הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

Summary

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

Abstract

ניתן ליישם מיקרוסקופ סופר רזולוציה מבוסס לוקליזציה כדי לקבל מפה מרחבית (תמונה) של התפלגות מולקולות בודדות המסומנות פלואורסצנטית בתוך דגימה ברזולוציה מרחבית של עשרות ננומטרים. באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים לפוטו-אקטיבציה (PAFP) או ניתנים להחלפה (PSFP) המאוחים לחלבונים מעניינים, או צבעים אורגניים המצומדים לנוגדנים או למולקולות אחרות מעניינות, מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית (FPALM) יכול לדמות בו זמנית מינים מרובים של מולקולות בתוך תאים בודדים. על ידי שימוש בגישה הבאה, אוכלוסיות של מספרים גדולים (אלפי עד מאות אלפים) של מולקולות בודדות מצולמות בתאים בודדים וממוקמות בדיוק של ~10-30 ננומטר. ניתן ליישם את הנתונים המתקבלים להבנת ההתפלגות המרחבית הננומטרית של סוגי חלבונים מרובים בתוך תא. יתרון עיקרי אחד של טכניקה זו הוא העלייה הדרמטית ברזולוציה המרחבית: בעוד שעקיפה מגבילה את הרזולוציה ל~200-250 ננומטר במיקרוסקופ אור קונבנציונלי, FPALM יכול לשנות את קנה המידה של אורך התמונה יותר מסדר גודל קטן יותר. מכיוון שהשערות ביולוגיות רבות נוגעות ליחסים המרחביים בין ביומולקולות שונות, הרזולוציה המשופרת של FPALM יכולה לספק תובנה לשאלות של ארגון תאי שבעבר לא היו נגישות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. בנוסף לפירוט השיטות להכנת דגימה ורכישת נתונים, אנו מתארים כאן את ההגדרה האופטית עבור FPALM. שיקול נוסף עבור חוקרים המעוניינים לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הוא העלות: התקנות פנימיות זולות משמעותית מרוב מכונות ההדמיה הזמינות מסחרית. המגבלות של טכניקה זו כוללות את הצורך באופטימיזציה של התיוג של מולקולות מעניינות בתוך דגימות תאים, והצורך בתוכנת עיבוד לאחר כדי להמחיש תוצאות. אנו מתארים כאן את השימוש בביטוי PAFP ו-PSFP כדי לדמות שני מיני חלבונים בתאים קבועים. מתוארת גם הרחבת הטכניקה לתאים חיים.

Introduction

בעוד שמבנים תאיים קיימים במגוון רחב של קני מידה מרחביים, הדמיה פלואורסצנטית של ארגון תאים בקנה מידה קטן מ-~250 ננומטר מוגבלת במיקרוסקופיה קונבנציונלית בשל האילוץ הפיזי של גבול העקיפה. מגבלה זו התגברה עם הופעת מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטואקטיביות פלואורסצנטית (FPALM¹) וטכניקות דומות^2,3, שיכולות למקם מספר רב של מולקולות בודדות בדיוק של ~10 ננומטר, כדי ליצור תמונות ברזולוציה של כמה עשרות ננומטרים. FPALM מבוסס על שימוש בבקרה אופטית כדי להפעיל ולנטרל תת-קבוצות של מולקולות (לתיאור מלא של FPALM, והוראות כיצד ליישם מערכת הדמיה זו, ראה Gould et al.⁴). טכניקה זו מאפשרת למפות את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות שלמות של מולקולות בודדות, ובכך להבהיר מבנים ביולוגיים על פני סקאלות אורך המשתרעות מעשרות ננומטר עד עשרות מיקרונים. מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מבוססת לוקליזציה (המכונה כאן מיקרוסקופיית לוקליזציה) הותאמה כעת כדי לענות על מגוון שאלות ביולוגיות, כאשר פיתוחים טכנולוגיים מאפשרים, למשל, הדמיה של אוריינטציות מולקולריות בודדות עם קיטוב FPALM, או P-FPALM⁵, הדמיה פלואורסצנטית של מולקולות בודדות בתלת מימד עם FPALM דו-כנפי⁶ או טכניקות אחרות^7-9והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה של מולקולות בודדות בתאים חיים^10-12. מיקרוסקופ לוקליזציה יושם גם על הדמיה של מינים מרובים בתאים קבועים^13-16. לאחרונה, שלושה מיני חלבונים צולמו בו זמנית עם FPALM בתאים קבועים וחיים^{כאחד 17}. מיקרוסקופ לוקליזציה יכול לדמות דגימות המסומנות במגוון דרכים: דוגמאות כוללות חלבונים המבוטאים בתגי היתוך PAFP או PSFP, נוגדנים או מולקולות המסומנות בצבעים אורגניים כלואים, או צבעים אורגניים קונבנציונליים. בעוד שהשימוש בצבעים פלואורסצנטיים קונבנציונליים מאפשר תיוג של חלבונים בהיעדר תג חלבון היתוך, התנאים הנדרשים בדרך כלל לשימוש בצבעים אורגניים שאינם כלובים בהדמיה ברזולוציה גבוהה מחייבים דגימות להיות שקועות במאגרים מפחיתים². בנוסף, האספקה התוך-תאית של צימודי נוגדנים-צבע דורשת בדרך כלל קיבוע תאים וחדירת הממברנות שלהם, או דורש שתאים חיים יהיו חדירים באמצעות אלקטרופורציה או אמצעים אחרים. הדרישות להפחתת תנאי החיץ וחדירות הממברנה מגבילות את התאמתם של צבעים אורגניים להדמיית תאים חיים, אם כי ההתפתחויות האחרונות אפשרו שימוש יעיל ב-HaloTags ו-FPALM להדמיית מבני ממברנה¹⁸.

