הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

39.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50671

⸱

1 בנובמבר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות 1 להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan 2.

תקציר

תאי פיטום ממלאים תפקידים חשובים במחל אלרגיות והגנה חיסונית נגד טפילים. לאחר הפעלה (למשל, על ידי אלרגן), הם degranulate, תהליך שתוצאת exocytosis של מתווכים אלרגיים. אפנון של degranulation תא תורן על ידי תרופות וtoxicants עשוי להיות השפעה חיובית או שלילית על בריאות אדם. תפקוד תא תורן כבר גזור בפירוט עם השימוש בתאי פיטום לוקמיה basophilic עכברוש (RBL-2H3), מודל מקובל של תא פיטום אדם רירי 3-5. מרכיב תורן תא גרגר והמתווך אלרגי β-hexosaminidase, אשר שוחרר לינארית בד בבד עם היסטמין מתאי פיטום 6, ניתן למדוד בקלות ובאופן אמין באמצעות תגובה עם מצע fluorogenic, מניב למדידה עוצמת הקרינה בassay microplate שניתן ל מחקרי תפוקה גבוהה 1. פורסם במקור על ידי Naal et al. 1, יש לנו להתאים assay degranulation זה להקרנה Oתרופות F ו toxicants ומדגים את השימוש בו כאן.

Triclosan הוא סוכן ספקטרום רחב נגד חיידקים שנמצא במוצרים צריכה רבים וכבר מצא להיות סיוע טיפולי במחלת עור אלרגית אנושית 7-11, למרות שהמנגנון להשפעה זו אינה ידוע. כאן אנו מדגימים assay להשפעת על triclosan degranulation תא תורן. לאחרונה הראו כי triclosan מאוד משפיע על תפקוד תא תורן 2. במאמץ להימנע משימוש בממס אורגני, triclosan מתמוסס ישירות לתוך המאגר מימית עם חום וערבוב, וריכוז כתוצאה הוא אישר שימוש בספקטרופוטומטריה UV-Vis (באמצעות ε 280 = 4200 L / M / ס"מ) 12. פרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של חומרים כימיים כדי לקבוע את ההשפעות שלהם על degranulation תא תורן, ובאופן רחב יותר, פוטנציאל אלרגי שלהם.

מבוא

תאי פיטום הם מאוד מגורענים מפעיל תאים חיסוניים המשמשים כמתווכים עיקריים באסטמה, אלרגיות, טפילים והגנת 13-16 היווצרות הסרטן. הם מתגוררים כמעט בכל רקמת vascularized 15, שבו הם בבטחה לאחסן מתווכים אלרגיים ודלקתיים בגרגרי cytoplasmic עד הופעלו לdegranulate. Degranulation הוא exocytosis של גרגרי קרום נכנסים, מה שגורם לשחרור של מתווכים פעילים פרמקולוגית כגון היסטמין, tryptase, ולאוקוטריאנים 15. תוצאות תהליך זה בתחילתו של הסוג אני תגובות רגישות יתר שהם קריטיים בהגנה מפני טפילי הרכבה, כמו גם ייזום תגובות אלרגיות, אסתמה, ומסרטנות 15.

תאי מאסט ובזופילים לבטא קולטנים FcεRI, הקולטנים גבוהה הזיקה לאימונוגלובולין E (IgE) 17. חשיפה לאלרגן או אנטיגן גורמת לצבירה של קולטנים FcεRI IgE בכריכות מרובים 17, וזה של זהO-נקרא "crosslinking" של קולטני Fc IgE בכריכות שיוזמת את תהליך degranulation: מפל של אירועי טירוזין זרחון, ההפעלה של פוספוליפאז C, זרימת הסידן מהחנויות פנימיות, וזרם של סידן לתוך התא 18. זרימת סידן זה היא הכרחי עבור degranulation, ועוד יותר, מאותתת היתוך גרגיר עם הקרום לפני גרימת exocytosis גרגר 15. בניסוי, ionophore סידן יכול לשמש לסיד מעבורת ישירות על פני קרום תא 19, שלמעשה עוקף את כל התמרה אות שלבים לפני שלב זרימת סידן 20, המאפשר את זיהוי של יעד על ידי מסלול toxicant כמו להיות במעלה הזרם או במורד הזרם של סידן איתות 20.

Degranulation ניתן למדוד במהירות וביעילות על ידי ניטור שחרורו של β-hexosaminidase לsupernatant התא, אשר שוחרר לינארית מהגרגרים לצד היסטמין 6, אבל אניזה הרבה יותר קל לזהות באמצעות תגובת אנזים-מצע וקורא microplate פשוט assay מוצר הניאון. assay microplate זה, כמפורט בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה שפותחה במקור על ידי חזקה Naal et al. 1, אשר מכמתת את המחשוף של מצע fluorogenic 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-β-D-β-glucosaminide ידי hexosaminidase. יש לנו שונה assay להשפעות של תרופות ובדיקת toxicants, עם triclosan מודגש כאן. שיטה זו אמינה מכמתת degranulation, הוא אלטרנטיבה זולה, למשל, שיטות זיהוי 21 המבוססים על תזרים cytometric, ויש לו הפוטנציאל להשאיל את עצמה יפה להקרנת תפוקה גבוהה של מגוון רחב של תרופות לטיפול באלרגיה, כמו גם immunotoxic או כימיקלים אלרגניים. הנקודה אחרונה זו חשובה במיוחד לאור בדיקת רעילות "2007 דו"ח המועצה הלאומי למחקר במאה ה -21: חזון וstrategy "(http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970), הפועל למען הפיתוח של בדיקות רעלים תפוקה גבוהה המנצלות תרבית תאים כדי להקטין את השימוש יקר של חיות מעבדה מסורתיות כגון עכברים. פרוטוקול degranulation שפותח על ידי Naal et al. 1 והותאם על ידינו 2, מנצל את שורת תאי RBL-2H3, שהוא מודל מקובל היטב הומולוגית לתאי פיטום ריריים אדם או בזופילים 3-5. (שיטות לתאי RBL-2H3 culturing מפורטות באצ'ינסון ואח'. 22). assay זה סביר יכול להיות מותאם לכל סוג תא תורן מצורף.

Triclosan (TCS) הוא מיקרוביאלית ספקטרום הרחב שהיה בשימוש כבר יותר מ -30 שנים בבתי חולים, מוצרי טיפוח, ומוצרים צריכה 23,24. אופן פעולה אופייני למיקרוביאלית של TCS הוא העיכוב של סינתזת חומצות שומן, ככל הנראה על ידי עיכוב enoyl-acylרדוקטאז מנשא חלבון 25,26. הוא נמצא בעולם במגוון רחב של מוצרים צריכה, כגון ג'ל רחצה, קרם ידי, משחת שיניים, מי פה, וסבונים ביד בריכוזים של עד 0.3% או 10 מ"מ 24. שימוש נרחב של TCS הביא רמות לגילוי בבני אדם וב27-29 נהרות ונחלים 30. מחקר שנעשה על ידי Allmyr et al. הוכיח כי 27 TCS ומטבוליטים שלה נמצאים גם הפלזמה וחלב מאמהות מיניקות. חשוב לציין, TCS נספג בקלות אל תוך העור 31-37. Queckenberg et al. ~ 37 מצאו קליטת 10% מ~ 70 מ"מ TCS קרם לעור אנושי בתוך 12 שעות, וכתוצאה מכך הריכוז משמעותי בעור, שבו תאי פיטום מתגוררים.

