דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על ידי באתר הכלאה. הפרוטוקול המשופר שלנו מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכים עם אות רקע הלא ספציפית נמוכה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מתמקד בכל הר הכלאה באתרו (לוואי) של עוברי דג הזברה. הטכנולוגיה מאפשרת מאחלי ההערכה של ביטוי גנים הן במונחים של חלוקת רקמה ושלב התפתחותי. פרוטוקולים מתוארים לשימוש ברצון של עוברי דג הזברה באמצעות בדיקות RNA antisense שכותרתו עם digoxigenin. בדיקות נוצרות על ידי שילוב של נוקלאוטידים digoxigenin צמודים באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות גנטיות שכבר משובטות ולינארית. את chorions של עוברים שנקטפו בשלבי התפתחות הוגדרו יוסרו לפני דגירה עם בדיקות ספציפיות. בעקבות הליך כביסה כדי להסיר את החללית עודפת, עוברים מודגרת עם נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות עם phosphatase אלקליין. על ידי שימוש במצע chromogenic לphosphatase אלקליין, ניתן להעריך ביטוי ספציפי גן. בהתאם לרמה של ביטוי גני ההליך כולו יכול להסתיים תוך 2-3 ימים.
מבוא
דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חיה רב עוצמה לפיתוח המחקר של החולייתנים, מחלות, התנהגות, ובשימוש בסמים ההקרנה 1-3. ניתן להשיג עוברי דג הזברה במספרים גדולים ממעבר אחד. הפריה והתפתחות מתרחשת ברחם לשעבר ואת העוברים הברורים אופטי לפתח במהירות. אירועי התפתחות קריטיים מתרחשים במהלך 48 שעות הראשונה לאחר ההפריה (hpf). זה כולל את המראה של האיבר primordia וייזום של cytodifferentiation. ניתן להשיג מציאה או על ביטוי של חלבונים באמצעות microinjection של עוברים עם antisense morpholino (MO) oligonucleotides או mRNA בהתאמה בשלב תא אחד או שניים (0.75 hpf).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. כל הר הכלאה באתרו של עוברי דג הזברה
1.1 הכנת העוברים
- איסוף עובר בשלבי ההתפתחות הנדרשים. אנא ראה קימל ואח'. 5 לתיאור שלב עוברי.
- הסר chorions באופן ידני באמצעות מלקחיים (מלקחיים השענים דומון לא. 5).
- תקן את העוברים בפתרון 4% מparaformaldehyde (PFA) המורכב ב PBS (בופר פוספט) הלילה ב 4 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול עם 50 עוברים לסל (לגן / לתנאי ניסוי) דפוס הביטוי של גן שניתן להשיג בניסוי אחד. כמעט כל העוברים מראים דפוסי ביטוי דומים לגן מסוים. דוגמאות מייצגות של במכתים הכלאה באתר מוצגות איורים 3-6.
riboprobes השכל ונגד התחושה היו מסונתז מcDNAs המתאים לPC5.1, PC5.2 6, 7, 8,9 SCL/tal-1 Gata-1, FLK / kdrl 10, 11 שש, dlx2 12, fkd7 / Foxa1 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו שיטות משופרות כדי להמחיש RNA עם רזולוציה גבוהה. בנהלי הכלאה באתר מתבצעים באמצעות סלי מחוייט פשוטים עם תחתית נקבובית (איור 1). עוברים מעובדים פתרונות RNase ללא שימוש בצלחות 6 גם בטמפרטורת חדר בתנאים סטריליים.
סלי עוברים להפריד עשויים מצינורות Eppendorf בצבעים שונים. סלסלות עם או בלי שפה משמשות להתמצאות קלה ולזהות את העוברים בתוך הסל כמקביל לבדיקה מסוימת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA- מקדם כפול pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ מיני ערכת טיהור פלסמיד | Invitrogen | K2100-01 | |
| אגרוז | רוש | 11 685 660 001 | |
| Not1 ואנזימי הגבלה HindIII | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| פנול רווי Buffer, | Invitrogen | 15513039 | יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לנקוט בזהירות בזמן הטיפול. |
| כלורופורם | פישר | C607-1 | רעיל וחשוד כמסרטן. עבוד מתחת למכסה המנוע. |
| DNAse ללא RNase I | Roche | 4716728001 | הכן מנות קטנות ואחסן בטמפרטורה של -20°C. |
| תערובת תיוג DIG-RNA עם Sp6, T7 ו- T3 RNA פולימראז | רוש | 11277073910 | |
| מעכב RNase | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M נתרן אצטט (pH 5.5) | פישר | 50-751-7355 | |
| 100% אלכוהול | אתנול אלכוהול מסחרי | ||
| דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) | סיגמא | 40718-25 מ"ל | DEPC הוא מגרה עיניים, עור ונשימה. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכה. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| מערכות אקווריום | מלח אוקיינוס מיידי | N/A | |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | מכינים ומאחסנים בטמפרטורה של -20° C כ-40 מ"ל אליקוטים לשימוש מאוחר יותר. PFA רעיל. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכת אבק. |
| פנילתיוקרבומיד (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC רעיל מאוד. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכת אבק. |
| מתנול | פישר | A947-4 | |
| דומונט (שען' s) דפוס מלקחיים מס '5 | מדע עדינים | ||
| אשכול תרבית תאים בעל שש בארות | Sarstedt | 83.1839 | |
| סלים עשויים רשת ניילון וצינורות אפנדורף | הכנה | להכנת הסלים, חותכים צינורות אפנדורף (1.5 מ"ל) עם או בלי חישוקים כדי להסיר את הקצה החרוטי. חותכים רשת ניילון לחתיכות קטנות המתאימות לגודל של הקצוות החתוכים של צינורות אפנדורף. מניחים צינורות עם רשת הניילון המכסה את הקצה החתוך על חשמל פלטה חמה עד שגם הצינור וגם רשת הניילון נדבקים זה לזה (מבצעים במכסה אדים). חותכים את עודפי הרשת מהסלים ומאחסנים אותם ב-100% מתנול עד לשימוש. | |
| פוליאוקסיאתילנסאורטן מונולאורט (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| פרוטאינאז K | Fermentas | EO0491 | |
| אצטי אנהידריד | סיגמא | 242845 | |
| טריאתנולאמין | סיגמא | 90279-100ML | |
| פורממיד, דרגת טוהר גבוהה | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 שרף | Bio Rad | 142-6424 | |
| חומצת לימון מונוהידראט | סיגמא | C0706-500G | |
| מלח נתרן | הפרין סיגמא | H3393-25KU | |
| חוצץ מלח-נתרן ציטראט (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA משמרי אופים מסוג X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide נטול מים (DMF) | Sigma | 227056 | מגרה, רעיל, דליק וחשוד לטרטוגן. טפל בלבוש בטיחות מתאים כולל כפפות ומשקפי מגן. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | הגן על תמיסה זו מפני אור. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | הגן על תמיסה זו מפני אור. |
| אלבומין מסרום בקר, שבר מטוהר V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| כבשים אנטי-דיגוקסיגנין-AP שברי פאב | רוש | 1093274910 | |
| גליצרול | סיגמא | G5516-500ML | |
| 96 בארות צלחות תרבית תאים | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| מערכות אקווריום | אוקיינוס מיידי | N/A |
מקורות
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