FPALM הייתה טכניקת המיקרוסקופיה הראשונה שיושמה על תאים חיים¹⁰. בתאים חיים, בנוסף למתן מפה מרחבית תלוית זמן של מיקומי המולקולות המסומנות, FPALM יכול לעקוב אחר מולקולות בודדות על פני מסגרות מרובות, ומסלולים מולקולריים שנקבעו על פני טווחי זמן של אלפיות שנייה¹⁹. לפיכך, FPALM מספק גישה לטווחי זמן קצרים למדי ורזולוציה בקנה מידה ננומטרי.

ניתן להשתמש ב-FPALM רב צבעוני למגוון בדיקות שונות, כולל חלבונים הניתנים להפעלה פוטו-אקטיבית וצבעים אורגניים בכלובים או שאינם בכלובים. אנו מספקים כאן פירוט על הפרוטוקול וההגדרה להדמיה בו-זמנית של שני מיני חלבונים פלואורסצנטיים, Dendra2 ו-PAmCherry. אנו מדווחים על תוצאות הדמיית PAmCherry מצומד לבטא אקטין (PAmCherry-actin) ו-Dendra2 מצומד להמגלוטינין לשפעת (Dendra2-HA) בפיברובלסטים NIH-3T3. ניתן להחליף רכיבים המתוארים בהתקנה לחומרה אחרת המתאימה יותר להדמיה של בדיקות אחרות. כאשר זה המקרה, ניסינו להיות מפורשים בטקסט.

FPALM צבעוני אידיאלי לדיווח על ההתפלגות המרחבית של מיני חלבונים מרובים בתאים חיים או קבועים. טכניקה זו מתאימה במיוחד לחקירת יחסים מרחביים ו/או דינמיים בקנה מידה מרחבי באורך ננומטר, אם כי תמונות ידווחו על לוקליזציה בטווח של סקאלות אורך, מעשרות ננומטר ועד עשרות מיקרונים. יתרון מרכזי אחד של FPALM רב צבעוני הוא שההתקנה זולה יחסית לבנייה, וגמישה מאוד לשימוש עם שילובי בדיקה שונים. תהליך הבנייה והכיול של המערכת מרכיבים מספק גם הבנה ניכרת של גורמים שיכולים לפגוע באיכות ובפרשנות של הנתונים, ובכך גם על תוצאת המחקר. אנו מפרטים כאן את השיטות להגדרה אופטית, הכנת דגימות ורכישת נתונים של מיני חלבונים מרובים, עם מבני היתוך PSFP ו-PAFP, באמצעות FPALM. בעוד שפרוטוקול זה מתאר ניתוח של תאים קבועים, נהלים אלה ישימים בקלות להדמיה של תאים חיים.

ההגדרה האופטית המתוארת כאן אידיאלית להדמיה בו-זמנית של ה-PSFP Dendra2 וה-PAFP PAmCherry. בדיקות רבות אחרות עשויות לשמש להדמיה רב-צבעונית; עם זאת, הרכיבים המדויקים הנדרשים עשויים להשתנות, בהתאם לספקטרום העירור והפליטה של הגשושיות שנבחרו. בחירות של מראות דיכרואיות, מסננים ואורכי גל לייזר צריכות להיעשות על סמך שיקולים אלה.

Protocol

שימו לב: ייצוג דיאגרמטי של רכיבים אופטיים המוזכרים בפרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.

