם מוגדר להגדרת ההתנגדות, במאונך למקם את האלקטרודות הבמכילה את תוסף transwell היטב, עם האלקטרודה הקצרה בחדר העליון ואלקטרודה הארוכה בתא התחתון נוגע בתחתית הבאר. לאחר קריאת EVOM תתייצב, להקליט את ערך ההתנגדות (שניתן באוהם; Ω) לכל אחד.
  4. חישוב התנגדות (ההתנגדce מנורמל לאזור; Ω × 2 סנטימטר) של דגימות על ידי הפחתת התנגדות רקע (Teer של מוסיף transwell ללא תאים) והכפלה בשטח הממברנה. ערכי התנגדות לרוב מדווחים בספרות. (ראה דיון)
  5. חזור על מדידות בכל 1-2 ימים עד Teer ערכי עלייה למקסימום ורמה, המצביעים על היווצרותו של מחסום חדירות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות מרגע platting תא. ערכי המישור Teer וזמן דרוש כדי להשיג את שלמות מחסום עשויים להשתנות בהתאם למספר תא מעבר.
  6. כדי לאמת את נוכחותם של צמתים הדוקים בmonolayers תא עם Teer הגבוה (שווה או מעל ערך הסף להיווצרות מחסום), לתקן את התאים על ידי דגירה עם paraformaldehyde 2% קרים במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי occludin. שטוף תאים שוב עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 7.5 מיקרוגרם / מיליליטר ונוגדנים משני luorescently שכותרת. השתמש בבארות עם Teer נמוך כביקורת שלילית להיווצרות מכשול.

הערה: כתחליף לאנטי occludin, ניתן להשתמש בנוגדנים לחלבוני צומת הדוקים חלופיים.

  1. הבלו בזהירות את קרום המסנן שבי monolayer הקבוע מצורף, ולעלות על גבי שקופיות להדמיה באמצעות epifluorescence או confocal.

3. הערכת Transepithelial תחבורה של נשאים ממוקדים

  1. תווית נוגדנים (נוגדנים חד שבטיים כנגד עכבר ICAM-1, אנטי ICAM, בדוגמא זו) מיקוד עם 125 אני, כפי שתואר בעבר 7. השתמש assay ברדפורד להעריך ריכוז חלבון ודלפק גמא לקבוע 125 אני תוכן בנוגדנים, ואז לחשב את הפעילות הספציפית בספירת לדקה (CPM) / מ"ג של נוגדן שכותרתו.

הערה: כדי לשלוט על הספציפיות, מחדשכבול ההליך על ידי IgG עכבר תיוג, אשר ישמש להכנת NCS המצופה שאינו ממוקד. ללמוד הובלה של מטענים טיפוליים, לחזור על תהליך תיוג המטען, למשל, אלפא Galactosidase (α-Gal) בדוגמא זו. חלופות יכולות לשמש לסוכן המיקוד, שליטה שאינה ספציפית, או מטען טיפולי. גם שיטות חלופיות ניתן להשתמש כדי לתייג תרכובות ולהעריך את הריכוז של עמיתיהם שכותרתו.

  1. זוג שכותרת מיקוד נוגדנים (אנטי ICAM בדוגמא שלנו) על פני השטח של NCS. בדוגמא זו, דגירה nanobeads קלקר (קוטר 100 ננומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם 125 I-אנטי ICAM לאפשר ספיחת פני השטח, כפי שתואר על 7.

הערה: לקבלת השליטה שאינה ספציפית להשתמש 125 I-IgG. כדי לעקוב אחר שינוע מטענים, להשתמש בשילוב של מיקוד נוגדנים ו125 מטען שהכותרת אני (α-גל בדוגמא שלנו).

  1. צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 3 דקות ולהסיר את עמיתיהם שאינם מצופים בsupernatant על ידי שאיפה. Resuspend את הכדור המכיל NCS המצופה באמצעות 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS על ידי pipetting, וsonicate בהספק נמוך כדי לשבש אגרגטים פוטנציאל חלקיקים (20-30 בפולסים קצרים).
  2. לאפיון NC, למדוד את הגודל, polydispersity, וζ-פוטנציאלי של חלקיקים מצופים באמצעות פיזור אור דינמי (בעקבות הוראות ספק), ולכמת את מספר 125 כותרת מיקוד מולקולות נוגדן (למשל אנטי ICAM) על פני השטח של החלקיקים באמצעות דלפק גמא.

הערה: שיטות אלה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים. הגודל של חלקיקים מצופים נע סביב 200 ננומטר.