TCS הוכח קליני כדי לנהל את מחלת עור אלרגית אנושית 7-11, אבל המנגנון שבאמצעותו TCS מקל על מחלות עור אלרגיות כבר ידוע 38. שימוש detaile assay microplate הניאוןד בסרטון הזה, אנחנו לאחרונה הוכיחו כי TCS, בריכוזים נמוכים כמו 2 מיקרומטר, פוגם באופן משמעותי את תפקוד תא תורן וdegranulation, מתן הסבר פוטנציאל לנתונים קליניים אלה 2. בנוסף למתן הסבר לנתונים קליניים אלה, הממצאים שלנו בפאלמר et al. 2 מציעים לי TCS מטרות מולקולות איתות במורד הזרם של זרימת סידן. , TCS עלול להיות בשל חשיבותו של הסידן באיתות חיסונית רבים ותהליכים ביולוגיים אחרים השפעות שליליות על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים הדרושים. למעשה, Udoji et al. הראו כי 39 TCS מדכא פעילות תאי רוצח טבעית אנושית ממס, תפקוד מערכת החיסון מולדים חשוב נוסף.

מעבר לפוטנציאל שלה ככלי עזר טיפולי במחלת עור אלרגית (או, לחלופין, כimmunotoxicant), TCS יכול להיות גם האנדוקרינית משבש 40-49. לפיכך, נוהל ברור על איך להכין כימיקל זה בפתרון אנישל עניין לtoxicologists. בגלל TCS הוא מולקולה הידרופובי קטנה, כלי רכב אורגניים משמשים לעתים קרובות כדי להפוך אותו ליותר מסיס במים. ברוב המחקרים רעילות שבו TCS כבר נבדקו, הכנה כרוכה בפירוק במים בעזרת ממס אורגני כגון אתנול, אצטון, או שמן 2,50,51. עם זאת, לעתים קרובות פעמים ממסים אלה הן פעילים מבחינה ביולוגית את עצמם, ובכך סבכו את הפרשנות של הבדיקה כימי נתונים 51. למעשה, על פי Rufli et al. 52 ואחרים 53, מומלץ שפתרונות בדיקה לניסויים רעילות מים מוכנים באמצעות שיטות פיסיות על פני שיטות כימיות, בשל הפוטנציאל של ממסים כימיים כדי ליצור חפצים רעילות. יש לנו הראינו בעבר כי TCS מומס באתנול / מים (כרך / כרך) 0.24% וsonicated למשך 30 דקות dampens degranulation תא תורן RBL 2. אתנול בריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.24% הוכח לצנן degra תא תורןnulation 54,55-דוגמאות להשפעות שעלולים להיות המבלבלות של ממסים אורגניים על מחקרים רעילות.

לא רק שזה חשוב להביא בחשבון את ההשפעה של ממסים על האורגניזם או תאים המשמשים למחקר, אבל גם זה חשוב לעקוב אחר ההשפעה של ממס בכימי המבחן עצמו. לדוגמה, Skaare et al. מצאו כי 51 המסת TCS בפוליאתילן גליקול (נפוץ במשחות שיניים ושטיפת פה) נחלשו השפעות אנטי בקטריאלי ואנטי פלאק בנשים נשיות בריאים בזמן פירוק בשמנים נגרם אובדן תפקוד מלא. לכן, היכולת של ממסים שונים כדי לווסת toxicant וסמים, כולל TCS, אפקטים יש לשקול בעיצוב assay. שימוש בשמנים או תוספי טעם עלול להפריע את ההשפעות של TCS במוצרים שונים 50,51.

במאמץ למנוע את הצורך בשימוש בממסים אורגניים, שיפרנו על השיטה שלנו להמסת TCS 2 על ידי ביטול השימוש בסול אורגנילפרוק. בפרוטוקול הנוכחי, אנו לפזר גרגרי TCS ישירות לתוך המאגר מימית עם חום (≤ 50 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לוודא את הריכוז של מניית TCS זה על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis. שיפורים אלו אפשריים כי TCS הוא מסיס במים עד 40 מיקרומטר (http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf) והוכח להתנגד השפלה כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס (http:/ / Oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf) 56,57. יש לנו גם יתרון נוסף של ספקטרופוטומטריה UV-Vis, כמו TCS ידוע גם לקלוט חום ב280 ננומטר 58 עם מקדם הכחדה טוחנת של 4,200 ליטר / מול / 12 ס"מ.

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, אך יעילה לפזר גרגרי TCS למאגר ללא סיוע של ממס אורגני, ובכלל זה בעלות נמוכה ואימות מהירהריכוז, ומתאר assay microplate ניאון רב עוצמה למעקב אחר השפעות כימיות על degranulation תא תורן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שים לב שכל מתכוני החיץ כלולים בטבלה בסוף טקסט הפרוטוקול.

יום 1:

1. הכנת התאים

  1. לתכנן את 96 גם התקנת צלחת תכנית, שבמרכזה דגימות בדיקה בפריסה על מנת להימנע מהשפעות הקצה. להקצות שלוש משכפל עבור כל TCS ריכוז נבדק (± ממריץ degranulation של אנטיגן או ionophore), כמו גם triplicates לשחרור ספונטני (ללא ממריץ degranulation), שחרור מרבי (0.2% X-100 [טקסס] תמוגה חומר ניקוי טריטון), כמו גם בארות שמורות לדגימות רקע (שלא יכיל תאים). עבור כל יום ניסיוני לשכפל, לבחור פריסה אקראית חדשה מדגם ריכוזי TCS.
  2. תקשורת החמה RBL (מתכון קבוע בטבלה) וטריפסין ב37 ° C אמבט מים.
  3. בדקו תאי RBL בבקבוק T-25 (2-4 ימים מאז המעבר האחרון ופחות מ 3-4 חודשים מאז שהם מופשרים) לסימנים כלליים של לרפא טובה: pH התקין שצוין על ידי צבע של תקשורת, וחוסר עננות. מניחים את הבקבוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהבקבוק הוא נקי מזיהום ושהתאים נראים בריאים, ומחוברות כמו שצריך, ובעיקר מחוברים. שימו לב שתאים צריכים להיבדק לזיהום Mycoplasma בערך כל שישה שבועות 22.
טיפול Triplicates
מגורה, 0 מיקרומטר TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
מגורה, 0.001 מיקרומטר TCS F6, G6, H6
מגורה, 0.1 מיקרומטר TCS A4, B4, C4
מגורה, 1 מיקרומטר TCS A6, B6, C6
מגורה, 5 מיקרומטר TCS F5, G5, H5
מגורה, 10 מיקרומטר TCS A3, B3, C3
מגורה, 15 מיקרומטר TCS A5, B5, C5
מגורה, 20 מיקרומטר TCS F7, G7, H7
מגורה, בתוספת הגבוהה ביותר [TCS] F3, G3, H3
ספונטני, לא TCS (כולל לועג) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, ה-G8, H1, H2, H8
TX-100, לא TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
לא תאים, רקע, בתוספת הגבוהה ביותר [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-1
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

