תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו"ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.
מבוא
Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח "במבחנה" או "תרבות" ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק .3.5%. למרות המגמה להשתמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
סכמטי של הפרוטוקולים מודגם באיור 1.
1. תא ציפוי
פלייט תאים בצלחות 96, גם בצפיפויות ציפוי שונות (איור 2). לבדיקות ליניאריות בשורת תאי נוירובלסטומה N2a, 2.5k צלחת, 5k, 10k, 15k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. לבדיקות ליניאריות בתאי עצב בקליפת המוח עכברוש עיקרי, 25k צלחת, 50k, 100k, 200k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. אם שורות תאים או תאים ראשוניים של עניין נראים בריאים בצפיפויות שונות ציפוי, צלחת ובסביב צפיפות תאים האופטימלית עבור אותו סוג התא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגורם המגביל בריבית בניסויים אלה הוא הכתמים אדום, כמו assay ATP הוא יחסית קצר משך. למבחני אינפרא אדום, אנו צופים כי יכולים להיות מוכתמים שמונה צלחות 96 היטב וסרקו בתוך יום אחד על ידי שתי קבוצות מדהימות של ארבע צלחות כל אחד (ראה איור 1). הערכה זו מבוססת על ההנחה 20 דקות של קיבעון, 30 דקות של כביסה, 30 דקות של חסימה, 2 דגירה נוגדן ראשוני שעה ואחריו 30 דקות של שוטף, דגירה נוגדנים משני שעה 1 ואחריו 30 דקות של שוטף, 30 DRAQ5 דקות + ספיר ואחריו 30 דקות של שוטף, ו34 דקות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחות מאשר ה-ATP, מבחני DRAQ5 + ספיר ומבחני α-טובולין הם בהסכם טוב בכך שהם חושפים את ההשפעה המגנה ביותר של N-אצטיל ציסטאין. היה ירידה במינון תגובה של אות אינפרא אדום עם שני מבחני וכל שלוש עקומות הכדאיות הוזזו לי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אף אחד מהמחברים יש התנגשויות לחשוף.
תודות
אנו מכירים Juliann Jaumotte לרעיון של שמירה על הכרכים של חומרים כימיים בassay-ATP. אנחנו אסירי תודה לתמיכה ניהולית המעולה של מרי קארוזו, דב ווילסון וג'קי Farrer ולבית הספר לרוקחות Mylan למתן תמיכה כספית למחקרים אלו. תודה גם למחלות Hunkele המפחיד הקרן ופרקינסון והפרעות תנועת קרן לתמיכה הכספית שלהם מהמחקרים עצביים העיקריים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טיטר תא Glo | Promega | G7572 | קנה בכמויות של 100 מ"ל ומחיר, במקום לרכוש את הכמות היקרה יותר של 10 מ"ל. ניתן להקפיא מחדש ריאגנטים משוחזרים שאינם בשימוש ב-20 מעלות; C למשך 21 שבועות לפחות |
| 18% פורמלין | תרמו-שנדון | 9990244 | קניית קיבוע זה מונעת שקילה של אבקות פורמלדהיד והרתחה של התמיסה; חשיפה לאדים ממוזערת בכך |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S0389 | אין צורך להוסיף זאת לתמיסות פורמלדהיד אך זה משפר את מראה התאים הקבועים |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | ניתן לקנות את סרום הדגים הזה בכמויות גדולות ולהקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות; C לשימוש ארוך טווח |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | אנו מאחסנים תמיסת מלאי של 10% Triton-X 100 במים סטריליים בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| נתרן פוספט מונוביסיק | פישר | S468 | אפשר גם לקנות טבליות PBS או 10x פתרונות PBS, אבל הם יקרים יותר |
| נתרן פוספט דיבאסיק | פישר | S373 | ראה לעיל |
| נתרן אזיד (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | אל תקנו את האבקה כי נתרן אזיד רעיל מאוד. אנו מאחסנים את כל הנוגדנים המשומשים שלנו ב-1x נתרן אזיד ב-4 מעלות; C עד שהם מזוהמים בפסולת |
| עכבר אנטי-אלפא;-טובולין | סיגמא-אולדריץ' | T5168 | נוגדן זה יקר אך ניתן לדלל אותו מאוד והוא ספציפי מאוד |
| עכבר אנטי-MAP2 | סיגמא-אולדריץ' | M9942 | נוגדן זה יקר אך הוא ספציפי ביותר (תנאי מוקדם למערבונים בתוך התא) |
| 800 ננומטר עיזים נגד עכבר IgG | LI-COR | 926-32210 | חברות אחרות מוכרות גם נוגדנים משניים אינפרא אדום. הקפד לרכוש את הנוגדנים בעלי הספיגה הצולבת ושים לב שריכוזי ה-IgGs עשויים להשתנות בהתאם למקור |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | תרכובת זו נמכרה בעבר על ידי LI-COR ב-1 מ"מ |
| ספיר | LI-COR | 928-40022 | |
| לומינומטר | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| שייקר/מיקסר | מוצרי מחקר בינלאומיים | 248555 |
מקורות
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