  1. הוספת 125 NCS אני נוגדנים, (למשל 125 I-אנטי ICAM NCS; 56 NCI / מיליליטר) לתא העליון מעל monolayers המחוברות קאקו-2 עם Teer &# 8805; 350 Ω × 2 סנטימטר (ראה דיון) על רקע (16-21 ימים לאחר זריעה). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחים אחד או יותר זמן רצוי. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני ואחרי הדגירה כדי להעריך את ההשפעות של NCS במחסום החדירות.

הערה: הליך זה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים.

  1. אסוף בינוני מהתאים העליונים ותחתונים ולשטוף אותם פעם אחת עם 0.5 מיליליטר DMEM על 37 מעלות צלזיוס (בית עליון) או 1 מיליליטר DH 2 O (תא תחתון). לאסוף את שוטף למדידה בסך הכל תוכן radioisotope באמצעות דלפק גמא.
  2. למדידה של שבריר התא, בלו, המסנן החדיר, למשל באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך מסביב לקצוות, ודגירה בצינור דלפק גמא עם 1% טריטון X-100 עבור 10 דקות (כדי לשחרר את תוכן תא), לפני מדידת תא הקשורים רדיואקטיביות סך הכל.
  3. כדי למדוד 125 אני מחדשבחכירה מNCS במהלך הובלה או עקב הידרדרות פוטנציאלית, התמהיל ראשון 300 μl של מדגם (משברים העליונים, תחתון, או תא) עם 700 μl של BSA 3% ב-PBS ו200 μl חומצת Trichloroacetic (TCA). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. בינתיים זה זמן, למדוד את הרדיואקטיביות הכוללת של מדגם זה בדלפק גמא.
  4. דגימות TCA צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות על מנת להפריד בין חלבון שלם (גלולה) מהחלבון המושפל או 125 אני שבריר (supernatant). לכמת את הרדיואקטיביות שלי שבריר 125 החופשי ולחסר ערך זה מרדיואקטיביות בסך הכל נמדד לפני צנטריפוגה. זה יספק את כמות החלבון שכותרתו כי הוא לא מושפל.

4. מנגנון של Transepithelial תחבורה של Nanocarriers ממוקד

  1. תווית אלבומין עם 125 כפי שתוארו בסעיף 3.1 והעבר דיווחה 7.

הערה: אלבומין הוא 66.5חלבון kDa, ולכן, חומר גדול יחסית. למרות שליטה בתוקף להובלה פסיבית של אובייקטים גדולים יותר (למשל 200 NCS ננומטר משמש כאן), זה צריכה להיות מוחלף עם מולקולות נותב אינרטי קטנים יותר כאשר לומדים הובלה של נשאי תרופות קטנים יותר (ראה דיון).

  1. כדי להעריך תחבורת paracellular באמצעות זליגת paracellular אלבומין, קאקו-2 monolayers תרבות על transwell מוסיף כפי שתואר לעיל.
  2. למדיום החדר העליון מעל monolayer התא, להוסיף או 125 I-אלבומין לבד (ביקורת שלילית המראה את הרמה הבסיסית של דליפה), או 125 NCS-ממוקד נוגדן I-אלבומין ולא רדיואקטיבי (כמתואר בסעיף 3.5). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מרווח הזמן שנבחר (ים), שאמור להתאים לאלו שנבדקו בעת בדיקת תחבורת NC. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ואחרי הדגירה, ואז לאסוף את כל השברים ל125 אני כולל ו125 אני מדידות חופשיות כפי שמצוין. בסעיף 3 הערה: בנוסף בד בבד 125 NCS IgG שליטת I-אלבומין ולא רדיואקטיבי עשוי לשמש כביקורת.
  3. כביקורת חיובית לפתיחת צמתים אינטר, להוסיף מדיה תא המכילה 5 מ"מ H 2 O 2 לתאי העליונים ותחתונים של להכניס transwell, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ואז, למדוד Teer (סעיף 2.3) ולהוסיף 125 I-אלבומין לחדר העליון למרווחי הזמן שנבחרו. מדוד Teer בנקודות זמן שונים לאורך הדגירה לזהות ריקבון ערך Teer נגרמים על ידי H 2 O פתיחה מושרה 2 של צמתים התא.
  4. בניסויים מקבילים, להעריך תחבורת transcellular, המכונה גם transcytosis, 125 NCS-ממוקד אני על ידי דוגרים קאקו-2 monolayers מחוברות עם או monodansylcadaverine מיקרומטר 50 (MDC; מעכב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin), 1 מיקרוגרם / מיליליטר filipin (מעכב של caveolar אנדוציטוזה בתיווך), וורטמן 0.5 מיקרומטרב( מעכב של phosphatidylinositol 3 קינאז [PI3K], מעורב בmacropinocytosis), או 20 מיקרומטר [5 - (N-אתיל-N-איזופרופיל) אמילוריד] (EIPA, מעכב של macropinocytosis ואנדוציטוזה בתיווך CAM 15).