  1. קח את הבקבוק לתוך תא RBL רקמת סטרילית התרבות (TC) מכסה המנוע. התאים מחוברים לבוטטום של הבקבוק. עבודה מתחת למכסת מנוע TC ובאמצעות טכניקה סטרילית סטנדרטית, להסיר את כל התקשורת מבקבוק עם פיפטה סטרילית; התאים נשארים מחוברים לחלקו התחתון של הבקבוק. בשלב הבא, יש לשטוף בקבוק עם טריפסין 2 מ"ל, ואז להשליך לשטוף את זה.
  2. הוסף טריפסין מ"ל בדיוק 2 כדי לכסות את תחתית הבקבוק. הכניס לתוך 37 ° C בחממה במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מהחלק התחתון של הבקבוק.
  3. לאחר 5 דקות, פגע בצדו של הבקבוק עם כף יד פתוחה כדי לשחרר את התאים. באופן מיידי, להוסיף מדיה 18 מ"ל RBL כדי לשטוף את תאי הבקבוק וכדי להרוות את טריפסין. מייד לקחת את תערובת תא מדיה טריפסין מהבקבוק ולהעביר לצינור חדש, סטרילי 50 מ"ל (הנפח הכולל בצינור הזה הוא עכשיו 20 מ"ל).
  4. לאחר הערבוב בעדינות אך ביסודיות, להסיר 50 μl של השעיה תא מהצינור הזה, ולהעביר לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי microcentrifuge, שהוא מדגם שנספר. קח מדגם זה, כמו גם 50 מ"ל0; צינור המכיל תערובת תאים-Media-טריפסין מתוך מכסה המנוע TC לbenchtop.
  5. לסובב את צינור מיליליטר 50 בצנטריפוגה (עם איזון ראוי) עבור 8 דקות ב XG 500; ביעילות תאי כדורי כוח הזה.
  6. במהלך זמן הספין, לספור את התאים במדגם שבודדו לפני ספינינג. כדי לעשות זאת, ראשון להוסיף 50 μl של trypan כחול צבע ל50 μl של תאים בצינור 1.5 מ"ל, ובעדינות אך ביסודיות פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב 5x. באופן מיידי, להעביר 10 μl של תערובת זו לhematocytometer הזכוכית, וספירת תאים באזור הרשת בעקבות הוראות יצרן. לספור לפחות 100 תאים לתוצאות סטטיסטיות סבירות.
  7. חזרה במכסת מנוע TC, להסיר supernatant מהתאים שהסתחררו כלפי מטה.
  8. שווי צינור התא, וקפיץ גלולה בחלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את התאים.
  9. הוסף מדיה לתאי trypsinized להניב צפיפות של 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל, המבוסס על ספירת התאים.
  10. מערבבים היטב אך בעדינות כדי לשמור על תאים מושעים במהלך הליך הציפוי. שימוש Pipetman, לשים 100 תאי μl / גם בצלחת 96 היטב (בחלק תחתון שטוח, שחור), בעקבות גיליון תבנית הצלחת. האקראי כמה תאים נוספים לבארות כדי למנוע טעות שיטתית, ומערבב אחרי כל קבוצה של שלוש בארות נוסף. הקפד לא לשים את התאים לתוך הבארות שכותרתו עבור דגימות הרקע.
  11. ברגע שכל התאים הועברו, הנח את מכסה הצלחת לצלחת, ולהעביר לחממה (CO 2 37 ° C / 5%) למשך הלילה. לנקות בעקבות טכניקה סטרילית סטנדרטית.

יום 2:

2. הכנת Triclosan

  1. שימוש בגליל, מאגר מדד מדורג 250 מיליליטר Tyrodes (מתכון קבוע בטבלה) לתוך בקבוק 500 מיליליטר Erlenmeyer שכותרתו "TCS-חיץ". הוסף לעורר הבר. השתמש בכלי זכוכית, מערבבים הבר, מדחום מיועד לשימוש עם TCS בלבד.
  2. גם בשלב זה, מדד 250Tyrodes מ"ל לתוך בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer נפרד, שכותרתו "חיץ שליטה". זכוכית שימוש, מערבבים הבר, מדחום שאינם מיועדים לTCS. הוסף לעורר הבר.
  3. לשקול את 0.0022 גרם של גרגירי TCS ולהעביר לבקבוק "TCS-חיץ" (המכיל 250 מיליליטר Tyrodes מאגר). על מנת להעביר גרגרי יעילות לבקבוק Erlenmeyer, השתמש 10 מ"ל מ250 מ"ל שנמדד Tyrodes כדי לשטוף לשקול סירה, כדי לוודא שכל TCS כבר הועבר.
  4. מקום בקבוק "TCS-חיץ" על גבי פלטה חמה שילוב / צלחת ומערבבים מגנטית, ולהגדיר אותו כדי לעורר במהירות manageably גבוהה. ברגע שגם מעורב, מניית TCS זה נומינלי תהיה 30 מיקרומטר (ריכוז בפועל יחושב לאחר חימום). (האם כל הערבוב במנדף כימי.)
    1. גם בשלב זה, למקם את בקבוק "שליטת החיץ" (המכיל שום TCS) על גבי פלטה חמה / צלחת ומערבבים שנייה שילוב מגנטי, ולהגדיר אותו כדי לעורר במהירות דומה.
  5. הפעל מנורת UV / Vis לחמם את המנורה לשימוש מאוחר יותר.
  6. מחממים את הפתרון "TCS-החיץ" עד 50 ° C תוך ערבוב מתמיד. פעם אחת עד לטמפרטורה, זמן של 90 דקות. במהלך 90 דקות, ימשיך לעקוב אחר 50 ° C טמפרטורה ומהירות מתאימה ערבוב לעתים קרובות.
    1. במקביל, מחמם את הפתרון "שליטת החיץ" (שהוא רק 250 מ"ל של חיץ Tyrodes רגיל) ל -50 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף. לאחר שהגיע 50 מעלות צלזיוס, זמן של 90 דקות, שבמהלכו טמפרטורת הזמן (שמירה על 50 מעלות צלזיוס) וערבוב שניהם תחת פיקוח.
  7. בסוף 90 דקות, לקחת שתי צלוחיות Erlenmeyer את הצלחות וההעברה לbenchtop החמות.
  8. שימוש בפונקציית סריקת אורך הגל בספקטרופוטומטר UV / יס, ריק במכונה על 1 מ"ל של הפתרון המחומם "שליטת החיץ" לפני סריקת 1 מ"ל של תמיסה מחוממת "TCS-חיץ". בדקו את הצורה של הקשת,ערך ספיגה שיא ד ב 280 ננומטר. כדי לקבוע את הריכוז, השתמש במשוואת באר למברט (280 = 280 ε ℓ ג) באמצעות ε 280 של 4200 ליטר / מול / 12 ס"מ וℓ של 1 ס"מ.
  9. לאחר קביעת ריכוז TCS, להוסיף 0.249 גרם אלבומין בסרום שור (BSA) ל249 מ"ל הנותר של הפתרון "TCS-החיץ", ומערבבים היטב.
    1. במקביל, מוסיף 0.249 גרם לBSA 249 מ"ל הנותר של פתרון "שליטת חיץ", ומערבבים היטב.

