הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

Summary

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

Abstract

ניתן ליישם מיקרוסקופ סופר רזולוציה מבוסס לוקליזציה כדי לקבל מפה מרחבית (תמונה) של התפלגות מולקולות בודדות המסומנות פלואורסצנטית בתוך דגימה ברזולוציה מרחבית של עשרות ננומטרים. באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים לפוטו-אקטיבציה (PAFP) או ניתנים להחלפה (PSFP) המאוחים לחלבונים מעניינים, או צבעים אורגניים המצומדים לנוגדנים או למולקולות אחרות מעניינות, מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית (FPALM) יכול לדמות בו זמנית מינים מרובים של מולקולות בתוך תאים בודדים. על ידי שימוש בגישה הבאה, אוכלוסיות של מספרים גדולים (אלפי עד מאות אלפים) של מולקולות בודדות מצולמות בתאים בודדים וממוקמות בדיוק של ~10-30 ננומטר. ניתן ליישם את הנתונים המתקבלים להבנת ההתפלגות המרחבית הננומטרית של סוגי חלבונים מרובים בתוך תא. יתרון עיקרי אחד של טכניקה זו הוא העלייה הדרמטית ברזולוציה המרחבית: בעוד שעקיפה מגבילה את הרזולוציה ל~200-250 ננומטר במיקרוסקופ אור קונבנציונלי, FPALM יכול לשנות את קנה המידה של אורך התמונה יותר מסדר גודל קטן יותר. מכיוון שהשערות ביולוגיות רבות נוגעות ליחסים המרחביים בין ביומולקולות שונות, הרזולוציה המשופרת של FPALM יכולה לספק תובנה לשאלות של ארגון תאי שבעבר לא היו נגישות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. בנוסף לפירוט השיטות להכנת דגימה ורכישת נתונים, אנו מתארים כאן את ההגדרה האופטית עבור FPALM. שיקול נוסף עבור חוקרים המעוניינים לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הוא העלות: התקנות פנימיות זולות משמעותית מרוב מכונות ההדמיה הזמינות מסחרית. המגבלות של טכניקה זו כוללות את הצורך באופטימיזציה של התיוג של מולקולות מעניינות בתוך דגימות תאים, והצורך בתוכנת עיבוד לאחר כדי להמחיש תוצאות. אנו מתארים כאן את השימוש בביטוי PAFP ו-PSFP כדי לדמות שני מיני חלבונים בתאים קבועים. מתוארת גם הרחבת הטכניקה לתאים חיים.

Introduction

בעוד שמבנים תאיים קיימים במגוון רחב של קני מידה מרחביים, הדמיה פלואורסצנטית של ארגון תאים בקנה מידה קטן מ-~250 ננומטר מוגבלת במיקרוסקופיה קונבנציונלית בשל האילוץ הפיזי של גבול העקיפה. מגבלה זו התגברה עם הופעת מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטואקטיביות פלואורסצנטית (FPALM¹) וטכניקות דומות^2,3, שיכולות למקם מספר רב של מולקולות בודדות בדיוק של ~10 ננומטר, כדי ליצור תמונות ברזולוציה של כמה עשרות ננומטרים. FPALM מבוסס על שימוש בבקרה אופטית כדי להפעיל ולנטרל תת-קבוצות של מולקולות (לתיאור מלא של FPALM, והוראות כיצד ליישם מערכת הדמיה זו, ראה Gould et al.⁴). טכניקה זו מאפשרת למפות את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות שלמות של מולקולות בודדות, ובכך....

Protocol

שימו לב: ייצוג דיאגרמטי של רכיבים אופטיים המוזכרים בפרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.

1. הכנת דגימת תאים

1. תאי צלחת בצפיפות אופטימלית (עבור תאי NIH-3T3, זה בערך 2-5 x 10⁴ תאים/ס"מ²) בבארות של תא של 8 בארות. התאים צריכים להיות מצופים במדיה שלמה המתאימה לסוג התא, אם כי יש לייצר מדיה ללא אנטיביוטיקה וללא פנול אדום, התורם לפלואורסצנטיות ברקע. שים לב שהתנאים לניסויים בתאים, כגון הטווח האופטימלי של מספרי מעבר, עשויים להיות שונים עבור שורות תאים בודדות.
2. דגירה של תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ (או בתנאים המתאימים לסוג התא) כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי. תאי....

Results

שפעת המגלוטינין (HA) יוצר אשכולות בסדר גודל של עשרות ננומטר עד מיקרומטר, ואשכולות אלה משתנים במקביל לאקטין (איור 5). התפלגויות מרחביות אלה מאששות הדמיה בקנה מידה גס יותר של שני החלבונים הללו²⁸, ואת התלות של ההתפלגות המרחבית של HA באקטין¹⁹. ניתן להשתמש בתמונות FPALM צבעוניות כדי לתאר את הצפיפות, השטח וההיקף של אשכולות אלה, ואת מידת הקולוקליזציה בין שני המינים הן בקנה מידה ננומטרי והן במיקרו. הרזולוציה של התמונות המתקבלות היא בסדר גודל של עשרות ננומטר^1,17; בתמונות המעובדות .......

Discussion

הדמיה ברזולוציה גבוהה מבוססת לוקליזציה מספקת יכולות רבות עוצמה להדמיה ביולוגית. המסלול מרכיבים אופטיים בודדים המונחים על השולחן למיקרוסקופ פונקציונלי ברזולוציה גבוהה המסוגל לדמות בו זמנית מינים פלואורסצנטיים מרובים בדגימה ביולוגית מציב מספר אתגרים. היבטים מסוימים של ההיערכות קריטיים יותר מאחרים; אנו משתדלים להלן לספק הדרכה למשתמשים פוטנציאליים המתמודדים עם ההיבטים הקשים ביותר של המסלול.

צעדים קריטיים

רזולוציית התמונה המשופרת המסופקת על ידי FPALM וטכניקות דומות דורשת תש.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תאי LabTek II חרוזי	Nunc
	Invitrogen	F-8801	חרוזים לכיול
חרוזי Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	ארבעה חרוזים צבעוניים לכיול
שמן טבילה אובייקטיבי	Zeiss	518F	שמן טבילה למטרה NA גבוהה (תלוי בבחירת המטרה)
HPLC מים	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	או Cellgro 10-090
אנטיביוטיקה	GIBCO	15070-063
סרום	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsin	MPBiomedicals
פרפורמלדהיד	פישר AA433689M זהירות		: רעיל