1. הכנת דגימת תאים

1. תאי צלחת בצפיפות אופטימלית (עבור תאי NIH-3T3, זה בערך 2-5 x 10⁴ תאים/ס"מ²) בבארות של תא של 8 בארות. התאים צריכים להיות מצופים במדיה שלמה המתאימה לסוג התא, אם כי יש לייצר מדיה ללא אנטיביוטיקה וללא פנול אדום, התורם לפלואורסצנטיות ברקע. שים לב שהתנאים לניסויים בתאים, כגון הטווח האופטימלי של מספרי מעבר, עשויים להיות שונים עבור שורות תאים בודדות.
2. דגירה של תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ (או בתנאים המתאימים לסוג התא) כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי. תאי טרנספקט עם DNA נטול אנדוטוקסין עבור כל אחד משני מבני מיני חלבון (במקרה זה, DNA עבור PAmCherry-actin ו-Dendra2-HA). מכסים את הדגימה בחומר אטום קל כגון נייר אלומיניום. טרנספקציה צריכה לכלול בארות עם שני מבני DNA, ובארות עם רק אחד מכל אחד מהמבנים הללו.
3. דגירה למשך 4-6 שעות, 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ (או בתנאים המתאימים לסוג התא), לפני החלפתה למדיה מלאה (עם אנטיביוטיקה, ללא פנול אדום) ודגירה נוספת למשך 16-48 שעות כדי לאפשר לתאים לבטא את החלבונים הרצויים.
   1. ניתן לתקן תאים על ידי שטיפה שלוש פעמים עם מי מלח חוצץ פוספט (PBS) ואז לדגור עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) (זהירות: רעיל) ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT, ולאחר מכן שטיפה נוספת פי 3 עם PBS. עם זאת, בהתאם לחלבונים המעניינים, קיבוע זה עשוי לגרום למאגר גדול של מולקולות מתויגות שעדיין נעות. כדי להפחית עוד יותר את הניידות, שיטות קיבוע חלופיות כוללות שימוש ב-100% מתנול צונן, או 0.2% גלוטרלדהיד ו-4% PFA ב-PBS למשך >30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס²⁰. בכל אחת מהשיטות יש לשטוף תאים עם PBS כאמור לעיל. שימו לב שהשימוש בגלוטרלדהיד עשוי להגביר את הקרינה ברקע או את האוטו-פלואורסצנציה בתנאי הדמיה מסוימים, ועשוי לדרוש טיפול לאחר קיבוע עם נתרן בורוהידריד²¹.
4. ניתן לשמור את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שקועה ב-PBS, אטומה בסרט איטום עצמי, עד 7 ימים לפני ההדמיה.

2. יישור מיקרוסקופ

1. הנח סולם כיול (רשתית) על המיקרוסקופ stage. באמצעות מטרה פי 10 והמנורה לאור מועבר, מרכז את הרשתית במרכז שדה הראייה (FOV).
2. Köhler Illumination. כוונן את המיקרוסקופ לתאורת קוהלר²². כדי להתחיל, סגור את פתח השדה והסתכלות דרך העיניים התמקד ברשתית. אם הקצוות של צמצם השדה אינם ממוקדים, כוונן את גובה המעבה עד שגם צמצם השדה וגם הרשתית יהיו ממוקדים.
3. כוונן את המיקום הרוחבי של צמצם השדה עד שהוא מרוכז ביחס ל-FOV. סגור את צמצם השדה עד שרק הרשת המרכזית ברשתית מוארת.
4. ליישור גס של מיקום המצלמה (כלומר בפעם הראשונה שההגדרה מיושרת), השתמש ב-lamp גבוה בעוצמה כשתריס המצלמה סגור, ואל תניח רכיבים כלשהם בתיבה B (איור 1), לתוך הנתיב האופטי עד להגעה לשלב 2.5. אל תניח את L2 ו-L3 בנתיב הזיהוי בעת יישור המצלמה לראשונה. מרכזו בערך את תמונת הרשתית על תריס המצלמה על ידי התאמת המיקום האנכי והאופקי של המצלמה (איור 2B). השבת את רווח ה-EM, כבה את אורות החדר ופתח את תריס המצלמה.
5. לאחר הפחתת עוצמת המנורה לרמה שלא תפגע בחיישן המצלמה, הקרינו את האור מתמונת הרשתית ישירות על חיישן המצלמה (איור 2A). מקד את הרשתית על ידי כוונון כפתור המיקוד של המיקרוסקופ תוך כדי צפייה בתמונה במצב וידאו חי בתוך תוכנת הרכישה. מרכז את תמונת הרשתית על חיישן המצלמה על ידי התאמת המיקום האנכי והאופקי של המצלמה (איור 2B).
6. הנח את L2 ו-L3 בנתיב הזיהוי בין הצמצם למצלמה (איור 2C). יישר את L2 ו-L3, כך ש-L2 הוא אורך מוקד אחד מנקודת המוקד של יציאת המיקרוסקופ ו-L3 הוא אורך מוקד אחד מחיישן המצלמה. המרחק בין L2 ל-L3 צריך להיות שווה באופן אידיאלי לסכום אורכי המוקד של L2 ו-L3, אך ניתן לכוונן אותו במידה מסוימת כדי להתאים לאילוצי מקום. המצלמה והעדשות צריכות להיות באותו גובה כמו יציאת היציאה.
7. שימו לב שהאור הנפלט מהמיקרוסקופ צריך להיות מרוכז ב-L2 ו-L3. התאם את המרחק בין L2 למיקרוסקופ כדי להבטיח שתמונת הרשתית תהיה במיקוד חד הן במצלמה והן דרך העיניים.
8. במידת הצורך, ניתן להשתמש בתרגומים קטנים (למשל <1 מ"מ) של L2 ו-L3 כדי למרכז את תמונת הרשתית על חיישן המצלמה.
9. מודול שני צבעים. לאחר אופטימיזציה של מיקום המצלמה, הצמד רכיבים המוצגים בתיבה B (איור 1) לנתיב הזיהוי. ניתן להצמיד רכיבים אלה לתושבת נשלפת, כך שניתן להכניס את המודול כולו עבור FPALM רב-צבעוני, או להסיר אותו עבור יישומי FPALM אחרים שאינם דורשים זאת.
10. בפעם הראשונה שרכיבים אלה מורכבים, התאם את אורכי הנתיב של כל ערוץ כך שיהיו שווים. הקרן את הרשתית על שבב המצלמה, כוונן את M7 ו-M9 ו/או סגור את צמצם הזיהוי (AP) כדי למנוע חפיפה מרחבית בין שני הערוצים. מקדו את תמונת הרשתית בערוץ האור המוחזר.
11. אם התמונה בערוץ האור המשודר אינה ממוקדת, תרגם את M9 (וסובב במידת הצורך) עד שהתמונה הרשתית תהיה בפוקוס בו זמנית בשני הערוצים. שימו לב ששני הערוצים צריכים להיות נעקרים לרוחב זה מזה (איור 2D). תזוזה זו, בין אם אופקית או אנכית, יכולה להשפיע על מהירות הרכישה. למידע נוסף, עיין במדריך למשתמש של המצלמה.
12. הקלט תמונת מצב של קנה המידה של הרשתית (לשימוש מאוחר יותר בחישוב ההגדלה הכוללת). באמצעות תוכנת המצלמה, בחר את אזור העניין הרצוי. שיעורי פריימים גבוהים יותר יהיו אפשריים בדרך כלל עבור אזור עניין קטן יותר.