יום 2:

3. אנטיגן מגורה Assay degranulation באמצעות תאי RBL-2H3

  1. לפני שמתחיל, בדוק את ה-pH של כל המאגרים בשימוש, ולהבטיח כי הם ברורים ולא מעונן: זה כולל חיץ Tyrodes, חיץ נתרן אצטט, וחיץ קרבונט גליצין (מתכונים מפורטים בטבלה).
  2. תקשורת חמה RBL וטריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. הפוך BT (1 מ"ג / מ"ל0; BSA בTyrodes חיץ): 0.05 G BSA + 50 מיליליטר Tyrodes חוצץ (X2). הכניס לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  4. הפוך 0.2% טריטון X-100: 3.136 מ"ל של BT + 64 μl של 10% טריטון X-100 (ריכוז סופי של טריטון X-100 הוא 0.2%). מערבבים היטב על ידי היפוך, אבל לא מערבולת. הכניס לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  5. התחל הכנת חיץ Tyrodes המחומם (צעדים "2" לעיל) הערה TCS ו:. אל תתחיל את הצעד הבא (חשיפת IgE) עד "TCS-החיץ" ופתרונות "בקרת חיץ" להגיע ל -50 מעלות צלזיוס, ומערבבים במשך 70 דקות הראשונה של זמן חום 90 דקות / ערבוב.
  6. ברגע ששני פתרונות כבר עוררו על 50 מעלות צלזיוס במשך 70 דקות, לפצות 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי DNP עכבר IgE (סיגמא) בתקשורת RBL לדוגמה בארות להיות רגיש (100 μl / טוב). IgE המניות לא צריכה להיות מבוגרות יותר מ -30 ימים שבם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס; להקליט בן כמה המניות היא. פליק לערבב, אבל לא לעשות IgE מערבולת.
  7. מתחת למכסת מנוע TC,להוסיף 0.6 IgE מניית μl (המניות היא 1 מ"ג / מ"ל) לתקשורת RBL מ"ל 6 בצינור 50 מ"ל. בתוך צינור מ"ל 50 שניות, להוסיף 6 מ"ל של תקשורת RBL רגיל בלבד (אשר מיועד לדגימות nonsensitized).
  8. לזרוק את כל המדיה מצלחת 96 היטב (שהוכן ביום 1) לכיור, ולהביא את הצלחת מתחת למכסת מנוע TC.
  9. באופן אקראי להוסיף 100 תקשורת μl / תערובת IgE לבארות שצריכים להיות מגורה (סה"כ 48 בארות). תערובת זו אינה מיועדת ל" ספונטנית "," טקסס ", ודגימות" רקע ".
  10. באופן אקראי להוסיף 100 תקשורת RBL רגיל μl רק "טקסס", "הספונטנית", ובארות "רקע".
  11. לשים מכסה צלחת על צלחת, ולאחר מכן לעבור לצלחת 5% CO 2/37 ° C בחממה במשך שעה 1.
  12. במהלך הדגירה שעה 1, בצע את השלבים 3.13-3.24.
  13. על benchtop, להכין את דילולים אנטיגן. הוסף 0.53 μl של DNP-BSA + 850 μl 1.6 מ"ג / מיליליטר המניות & #160; BT כדי לקבל ריכוז של אנטיגן 1 מיקרוגרם / מ"ל. וורטקס ולהפוך מניית לערבב.
  14. פעם אחת "TCS-החיץ" ו" חיץ שליטה "כבר מחוממים ולאחר מכן עוררו עבור 90 דקות ב -50 מעלות צלזיוס, להמשיך עם שאר ההכנות לפרוטוקול TCS (ללכת לצעדים 2.6 - 2.8.1). לאחר BSA הוא נמס לתוך שני פתרונות, תמשיך בהמשך.
  15. להתחיל בהכנת מאגרי החשיפה, עם ± Ag, ± TCS. ראשית, ממדגם 249 מ"ל של פתרון "TCS-חיץ" (שחומם כבר ועורר על 90 דקות), העברת 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. הסר μl 20 של 50 מיליליטר aliquot הזה ולהחליף אותו עם 20 μl של אנטיגן מיקרוגרם / מ"ל ​​1 מוכן קודם לכן לריכוז סופי של אנטיגן 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNP-BSA. וורטקס ולהפוך.
    1. תווית זו "צינור 1, גבוה TCS / + Ag / + BT." הוא משמש לדילולים וחשיפת הריכוז הגבוה ביותר TCS.
  16. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור 50 מ"ל חדש. הסר μl 20 של aliquot 50 מ"ל החדש ולהחליף עם 20 μl של אנטיגן מיקרוגרם / מ"ל ​​1 מוכן קודם לכן לריכוז סופי של אנטיגן 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNP-BSA. וורטקס ולהפוך.
    1. תווית "צינור 2, לא TCS / + Ag / + BT" הזה. משמש לדילולי TCS ו0 חשיפת ריכוז TCS מיקרומטר.
  17. עכשיו קח את 50 מ"ל של תמיסה "TCS-חיץ" והכניס לתוך שפופרת 50 מ"ל אחר. הסר μl 20 מaliquot 50 מ"ל החדש ולהחליף אותו עם 20 μl של BT רגיל. וורטקס ולהפוך. הוא הוסיף שום אנטיגן.
    1. תווית זו "תחתית 3, גבוהה TCS / לא Ag / + BT." זה משמש עבור רקע.
  18. העבר את 50 מ"ל של תמיסה "שליטת חיץ" לצינור 50 מ"ל אחר. קח את 20 μl מזה ne aliquot w 50 מ"ל ולהחליף אותו עם 20 μl של BT רגיל. וורטקס ולהפוך. (אין Ag הוא הוסיף.)
    1. תווית זו "צינור 4, לא TCS / לא Ag / + BT." זה משמש עבור רקע ודגימות ספונטניות.
BSA TCS אנטיגן
צינור 1 figure-protocol-2 גבוה [] figure-protocol-3
צינור 2 figure-protocol-4 לא figure-protocol-5
צינור 3 / "Width =" files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/> גבוה [] לא
צינור 4 figure-protocol-6 לא לא
  1. לחשב ולהקליט את כרכים לדילולים לאחר קביעת הריכוז של מניית "TCS-החיץ". סה"כ נפח לכל ריכוז דילול צריך להיות 1 מ"ל וצריך להיות מוכן בצינור microcentrifuge סטרילי. השתמש P2 המכויל וP1000 Pipetman.
התרכזות גבוה Triclosan + + Tyrodes BSA 0.0004 מיקרוגרם / מ"ל Ag
(שפופרת 1 מלמעלה) 		מחומם מיקרוגרם .0004 / מיליליטר Ag BT
(צינור 2 מלמעלה)
20 מיקרומטר
15 מיקרומטר
10 מיקרומטר
5 מיקרומטר
1 מיקרומטר
0.1 מיקרומטר
0.001 מיקרומטר
0 מיקרומטר (החלק העליון של צלחת) ----------------------- 500 μl μl בתוספת עוד 500
0 מיקרומטר (חלק תחתון של צלחת) ----------------------- 500 μl μl בתוספת עוד 500
  1. לאחר הדגירה IgE 1-HR, לקחת צלחת מהחממה ולזרוק את כל המדיה לתוך כיור. (הערה: אם ידועים כימיקלים בדיקה להיות רעיל יותר את המוצר לצרכן TCS, סילוק פסולת מסוכן עשויה להיות נחוצה.)
  2. שימוש Combitip, באופן אקראי לשטוף תאים בצלחת 96 היטב עם BSA-Tyrodes חוצץ (200μl / טוב). שחרר את החיץ לשטוף על הצדדים של הבארות, ולא ישירות על גבי התאים המצורפים, על מנת להימנע מלהפריע לתאים המצורפים. חזור על התהליך בפעם שנייה.
  3. כדי להכין את הטיפולים ליישום, מערבולת ולהפוך דילולים ממש לפני בנוסף לצלחת.
  4. החל עם החלק העליון של הצלחת: אקראי להוסיף triplicates של 200 μl כל אחד מפתרונות אנטיגן (עם ריכוזים נכונים של TCS) לבארות המתאימות. המשך לתחתית צלחת. הוסף פתרון "שליטת חיץ" בתוספת Ag (מתוך "צינור 2" לעיל) לכל "הלועגים" בצלחת.
  5. הוסף 200 μl של פתרונות מתאימים לבארות מתאימות:
    1. הוסף μl 200 בארות X-100 ל" טקסס ", המיועדים 0.2% טריטון.
    2. לאחר מכן, להוסיף 200 μl של צינור 3 ל3 הבארות שכותרתו "רקע (BkgD) TCS-הגבוה ביותר" על הצלחת.
    3. לבסוף, להוסיף 200 μlשל צינור 4 עד 6 בארות שכותרתו "ספונטנית".
  6. דגירה את הצלחת במשך שעה 1 ב 37 ° C / 5% CO 2.
  7. במהלך הדגירה שעה 1: קבל שני דליים של קרח (אחד לצלחת "ישנה" בחממה ואחד לצלחת חדשה). הפשירו 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-beta-D-glucosaminide (4-MU) בטמפרטורת חדר למשך עד 40 דקות, שמירה בנייר הכסף כי זה רגיש לאור.
    1. לאחר 4-MU המניה מופשר, להמציא פתרון 4-MU עובד: 150 מניות μl + 14.85 מ"ל של חיץ אצטט קר (מתכון נתון בטבלה); מערבולת והפוך. שמור ב50 צינור צנטריפוגות מ"ל, עטוף בנייר כסף, ועל קרח עד לשימוש.
    2. שימוש Combitip, באופן אקראי להוסיף פתרון עובד 4-MU קר μl 100 לחלק התחתון ביותר של כל טוב של ניו גרנייה שחורה צלחת 96 היטב (על קרח דלי # 2). ראשון להתחיל על ידי הוספת הפתרון עובד באופן אקראי בחלק העליון של הצלחת, באופן אקראי בתחתית הצלחת, באופן אקראי בתוך טריטון X-100 בארות,ולבסוף באופן אקראי בתוך בארות רקע.
    3. קבל את התיבה חדשה של P200 טיפים לשלב הבא.
  8. בסוף הדגירה 1-HR, לשים תא צלחת מן החממה אל דלי קרח # 1, פיפטה supernatant למעלה ולמטה 4-5x (בעדינות, לא החדרת בועות), מסתובב גם לערבוב טוב, אבל לא נוגע בתאים תוך כדי ערבוב . באופן שיטתי, להוציא 25 מדגם μl מכל טוב ומקום לצלחת החדשה עם מצע (באותו סדר של דגימות, כפי שתוכנן במקור לצאת). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב מדגם באופן יסודי, כאשר בבאר חדשה, ללא החדרת בועות.
  9. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2.
  10. לאחר הדגירה 30 דקות, באופן אקראי להוסיף 200 μl של גליצין-קרבונט חיץ קר בכל טוב (באמצעות Combitip) כדי למלא את הבארות עד 325 סך הכל μl. (הפוך תוספת זו לטריטון X-100 דגימות שעברה, כדי למנוע זליגת טריטון X-100). בדקו אם יש בועות לפני קריאת צלחת (לתקוע עם P10 pipet הנקיte טיפ פופ כל בועות).
  11. הפעל את הצלחת בקורא צלחת הקרינה (ללכת לסעיף 4).