הערה: 125 I-IgG NCS ו125 I-אלבומין עשוי לשמש בקרות שליליות להשפעה של מעכבים האלה, ושיטות אחרות (לדוגמא: טכניקות siRNA) עשויות לספק עיכוב בררני יותר.

  1. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ולאחר הדגירה של תאים עם מעכבים וחומרי רדיואקטיבי, כבקרה נוספת להשפעה של מעכבים על חדירות השכבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאימות של מודל התא שלנו ללמוד תחבורת transepithelial של NCS הממוקד, איור 2 מראה כי קאקו-2 monolayers תא מצופה בצפיפות של 1.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר הגיעה מפגש ~ יום 12 ושמר עד יום 18 יושרת monolayer, מסומן על ידי (איור 2 א) Teer. זו קבלה תוקף על ידי הנוכחות של צמתים הדוקים occludin החיובי (איור 2) בmonolayers עם Teer הגבוה (390 Ω סנטימטר × 2, יום 14), בהשוואה לתיוג עניים הדוק צומת בTeer הנמוך (17 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שימוש בשיטות שנדונו לעיל, ניתן לקבוע מודל תא לחקר תחבורה של NCS הממוקד על פני מחסומים סלולריים, כמו בדוגמא הניתנת לקאקו-2 תאי אפיתל, שהוא רלוונטי להערכת תחבורה מלומן במערכת העיכול אל הדם במקרה של מערכות להולכת תרופות דרך הפה. Culturing של monolayers תאי אפיתל במערכת העיכול במוסיף transwell אפשר מדידה של Teer וimmunostaining הקרינה של צמתים הדוקים כדי לאשר הקמתה של גדר חדירות תא. בהמשך לכך, radiolabeling של מיקוד וסוכנים טיפוליים עם 125 אני מסופק כימות מהיר ורגיש של NCS ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הרפואי הווארד יוז והקרן הלאומי למדע לRG, וקרנות הוענקו לSM על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט R01-HL98416) ואיגוד הלב האמריקאי (גרנט 09BGIA2450014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Transwell מוסיףBD Falcon353095 
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM), 1xCellgro10-013-CM 
סרום בקר עוברי (FBS)Cellgro35-015-CV 
עט סטרפטוקוקוסג'יבקו15140 
תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי (Caco-2)ATCCHTB-37TM 
125יודפרקין אלמרNEZ033H002MCמסוכן רדיואקטיבי
(PBS)Gibco14190-235 
סרום בקר אלבומין (BSA)Equitech BioBAH-66 
פרפורמלדהיד (16%)פישר סיינטיפיק15710 
עכבר אימונוגלובולין G (IgG)Jackson ImmunoResearch015-000-003 
נוגדנים חד-שבטיים של עכברים ל-ICAM-1 אנושי (anti-ICAM)Marlin 1987 
α-Galactosidase, מפולי קפה ירוקיםSigmaG8507-25UN 
חרוזי לטקס FITC, 100 ננומטרPolysciences, Inc.17150 
טריטון X-100סיגמא234729-500 מ"ל 
חומצה טריכלורואצטית (TCA)פישר סיינטיפיקSA433-500 
נוגדן אוקלודין (Y-12), אנטי-אנושי אנטי-אנושי של עיזיםסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSc-27151 
מונודנסילקדברין (MDC)סיגמאD4008 
פיליפיןסיגמאF9765 
5-(N-אתיל-N-איזופרופיל) אמילוריד (EIPA)SigmaA3085 
וורטמניןסיגמאW1628 
מונה גמאפרקין אלמראשף2 
מד וולט-אוהםמכשירי דיוק עולמייםEVOM2 
אלקטרודות TEERWorld Precision InstrumentsSTX100אלקטרודות זמינות עבור לוחות באר שונים
פיזור אור דינמי (DLS)MalvernNano-ZS90 
מאגר פוספט

מקורות

  1. Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
  2. Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
  3. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
  4. Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
  5. Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
  6. Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
  7. Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
  8. Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
  9. Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
  10. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
  11. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  12. Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
  13. Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
  14. Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
  15. Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
  16. Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
  17. Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
  18. Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
  19. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
  20. Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
  21. Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
  22. Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
  23. Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
  24. Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
  25. Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
  26. Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
  27. Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
  28. Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
  29. Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
  30. Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TranswellCaco 2
מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.