3. יישור לייזר

1. הפעל את לייזרי הקריאה וההפעלה. (זהירות: יש להשתמש בלייזרים רק לאחר שהמפעילים עברו הדרכת בטיחות בלייזר.) כל דלתות המעבדה צריכות להישאר סגורות, עם רק צוות חיוני מיומן בתוך המעבדה בזמן יישור הלייזרים. השתמש בתריסים SH1 ו-SH2 כדי לחסום את אלומות הקריאה וההפעלה בהתאמה כאשר אינן בשימוש, ובמסנני ND כדי להחליש את עוצמת הלייזר לרמות בטוחות (<1 mW). כדאי למזער את כל תאורת החדר במהלך היישור, למעט התאורה הדרושה לבטיחות.
2. חסום את אלומות ההפעלה והקריאה. הסר את L1 מנתיב הלייזר.
3. הנח כרטיס לבן צמוד ל-M4. לרוב המיקרוסקופים המורכבים המסחריים יש תריס מובנה לחסימת תאורה נכנסת. אם זמין, פתח את תריס המיקרוסקופ והתמקד עד שתמונת הרשתית תקרין על M4. אם תריס מיקרוסקופ פנימי אינו זמין, השתמש בתריס חיצוני במיקום נוח החוסם את כניסת כל קרני הלייזר למיקרוסקופ.
4. לייזר קריאת מרכוז ב-FOV. בטל את חסימת קרן הקריאה. מרכז את קרן הקריאה על הכוונת של תמונת הרשתית ב-M4 על ידי כוונון M1.
5. הקרן את תמונת הרשתית על M5, והתאם את המראה M4 עד שהקרן מרוכזת על כוונת התמונה ב-M5, כך שקרן הקריאה מרוכזת עם כוונת הרשתית הן ב-M4 והן ב-M5. חסום את קרן הקריאה.
6. לייזר הפעלה מרכזי ב-FOV. הקרן את תמונת הרשתית על M3, והסר את מרחיב האלומה (BE) מנתיב הלייזר. בטל את החסימה של קרן ההפעלה.
7. כוונן את M2 כדי למרכז את קרן ההפעלה על הכוונת של תמונת הרשתית ב-M3. לאחר המרכז, החלף את ה-BE בין M2 ל-M3, והתאם את מיקום ה-BE עד שהקרן מרוכזת על הכוונת של תמונת הרשתית ב-M3.
8. באמצעות מטרה של פי 10, הקרן את תמונת הרשתית על M5, והתאם את כפתור המיקוד של המיקרוסקופ במידת הצורך כדי להשיג מיקוד. כוונן את הזווית של DM1 עד שקרן ההפעלה מרוכזת בתמונת הרשתית שם. חסום את שתי הקורות.
9. ללא מטרה במקום, ותריס המיקרוסקופ פתוח, הקרן את לייזר הקריאה דרך הצמצם האחורי של המיקרוסקופ. (זהירות: שלב זה יוצר סכנה בטיחותית בלייזר על ידי הפניית קרן לייזר מקבילה בנתיב אנכי לא חסום.) כוונן את M5 עד שהקרן מגיחה היישר מהמיקרוסקופ ונוחתת על התקרה ישירות מעל, או מרוכזת על כרטיס המונח על תושבת המטרה בצריח.
10. אופציונלי: ניתן להקל על קביעת היישור הנכון על ידי שימוש בדגימת צבע בתמיסה (במקרה זה, רודמין B ב-~100 מיקרומטר במים או מתנול בעומק של >0.5 ס"מ למטרות חזותיות), המונח על שלב הדגימה עם עדשת האובייקטיבית 60X במקומה. אם הקרן מיושרת כהלכה, המטרה תקרין חרוט פלואורסצנטי מיושר עם ציר המטרה והמיקרוסקופ. סטיות קטנות במיקום קרן הלייזר בצמצם האחורי של המטרה יגרמו לקונוס להתרחק מיישור אנכי גרידא.
11. חסום את שתי הקורות. התקן L1 בנתיב הלייזר במרחק המתאים (כלומר אורך מוקד אחד) מהצמצם האחורי של עדשת האובייקטיב. כאשר המטרה 60X במקומה, אפשר לקורת הקריאה להקרין על התקרה. כוונן את המיקום האופקי והאנכי של L1 (בניצב לכיוון התפשטות הלייזר) עד שהקרן מרוכזת מעל המיקרוסקופ. הערה: בשלב זה, הקורה תיצור נקודה גדולה יותר מאשר בשלב הקודם.
12. המיקום הצירי של L1 ואורך המוקד שלו ישפיעו על גודל האזור המואר בדגימה. באופן קפדני, חישוב פרופיל התאורה בדגימה חייב לקחת בחשבון עקיפה²³. עם זאת, באופן גס, הצבת L1 במרחק צירי שאינו אורך מוקד אחד ממישור המוקד האחורי של האובייקט תגרום במקרים רבים לפרופיל תאורת לייזר קטן ואינטנסיבי יותר מאשר כאשר L1 נמצא באורך מוקד אחד בדיוק ממישור המוקד האחורי. ניתן להשתמש באזור מואר קטן יותר כדי לייצר עוצמת לייזר גבוהה יותר עבור יישומים מסוימים, כגון הדמיה במהירות גבוהה, למשל.