יום 2:

4. הוראות קורא צלחת ניאון וניתוח נתונים

  1. פתח Gen5 תכנית, וסעיף ניסוי פתוח.
  2. הפעל קורא צלחת וצלחת כנס (פינה שמאלית העליונה היא A1).
  3. פרוטוקול figure-protocol-7 נוהל figure-protocol-8 קראו להגדיר קריאות מותאמות אישית. אל תוסיף שום דבר על דגימות, משכפל, וכו ', על מנת לאסוף נתונים הקרינה גלם מכל טוב.
  4. תחת "לקרוא" לבחור "הקרינה", "נקודות קצה", "מהירות נורמלית", "רווח 40", "עירור 360/40", "פליטה", עמדת אופטיקה 460/40: 50% למעלה. למעלה אופטי קוזז: 7 מטרמ '. לא ללחוץ, אין עיכוב, אין קינטיקה, לא לפקח היטב, טמפרטורה: חממה לדרך.
  5. בחר תחתון שחור שטוחה, צלחת 96 היטב (96 גרנייה היטב, תחתית שטוחה).
  6. עסקה עם פריסת הצלחת: פרוטוקול figure-protocol-9 פריסת צלחת. הגדר את הדגימות מבלי לציין חוזר, דילולים וכו '
  7. צלחת figure-protocol-10 לקרוא.
  8. שמור את הקובץ: לחץ על הכפתור "אקסל", שייצא קובץ הנתונים ל-Excel. האם זה עבור פריסה וצלחת למטריצה. שמור את הקובץ במחשב ועל כונן USB.
  9. ב-Excel, לחסר קריאה הממוצעת רקע מכל מדגם, כולל טריטון X-100 בארות.
  10. חישוב% degranulation היחסי על ידי חלוקת כל ערך (שכבר היה נגרע רקע) על ידי הערך הממוצע טריטון X-100, ולאחר מכן להכפיל ב -100 כדי לעשות את זה באחוזים.
  11. ממוצע של כל triplicates, ולחשב סטיית תקן. נתוני גרף בExcel כאומרים ערכי ± סטיית תקן. לבדיקה סטטיסטית, לעבור עכשיו לתוכנה על ידי פריזמה GraphPad.

יום 2:

5. Assay degranulation מגורה ionophore באמצעות תאי RBL-2H3

  1. עקוב פרוטוקול ל" הכנת התאים "(סעיף 1, יום 1) ו" הכנת triclosan" (סעיף 2, יום 2), כפי שהורה לעיל. דוגמא פריסת הצלחת לגירוי ionophore מוצגת למטה.
טיפול Triplicates
מגורה, 0 מיקרומטר TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
מגורה, 0.001 מיקרומטר TCS F6, G6, H6
מגורה, 0.01 מיקרומטר TCS F3, G3, H3
מגורה, 0.1 מיקרומטר TCS A4, B4, C4
מגורה, 1 מיקרומטר TCS A6, B6, C6
מגורה, 5 מיקרומטר [TCS F5, G5, H5
מגורה, 10 מיקרומטר TCS A3, B3, C3
מגורה, 15 מיקרומטר TCS A5, B5, C5
מגורה, 20 מיקרומטר TCS F7, G7, H7
ספונטני, עם DMSO, לא TCS (כולל לועג) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, ה-G8, H1, H2, H8
TX-100, עם DMSO, לא TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
ללא רקע תאים, עם DMSO, בתוספת הגבוהה ביותר [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-11
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

  1. לפני שמתחיל, בדוק את ה-pH של כל המאגרים בשימוש, ולהבטיח כי הם ברורים ולא חלקית. Tyrodes, חיץ נתרן אצטט, וגליצין קרבונט חיץ (מתכונים מפורטים בטבלה).
  2. הכן 50 מיליליטר צינור חרוטי אחד של BT על ידי הוספת 0.05 גרם לBSA חיץ 50 מיליליטר tyrodes ועל ידי vortexing לערבב היטב. דגירה של 37 ° C אמבט מים.
  3. הפוך 0.2% טריטון X-100 עם 0.0032% DMSO (ריכוז רכב ionophore סידן הסופי) על ידי הוספת 96 μl של 10% טריטון X-100-4.704 מ"ל BT. מערבבים היטב. בשלב בא, להוציא 0.155 μl של פתרון זה וזורקים. עכשיו להוסיף בחזרה ב0.155 μl של 100% DMSO.
  4. הכן מלאי 5 מ"מ (2.5 מ"ג / מ"ל) של A23187 ionophore מאבקה על ידי הוספת 400 μl של 100% DMSO הטרי לתוך בקבוקון ionophore וvortexing לערבב. פעם אחת בתמיסה,להעביר לצינור 1.5-מיליליטר חרוטי, תוכן תקליטים ותאריך של היום ופקיעת (3 חודשים מהכנה כאשר הם מאוחסנים כיאות ב -20 ° C).
    1. לחלופין, אם באמצעות מניות קפוא היום, הפשרה על קרח, ולבדוק שionophore 5 מ"מ A23187 הוא גם מעורב וברור. וורטקס, קפיצי, ולהפוך מניית הזו לפני השימוש. מועד קובע של הכנה ולוט # של A23187 זה.
  5. פעם אחת "TCS-חיץ" ו" חיץ שליטה "כבר מחוממים ובחש עבור 90 דקות, תמשיך את שאר ההכנות לפרוטוקול TCS (ללכת לצעדים 2.6-2.8.1). לאחר BSA הוא מעורבב היטב לתוך שני פתרונות, המשך בשלבי הפרוטוקול הנותרים.
  6. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "TCS-חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. הסר 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל ולהוסיף 1.8 μl של 5 מניות ionophore מ"מ. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. ריכוז ionophore סופי הוא 180 ננומטר. שימו לב שזה ריכוז של A23187 ישתנה בהתאם לעוצמת מניית, ותגובת מינון ionophore A23187 מומלצת לזהות ריכוז של A23187 שמעורר רמת degranulation של בערך 20% שחרור מקסימאלי, שזוהה כnoncytotoxic לRBL-2H3 תאים על ידי assay cytotoxicity (ראה סעיף 2).
    1. תווית זו "צינור 1, גבוה TCS / + ionophore / + BT." המשמש לדילולים וחשיפת הריכוז הגבוה ביותר TCS.
  7. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל ולהוסיף חזרה ב1.8 μl של 5 מניות ionophore מ"מ. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. ריכוז ionophore סופי הוא 180 ננומטר.
    1. תווית זו "צינור 2, לא TCS / + ionophore / + BT." זה משמש לדילולים ו 0 ריכוזי TCS מיקרומטר.
  8. מן המדגם 249 מ"ל של R 20; פתרון "TCS-חיץ, להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl של aliquot 50 מ"ל החדש ולהוסיף 1.8 μl של 100% DMSO. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x; לא ionophore הוא הוסיף.
    1. תווית זו "תחתית 3, גבוהה TCS / לא ionophore / + BT / DMSO +", המשמשת רקע.
  9. מן המדגם 249 מ"ל של פתרון "שליטת חיץ", להעביר 50 מ"ל לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש. להוציא 1.8 μl מaliquot 50 מ"ל החדש ולהוסיף 1.8 μl של 100% DMSO. מערבולת 3x עבור 8 שניות ולהפוך 3x. הוא הוסיף לא ionophore.
    1. תווית זו "צינור 4, לא TCS / לא ionophore / + BT / DMSO +", המשמשת דגימות שחרור ספונטניות.
BSA TCS Ionophore הוסיף 100% DMSO
צינור 1 "Src =" "width =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/> גבוה [] figure-protocol-12 לא
צינור 2 figure-protocol-13 לא figure-protocol-14 לא
צינור 3 figure-protocol-15 גבוה [] לא figure-protocol-16
צינור 4 figure-protocol-17 לא לא אק סימן "עבור: תוכן-width =" 0.1 ב" src = "" width = "/ files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px" />
  1. לחשב ולהקליט את כרכים לדילולים לאחר קביעת הריכוז של מניית "TCS-החיץ". השתמש P2 המכויל וP1000 Pipetman. סה"כ נפח לכל ריכוז דילול צריך להיות 1 מ"ל, וצריך להיות מוכן בצינור microcentrifuge סטרילי:
התרכזות גבוה Triclosan + + Tyrodes BSA 180 ננומטר A23187 (שפופרת 1 מלמעלה) מחומם BT 180 ננומטר A23187 (צינור 2 מלמעלה)
20 מיקרומטר
15 מיקרומטר
10 מיקרומטר
5 מיקרומטר
1 מיקרומטר
0.1 מיקרומטר
0.001 מיקרומטר
0 מיקרומטר (החלק העליון של צלחת) ---------------------------------- 500 μl μl בתוספת עוד 500
0 מיקרומטר (חלק תחתון של צלחת) ---------------------------------- 500 μl μl בתוספת עוד 500
  1. קח את התאים מצופים אתמול מחוץ לחממה, ואת המדיה ריקה לכיור. שימוש Combitip, באופן אקראי לשטוף תאים בצלחת 96 היטב עם BT (200 μl / טוב). חזור על לשטוף בפעם שנייה.
  2. כדי להכין את הטיפולים ליישום, מערבולת ולהפוך דילולים ממש לפני בנוסף לצלחת. החל עם החלק העליון של הצלחת: אקראי להוסיף triplicates של 200 μl כל אחד מן הריכוז הנכון של TCS לcorresponding היטב. המשך לתחתית צלחת. הוסף פתרון "שליטת חיץ" בתוספת A23187 (מתוך "צינור 2" לעיל) לכל "הלועגים" בצלחת.
  3. הוסף 200 μl של פתרונות מתאימים לבארות מתאימות:
    1. הוסף μl 200 בארות X-100 ל" טקסס ", המיועדים 0.2% טריטון.
    2. לאחר מכן, להוסיף 200 μl של צינור 3 ל3 הבארות שכותרתו "רקע (BkgD) TCS-הגבוה ביותר" על הצלחת.
    3. לבסוף, להוסיף 200 μl של צינור 4 עד שש בארות שכותרתו "ספונטנית".
  4. דגירה את הצלחת במשך שעה 1 ב 37 ° C / 5% CO 2.
  5. במהלך הדגירה שעה 1: קבל שני דליים של קרח (אחד לצלחת "ישנה" בחממה ואחד לצלחת חדשה). הפשירו 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-beta-D-glucosaminide (4-MU) בטמפרטורת חדר למשך עד 40 דקות, שמירה בנייר הכסף כי זה רגיש לאור.
    1. לאחר 4-MU המניה מופשר, לפצות 4-MU העבודה solutiב: 150 מניות μl + 14.85 מ"ל של חיץ אצטט קר (מתכון נתון בטבלה); מערבולת והפוך. שמור ב50 צינור צנטריפוגות מ"ל, עטוף בנייר כסף, ועל קרח עד לשימוש.
    2. שימוש Combitip, באופן אקראי להוסיף פתרון עובד 4-MU קר μl 100 לחלק התחתון ביותר של כל טוב של ניו גרנייה שחורה צלחת 96 היטב (על קרח דלי # 2): ראשון להתחיל על ידי הוספת הפתרון עובד באופן אקראי בחלקו העליון של צלחת, באופן אקראי בתחתית הצלחת, באופן אקראי בתוך טריטון X-100 בארות, ולבסוף באופן אקראי בתוך בארות רקע.
    3. קבל את התיבה חדשה של P200 טיפים לשלב הבא.
  6. בסוף הדגירה 1-HR, לשים תא צלחת מן החממה על קרח דלי # 1, פיפטה supernatant למעלה ולמטה 4-5x (בעדינות, לא החדרת בועות), מסתובב גם לערבוב טוב, אבל לא נוגע בתאים תוך כדי ערבוב . באופן שיטתי, להוציא 25 מדגם μl מכל טוב ומקום לצלחת החדשה עם מצע (באותו סדר של samples, כפי שתוכנן במקור לצאת). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב מדגם באופן יסודי, כאשר בבאר חדשה, ללא החדרת בועות.
  7. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2.
  8. לאחר הדגירה 30 דקות, באופן אקראי להוסיף 200 גליצין-קרבונט חיץ קר μl לכל טוב (באמצעות Combitip) כדי למלא את הבארות עד 325 סך הכל μl (להפוך את זה בנוסף לטריטון X-100 הדגימות האחרונות, כדי למנוע זליגת טריטון X-100). בדקו אם יש בועות לפני קריאת צלחת (לתקוע עם נקי P10 פיפטה קצה כדי לפוצץ את כל בועות).
  9. הפעל את הצלחת בקורא צלחת הקרינה (עקוב אחר כל השלבים בסעיף 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, את ספקטרום ספיגת UV-Vis לTCS מייצר עקומה חזקה, חלק בין ~ 260 ו 300 ננומטר, עם שיא ב 280 ננומטר, כפי שמוצגת באיור 1. ספקטרופוטומטריה UV-Vis היא, אפוא, כלי חשוב שיכול להיות מנוצל לחישוב ריכוז, שכן מקדם הקליטה הטוחנת שפורסם ב 280 ננומטר הוא 4,200 ליטר / מול / 12 ס"מ. מצאנו כי TCS אינו נופל מפתרון במסגרת הזמן של ניסוי degranulation כולו, לאחר 50 ° C החימום (מידע לא מוצג).