13. מדידת פרופיל קרן קריאה. עם L1 במקום, הנח דגימה של תמיסת צבע מרוכזת מתאימה (במקרה זה, רודמין B ב-~100 מיקרומטר במים) על הבמה.
14. כאשר לייזר ההפעלה חסום, הקרן את לייזר הקריאה (כוונן את ND1 כדי להשיג הספק <<1 mW עבור כל הקרניים החשופות) דרך האובייקט 60X ולתוך הצבע, ו(כאשר רווח ה-EM מושבת) שלח תמונה זו למצלמה.
15. מקד את המטרה במדגם. עבור שלב זה, יש צורך בצמצם גדול מספיק כדי לאפשר הדמיה של פרופיל האלומה המלאה.
16. תרגם את ה-AP לרוחב כך שמרכז פרופיל האלומה וה-AP יהיו קונצנטריים. באמצעות תוכנת המצלמה, בחר את אזור העניין כדי לאפשר את אזור קריאת המצלמה הקטן ביותר המקיף את שני הערוצים. רשום קואורדינטות אלה. הקלט תמונה בודדת (זהו פרופיל קרן הקריאה).
17. תמונות המשקפות בצורה נכונה יותר את פרופיל הלייזר במישור המוקד יתקבלו כאשר דגימת תמיסת הצבע דקה ככל האפשר. ניתן ליצור דגימה דקה כזו על ידי הנחת טיפה של ~5 ul של תמיסת צבע בין שקופית מיקרוסקופ לכיסוי.
18. מדידת פרופיל קרן הפעלה. חסום את לייזר הקריאה. הקרן את לייזר ההפעלה לדגימה; והקרינו את התמונה הזו למצלמה.
19. במידת הצורך, השתמש ברווח EM <100 והתאם את DM1 עד שהקרן מרוכזת בכל FOV. הקלט תמונת מצב של פרופיל קרן ההפעלה.
20. מדוד את העוצמה של כל קרן. הסר את תמיסת הצבע והנח חיישן מד כוח מעל יעד 60X (ללא אמצעי טבילה). מדוד את העוצמה של כל קרן (הפעלה וקריאה) בנפרד. שים לב שיש לכוונן את מיקום מד הכוח בזהירות כדי להבטיח שכל כוח הלייזר הנפלט פוגע בחיישן מד הכוח.
21. עבור כל לייזר, השתמש במסנני צפיפות ניטרלית (ND1 ו-ND2) כדי להתאים את ההספק כדי להניב עוצמות בדגימה המתאימה לניסוי.
22. עוצמת לייזר קריאה לרכישת תמונה. עוצמת הלייזר של הקריאה צריכה להיות גבוהה מספיק כדי לעורר ולהלבין מולקולות בודדות בטווח הזמן של כמה פריימים. ערכים אופייניים הם 10^{3-10 4} W/cm² (ראה גם Gould et al.⁴). העוצמה במדגם תלויה בגודל שטח התמונה, כך שההספק הנדרש להשגת העוצמה הרצויה ישתנה ממערכת למערכת.
23. עוצמת לייזר ההפעלה. יש לבחור את עוצמת לייזר ההפעלה כך שמספר המולקולות הפעילות יהיה קטן (למשל 1-100) בכל מסגרת רכישה נתונה. באופן גס, הצפיפות הרצויה מושגת כאשר המרחק הקרוב ביותר בין מולקולות פעילות גדול מעט מהרזולוציה המוגבלת של העקיפה (ראה גם סעיף 6, הדמיה). ככל שאוכלוסיית המולקולות הבודדות הלא פעילות פוחתת, נדרשות עוצמות גבוהות יותר של לייזר ההפעלה. עוצמות אופייניות הן ^{10-1-10 2} W/cm².
24. בצע אופטימיזציה של לוחית רבע הגל. לוחית רבע הגל (QWP) היא אופציונלית, אך הגדלת מידת הקיטוב המעגלי של לייזרי הקריאה וההפעלה באמצעות QWP יכולה להגדיל את צפיפות המולקולות בתמונות הסופיות. כדי למטב את ה-QWP, מקם מקטב בין ה-QWP ל-M5. חסום את לייזר ההפעלה. הקרן את לייזר הקריאה דרך מד הספק מעל המטרה היבשה של 60X.
25. רשום את זווית ה-QWP. כוונן את המקטב עד למקסימום, ואז מושגות ההספקים המינימליים. רשום כל אחד מהערכים הללו וחשב את היחס בין מינימום/מקסימום. כוונן את זווית ה-QWP וחזור על מדידות אלה. אמנם רצוי להשיג ערכים קרובים ל-1.0, אך יחס של >0.8 מספיק להדמיה.

4. יצירת דגימה עמידה של חרוזים ליישור ערוצים

1. לדלל דגימה של חרוזי פלורסנט (בקוטר 40-100 ננומטר) 1:70 למים בדרגת HPLC. יש לדלל עוד יותר את תמיסת המלאי הזו ביחס של 1:15 במי HPLC, לקבלת נפח סופי של תרחיף חרוזים של 200 מיקרוליטר במים.
2. מצפים כיסוי בפולי-L-ליזין נוזלי. דגירה ב- RT למשך 30 דקות. שאפו כדי להסיר את התמיסה, ושטפו את הכיסוי שלוש פעמים במים בדרגת HPLC. שאפו את כל עקבות המים מהכיסוי והשאירו לייבוש ב-RT.
3. פיפטה 200 מיקרוליטר של מתלה החרוזים על הכיסוי. השאר את הכיסוי למשך 20 דקות ב-RT לפני שטיפה שלוש פעמים במי HPLC. לחלופין, השאר את הכיסוי O/N ב-RT כדי לאפשר למתלים להתייבש.
4. באמצעות ~20 מיקרוליטר של מי HPLC או מדיום הרכבה, התקן את הכיסוי על מגלשת זכוכית. אטום את היקף הכיסוי עם לק שקוף. לאחר שהלק התייבש, הנח את הכיסוי (ואמצעי טבילה אובייקטיבי מתאים; מים או שמן) על המטרה 60X.

5. רכישת תמונה: דגימת חרוז הדמיה ליישור ערוצי זיהוי

1. האירו את דגימת החרוז עם קרן הלייזר הקוראת בעוצמה נמוכה בערך פי 10 מזו שתשמש להדמיה. כאשר רווח ה-EM מוגדר ל-100, הקרן את התמונה למצלמה והתאם את המיקוד עד שהחרוזים נראים בשני הערוצים.
2. אם החרוזים עמומים, הגדל את עוצמת הלייזר או את רווח ה- EM. מזעור הרעש בתמונות חרוזים (על ידי זיהוי מספר רב של פוטונים, כלומר לפחות 5,000 בסך הכל מכל חרוז) הוא קריטי לרישום מדויק של ערוצים. הגדר את המצלמה להקליט 100 פריימים, עם אותו זמן חשיפה שישמש להדמיית FPALM הבאה.
3. חפש אזורים שבהם חרוזים מופצים הן במרכז והן בפריפריה של הערוצים, והיכן שצפיפות החרוזים נמוכה מספיק כדי שחרוזים בודדים מופרדים היטב וניתן לזהות אותם בנפרד.
4. רכוש בין 10-20 סטים של תמונות של אזורים שונים בצפיפות חרוזים אלה. עיין בסעיף התוצאות לפרטים על השימוש בתמונות החרוזים לכיול ערוצים.