לאחר השימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשנת 2004, Naal et al. 1 פיתחה biosensor תא תורן לבדיקת תפוקה גבוהה של degranulation. זה assay חזק שיש לנו להתאים ללימודי TCS ומפורט בסרטון זה. לפני Naal et al. Assay 1, degranulation תא תורן היה להעריך באופן שגרתי באמצעות 59-61 β-hexosaminidase, אבל השיטות המוקדמות אלה מנוצלים fluorometers שבדגימה אחת הייתה לקרוא בכל פעם. חשוב לציין, Naal et al. הקונקורדנציה ישירה שנוצרה בין השיטה שלהם יותר התפוקה גבוהה תוך שימוש בקורא microplate והשיטה הקוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לנו מה למסור.

תודות

LMW וRHK נתמכים על ידי בית הספר למוסמכים של UMaine של מדע והנדסה (GSBSE) ביו רפואית; RHK נתמכה גם על ידי החקלאית מיין ותחנת ניסוי יער. מימון נוסף מסופק על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה כללי (NIH P20-GM103423), מיין והחקלאי תחנת ניסוי יער (גרנט מספר ME08004-10, פצ"ר), אוניברסיטת ADVANCE מיין Rising Tide מרכז (NSF גרנט # 1,008,498) , ומענק מחקר Starter בפרמקולוגיה / טוקסיקולוגיה מן היסוד PhRMA (פצ"ר). אנו מודים בני הזוג. דוד Holowka וברברה ביירד לאנטיגן ותאים. אנו אסירי תודה לחינה Hashmi, אלחנדרו ולז, ואנדרו Abovian לעזרה עם ציוד והזמנות. זה מיין חקלאי & יער מספר פרסום תחנת ניסוי 3311.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות

RBL-2H3 Cells

ATCCp align="center">CRL-2256

התאים שבהם השתמשנו היו מתנה, אך הם זמינים גם מ-ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

יש לאחסן בסביבת לחות נמוכה

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

לונזה מדעי הביולוגיה

17-518

אלבומין, סרום בקר

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; תמיסה של 10%)

פירס

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

מגנזיום כלוריד

VWRp align="center">BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

סידן כלורי דיהירדאט

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

עטוף בנייר כסף – רגיש לאור

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

למגיב יש ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. Aliquot 25 µ l  של מגיב לצינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים ופרפילם. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C שאינם בשימוש ומאחסנים aliquot שנמצא בשימוש ב-2-8 ° C למשך לא יותר מחודש.