6. רכישת תמונה: FPALM צבעוני

1. חשוב לדמות תאים שעברו טרנספטציה רק עם אחד מכל אחד מהמבנים, כמו גם להקליט תמונות של תאים עם כל המבנים. נתונים אלה יסייעו בקביעת היסטוגרמות האלפא של כל אחת מהבדיקות המשמשות, ונדרשים לפירוש נתונים רב-צבעוניים.
2. מצא תאים המבטאים בדיקות הניתנות להחלפה, אם הם בשימוש. בטל את כל תאורת החדר. הקרן את מנורת הכספית, באמצעות תושבת ההיפוך (FM), על הדגימה (המכילה תאים שעברו טרנספטציה). שנה את קוביית מסנן הצריח לאחת המכילה את שילוב המראה הדיכרואי / המסנן המתאים כדי לאפשר עירור של המצב הטרום-פוטו-מתג של התווית. לדוגמה, עבור הדמיה של Dendra2 עם מיתוג מראש, או בדיקות עם פליטה ירוקה ממותגת מראש, אפשרות אחת עבור DM4 היא דיכרואי המחזיר אור כחול (<488 ננומטר) ועבור F5 הוא מסנן המעביר אור מ~500-570 ננומטר, תוך חסימת אור מחוץ לתחום זה.
3. באמצעות העיניים, חפש תאים המבטאים את הגשושית הקדם-פוטו-שוטית. לדוגמה, תאים המבטאים Dendra2 יופיעו בירוק. שים לב שלא כל הגשושיות ניתנות להחלפה בפוטו, ובהתאם לספקטרום הפליטה שלהן שהוחלף מראש, אלה שכן עשויות לדרוש שילובים של DM4/F5 שונים מאלה המפורטים כאן.
4. לאחר בחירת תא, הזיזו את ה-FM כלפי מטה כדי לאפשר ללייזרים לעבור למיקרוסקופ (לחסום את אור הכספית מהנתיב). שנה את צריח המסנן לזה המכיל את הדיכרואי המתאים להדמיה (במקרה זה, DM2 צריך לשקף הן את לייזר הקריאה והן את לייזר ההפעלה, תוך שידור אורכי גל ארוכים יותר, ו-F1 צריך לשדר אורכי גל לאדום של הלייזר ובאופן אידיאלי לכלול דיכוי גבוה באורך גל הלייזר).
5. אם התאים אינם מבטאים בדיקה הניתנת להחלפה, חפש תאים על ידי הקרנת התמונה למצלמה, ועל ידי שימוש בלייזר הקריאה כדי להאיר את הדגימה. מולקולות בודדות ככל הנראה יהיו גלויות (ראו איור 3) ברבים מהתאים.
6. כדי להבחין בין תאים שעברו טרנספטציה לבין פלואורסצנטיות רקע (שעדיין יכולות להופיע כמולקולות מהבהבות בנפרד), וכדי לוודא שהמולקולות ניתנות לפוטו-אקטיביות, האירו בקצרה את הדגימה בעוצמה נמוכה של לייזר ההפעלה (בדרך כלל בסדר מיקרו-וואט). מספר המולקולות הפוטו-אקטיביות הנראות מתחת לאלומת הקריאה אמור לגדול באופן דרמטי ולהישאר גבוה לזמן קצר גם לאחר שתאורת ההפעלה נחסמה שוב. שים לב שבדיקות שונות עשויות להשתנות במידה ניכרת בבהירות, ביעילות ההמרה לאור ובעוצמת הלייזר הנדרשת להפעלה^24-27.
7. הכן את תוכנת המצלמה לרכישת סדרה קינטית על ידי הגדרת רווח EM ל-200 ובחירת מספר הפריימים הרצוי (בדרך כלל 5,000-10,000), וזמן החשיפה (בדרך כלל 10-30 msec מתאים). בעוד שניתן להגדיר את הגבר ה- EM גבוה מ- 200, מעבר לנקודה מסוימת הגדלת הגבר EM עשויה להגביר את הרעש.
8. חסום את קרן ההפעלה. בטל את חסימת אלומת הקריאה והקרן את תמונת התא המואר למצלמה.
9. ודא שהתא עבר טרנספטציה (שלב 6.6). תוך כדי צפייה בתא, כוונן את המיקוד עד שמישור המוקד הרצוי נראה לעין, והמולקולות נמצאות במיקוד חד.
10. כדי לבחור מישור מוקד שמצלם ליד הממברנה התאית התחתונה, העבר את המיקוד כלפי מטה עד שמולקולות בודדות כבר לא נראות לעין. לאחר מכן, הזיזו את המוקד בהדרגה כלפי מעלה עד שהמולקולות נראות לראשונה.
11. כדי לצלם ליד הממברנה הסלולרית העליונה, המשך להזיז את המיקוד כלפי מעלה במידה הרצויה, תוך ציון המרחק באמצעות כפתור המיקוד של המיקרוסקופ או המיקוד האוטומטי. בחירת אזור מיקוד בין שתי המגבלות הללו תגרום להדמיית אזור באמצע התא.
12. שחרר את חסימת קרן ההפעלה והאיר את הדגימה בעוצמה נמוכה (השתמש במסנני ND2 כדי להחליש את האלומה לעוצמה נמוכה מאוד, בערך <1 W/cm² בדגימה).
13. התחל באיסוף נתונים. רצוי צפיפות גבוהה של מולקולות פעילות; עם זאת, זה קריטי לשלבי הניתוח שמולקולות אלו אינן חופפות מרחבית.
14. נסה לשמור על צפיפות של מולקולות פוטו-אקטיביות גלויות של ~0.1-1 ^{מיקרומטר-2} על ידי התאמת ND2. בדרך כלל, עבור אזור תמונה בקוטר של ~10-20 מיקרומטר, יהיו ~10-100 מולקולות גלויות בבת אחת (ראה איורים 3 ו-4 לעיון). ככל שמספר המולקולות הלא פעילות שנותרו יורד במהלך הרכישה, ייתכן שיהיה צורך להגדיל בהדרגה את כוח הלייזר להפעלה כדי לשמור על הצפיפות.
15. אם רצוי הדמיית TIRF*, יש להרכיב את M5 ו-L1 שניהם על שלב תרגום יחיד (TS, איור 1) כדי להזיז אותם לרוחב (כלומר בכיוון מאונך ללייזר ממש מאחורי הכניסה למיקרוסקופ). כאשר M5 ו-L1 מתורגמים, הלייזרים היוצאים מהמטרה כלפי מעלה דרך הדגימה יתהפכו בהדרגה לצד אחד (זהירות: סכנה בטיחותית בלייזר).
16. כאשר זווית הלייזרים מגיעה ל-90 מעלות מהאנכי, הלייזר המתהווה עצמו ייעלם, לייזר הקריאה הנכנס יוחזר לאחור, ויגיח כקרן הנעה מחוץ לצמצם האחורי של האובייקט, אנטי מקביל לקרן הנכנסת, ונעקר הצידה.
17. במקביל, הקרינה ברקע תהפוך מוחלשת כמעט לחלוטין, ועובי אזור הדגימה המכיל מולקולות בודדות ממוקדות וניתנות להבחנה יופחת מאוד.
    *TIRF יאפשר הדמיה של קטע דק של הדגימה שנמצא ~100-500 ננומטר מעל הכיסוי. מישורי מוקד הדמיה הנמצאים עמוק יותר לתוך הדגימה מושגים בקלות באמצעות תאורת שדה רחב (סעיף 3), אך אינה מתאימה ל-TIRF.
    