DNP-BSA

מתנה מד"ר דיוויד הולובקה וד"ר ברברה ביירד, אוניברסיטת קורנל<p align="center">

הצעה: טכנולוגיות חיים DNP-BSA catalog# A23018

סידן יונופור A23187

סיגמא

C75-22-1mg

Ionophore נוצר מאבקה על ידי הוספת 400 µ l  של 100% DMSO טרי לתוך בקבוקון היונופור ונשמר בטמפרטורה של -20 מעלות; C

הערה: השתמשנו ביונופור מעבר לתאריך התפוגה של 3 חודשים בהצלחה

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

חומצה אצטית

VWRp align="center">BDH3094-2

CAS# 64-19-7

נתרן פחמתי נטול מים

סיגמא

222321

CAS# 497-19-8

נתרן כלורי

סיגמא

71376

CAS# 7647-14-5

חומצה הידרוכלורית

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

מאגר ייחוס, pH 7

VWRp align="center">BDH5046

מאגר ייחוס, pH 10

VWRp align="center">BDH5072

מאגר ייחוס, pH 4

VWRp align="center">BDH5018

pH אלקטרודה פתרון אחסון

VWRp align="center">14002-828

ציוד:

DU 7500 ספקטרופוטומטר

בקמן

לא נמכר עוד

קורא צלחות סינרגיה 2

משתמש בתוכנת איסוף וניתוח נתונים של Microplate Gen5

BioTek

מודול S

Hematocytometer

Hausser Scientific

3110

7 x  7 CER HOT/STIR 120 V

פלטה חמה משולבת/צלחת ערבוב מגנטית

VWRp align="center">97042-634

צנטריפוגה

Eppendorf

5430

אמבט מים לתרבית רקמות

VWRp align="center">דגם # 89032-206

ארון בטיחות ביולוגי של תרבית רקמות

SafeGARD (מכסה מנוע TC)

חברתבייקר

Model# SG403A-HE

חממת תרביות רקמות

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWRp align="center">

טווח: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

מד pH

Symphony/VWRp align="center">Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

מתכונים:

מאגר אצטט, pH 4.4

ליצור 0.12 M חומצה אצטית וטיטראט ל-pH 4.4 עם 10 N NaOH. מדובר ב-5.3 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ל-1 ליטר מים MilliQ: (1 ליטר)*(0.12 מול/ליטר)*(60 גרם/מול)*(מ"ל/1.37 גרם) = 5.3 מ"ל מכיוון שצפיפות הקרחון היא 1.37 גרם/מ"ל

מסנן סטרילי לתוך בקבוק זכוכית חיטוי

מצע (4-MU)

סיגמא M-2133, 250 מ"ג, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) יש לאחסן ב-20° מלאי C: 0.12 מ' ב-DMSO (46 מ"ג ב-1 מ"ל DMSO), חם עד 37 מעלות; C, מערבולת, סוניקט 10 דקות בסוניקטור אמבט מים עם מים חמים, מערבולת שוב<p align="מרכז">לכל ניסוי, הכינו תמיסה טרייה של מצע במאגר אצטט (דילול פי 100), לריכוז סופי של 1.2 מ"מ במאגר אצטט

מאגר גליצין קרבונט, pH 10

26.7 גרם גליצין 47.1 גרם נתרן פחמתי נטול מים הוסף מים נטולי יונים עבור 1 ליטר, ולהתאים את ה-pH ל-10

מסנן סטרילי לבקבוק זכוכית חיטוי

טירודס (2 ליטר), pH 7.4

135 מ"מ NaCl: 15.78 גרם (או 270 מ"ל של 1 M) 5 מ"מ KCl: 10 מ"ל של 1 מיליון מלאי 1.8 מ"מ CaCl2: 7.20 מ"ל של מלאי 0.5 M 1 מ"מ MgCl2: 4.00 מ"ל של מלאי 0.5 M 5.6 מ"מ גלוקוז: 2.02 גרם (11.2 מ"ל של 1 M) 20 מ"מ HEPES: 40 מ"ל של מלאי 1 M שימוש ב-HCl pH מרוכז מ-~9.7-7.4

מסנן סטרילי לתוך בקבוק זכוכית חיטוי

RBL Cell Media

להפשיר סרום בקר עוברי (FBS, מאוחסן ב-20 מעלות; ג) למשך כ-4 שעות ב-37 מעלות; אמבט מים C עקוב אחר הטכניקה הסטרילית הסטנדרטית להוציא 1 ליטר מדיום חיוני מינימלי (MEM) עם L-גלוטמין (עם Earle' מלחים) שפכו מעט MEM כדי לקבל 800 מ"ל MEM, הוסיפו 200 מ"ל FBS חם הוסיפו 1 מ"ל אנטיביוטיקה גנטמיצין סולפט ל-1 ליטר מדיה עם פיפטה סטרילית השתמשו רק בבקבוקי מדיה שעברו חיטוי וסומנו לשימוש בתרבית תאים בלבד.

מסנן סטרילי (0.2 מ"מ) לתוך בקבוק זכוכית חיטוי

<חזק>חומר פלסטי בשימוש:

200 ומיקרו; l  קצות פיפט סטריליים חד פעמיים עם סימונים ב-96 מתלה

VWRp align="מרכז">53509-009

פוליפרופילן

1,000 ומיקרו; l  קצות פיפט אירוסול סטריליים עם HighRecovery

VWRp align="center">89003-420

פוליאתילן

10 µ l  מיקרו קצה סטרילי

VWRp align="מרכז">14217-704

פוליפרופילן

צינורות מיקרוצנטריפוגה חד-פעמיים/חרוטיים לכוח G

VWRp align="מרכז">20170-038

פוליפרופילן

חד פעמי/בוגר/חרוטי/סטרילי 50 מ"ל  צינורות צנטריפוגה עם מכסי בורג

VWRp align="מרכז">21008-178

פוליפרופילן

חד פעמי/מדורג/חרוטי/סטרילי 15 מ"ל  צינורות צנטריפוגה עם מכסי בורג

VWRp align="center">21008-103

polypropylene

בקבוק T-25 מטופל בתרבית רקמות של CELLSTAR עם מכסה מסנן

Greiner Bio One

690175

polystyrene

בקבוק T-75 מטופל בתרבית רקמות של CELLSTAR עם מכסה מסנן

Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml  פיפטה סרולוגית עטופה בנייר/פלסטיק

גריינר ביו אחד

607180

פוליסטירן

CELLSTAR 2 ml  פיפטה סרולוגית עטופה בנייר/פלסטיק

גריינר ביו אחד

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml  פיפטה סרולוגית עטופה בנייר/פלסטיק

גריינר ביו אחד

606180

פוליסטירן

CELLSTAR 25 ml  נייר / פלסטיק עטוף פיפטה סרולוגית

גריינר ביו אחד

760180

פוליסטירן

1 ס"מ cuvettes

N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, תרבית רקמות מטופלת, שחור, עם מכסה

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

Eppendorf

022266501

Polypropylene/

פוליאתילן

<<<<<<<<<<<<<<<<<

מקורות

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861(1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937(2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי RBL-2H3בדיסת טריקלוסאןפלואורסצנציית מיקרופלייטהבטא הקסוסאמינאדאזספקטרופוטומטריה ב-UV-Visהכנת תמיסה מימיתגירוי באמצעות יוניפור של סידןרגישות לאנטיגןסריקה בסריקה גבוהה (High-Throughput Screening)
Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.