18. עם השלמת הרכישה, סגור מיד את תריס המיקרוסקופ וחסום את שתי הקורות. השבת את רווח ה-EM, הגדר את המצלמה להקליט פריים אחד והגדר את אזור קריאת המצלמה לגודלו המרבי.
19. חסום ערוץ אחד על-ידי הנחת כרטיס מעל F3 או F4. עם מסנן מעבר ארוך (>580 ננומטר) המותקן על מנורת המיקרוסקופ, האירו את הדגימה והקרינו תמונה זו למצלמה. הקלט/י תמונה של התא.
20. אופציונלי: כאשר ערוץ אחד עדיין חסום, פתח את הצמצם כך ששטח גדול של הדגימה ייראה על ידי תאורת אור משודרת. צילום תמונה. תמונות אור משודרות אלו מועילות מאוד לצפייה בהקשר של תמונות FPALM המתאימות.
21. הדמיית תאים חיים. כדי לדמות תאים חיים, העביר תאים לפי שלבים 1.1-1.3 אך אל תתקן דגימות אלה. במקום זאת, יישר את ההגדרה כמתואר לעיל במלואה, אך לפני הדמיה של דגימות, הסר אותן מ-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, שטוף 3x ב-PBS וטבול את הדגימה במדיית הדמיה (למשל PBS עם 20 מ"מ גלוקוז). הסרת אמצעי תרבית ושטיפה יפחיתו את הרקע הקשור לרוב המדיה הסלולרית.
22. ניתן לצלם דגימות ב-RT אם רוצים, כמו תאים קבועים, או ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עם שימוש בשלב דגירה המותקן על שלב המיקרוסקופ. יש לטבול דגימה בודדת של תאי NIH 3T3 באמצעי הדמיה למשך לא יותר משעה. זה עשוי להיות מועיל לעקוב אחר האופן שבו תאים מגיבים לטבילה באמצעי הדמיה לפני הכנה לניסויים מסוג זה, כדי לייעל את זמן הטבילה ואולי את הרכב אמצעי ההדמיה כדי להפחית את ההפרעה של התאים.

Results

שפעת המגלוטינין (HA) יוצר אשכולות בסדר גודל של עשרות ננומטר עד מיקרומטר, ואשכולות אלה משתנים במקביל לאקטין (איור 5). התפלגויות מרחביות אלה מאששות הדמיה בקנה מידה גס יותר של שני החלבונים הללו²⁸, ואת התלות של ההתפלגות המרחבית של HA באקטין¹⁹. ניתן להשתמש בתמונות FPALM צבעוניות כדי לתאר את הצפיפות, השטח וההיקף של אשכולות אלה, ואת מידת הקולוקליזציה בין שני המינים הן בקנה מידה ננומטרי והן במיקרו. הרזולוציה של התמונות המתקבלות היא בסדר גודל של עשרות ננומטר^1,17; בתמונות המעובדות ...

Discussion

הדמיה ברזולוציה גבוהה מבוססת לוקליזציה מספקת יכולות רבות עוצמה להדמיה ביולוגית. המסלול מרכיבים אופטיים בודדים המונחים על השולחן למיקרוסקופ פונקציונלי ברזולוציה גבוהה המסוגל לדמות בו זמנית מינים פלואורסצנטיים מרובים בדגימה ביולוגית מציב מספר אתגרים. היבטים מסוימים של ההיערכות קריטיים יותר מאחרים; אנו משתדלים להלן לספק הדרכה למשתמשים פוטנציאליים המתמודדים עם ההיבטים הקשים ביותר של המסלול.

צעדים קריטיים

רזולוציית התמונה המשופרת המסופקת על ידי FPALM וטכניקות דומות דורשת תש...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תאי LabTek II חרוזי	Nunc
	Invitrogen	F-8801	חרוזים לכיול
חרוזי Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	ארבעה חרוזים צבעוניים לכיול
שמן טבילה אובייקטיבי	Zeiss	518F	שמן טבילה למטרה NA גבוהה (תלוי בבחירת המטרה)
HPLC מים	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	או Cellgro 10-090
אנטיביוטיקה	GIBCO	15070-063
סרום	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsin	MPBiomedicals
פרפורמלדהיד	פישר AA433689M זהירות		: רעיל