אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתן ליישם מיקרוסקופ סופר רזולוציה מבוסס לוקליזציה כדי לקבל מפה מרחבית (תמונה) של התפלגות מולקולות בודדות המסומנות פלואורסצנטית בתוך דגימה ברזולוציה מרחבית של עשרות ננומטרים. באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים לפוטו-אקטיבציה (PAFP) או ניתנים להחלפה (PSFP) המאוחים לחלבונים מעניינים, או צבעים אורגניים המצומדים לנוגדנים או למולקולות אחרות מעניינות, מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית (FPALM) יכול לדמות בו זמנית מינים מרובים של מולקולות בתוך תאים בודדים. על ידי שימוש בגישה הבאה, אוכלוסיות של מספרים גדולים (אלפי עד מאות אלפים) של מולקולות בודדות מצולמות בתאים בודדים וממוקמות בדיוק של ~10-30 ננומטר. ניתן ליישם את הנתונים המתקבלים להבנת ההתפלגות המרחבית הננומטרית של סוגי חלבונים מרובים בתוך תא. יתרון עיקרי אחד של טכניקה זו הוא העלייה הדרמטית ברזולוציה המרחבית: בעוד שעקיפה מגבילה את הרזולוציה ל~200-250 ננומטר במיקרוסקופ אור קונבנציונלי, FPALM יכול לשנות את קנה המידה של אורך התמונה יותר מסדר גודל קטן יותר. מכיוון שהשערות ביולוגיות רבות נוגעות ליחסים המרחביים בין ביומולקולות שונות, הרזולוציה המשופרת של FPALM יכולה לספק תובנה לשאלות של ארגון תאי שבעבר לא היו נגישות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. בנוסף לפירוט השיטות להכנת דגימה ורכישת נתונים, אנו מתארים כאן את ההגדרה האופטית עבור FPALM. שיקול נוסף עבור חוקרים המעוניינים לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הוא העלות: התקנות פנימיות זולות משמעותית מרוב מכונות ההדמיה הזמינות מסחרית. המגבלות של טכניקה זו כוללות את הצורך באופטימיזציה של התיוג של מולקולות מעניינות בתוך דגימות תאים, והצורך בתוכנת עיבוד לאחר כדי להמחיש תוצאות. אנו מתארים כאן את השימוש בביטוי PAFP ו-PSFP כדי לדמות שני מיני חלבונים בתאים קבועים. מתוארת גם הרחבת הטכניקה לתאים חיים.
מבוא
בעוד שמבנים תאיים קיימים במגוון רחב של קני מידה מרחביים, הדמיה פלואורסצנטית של ארגון תאים בקנה מידה קטן מ-~250 ננומטר מוגבלת במיקרוסקופיה קונבנציונלית בשל האילוץ הפיזי של גבול העקיפה. מגבלה זו התגברה עם הופעת מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטואקטיביות פלואורסצנטית (FPALM1) וטכניקות דומות2,3, שיכולות למקם מספר רב של מולקולות בודדות בדיוק של ~10 ננומטר, כדי ליצור תמונות ברזולוציה של כמה עשרות ננומטרים. FPALM מבוסס על שימוש בבקרה אופטית כדי להפעיל ולנטרל תת-קבוצות של מולקולות (לתיאור מלא של FPALM, והוראות כיצד ליישם מערכת הדמיה זו, ראה Gould et al.4). טכניקה זו מאפשרת למפות את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות שלמות של מולקולות בודדות, ובכך....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
שימו לב: ייצוג דיאגרמטי של רכיבים אופטיים המוזכרים בפרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.
1. הכנת דגימת תאים
- תאי צלחת בצפיפות אופטימלית (עבור תאי NIH-3T3, זה בערך 2-5 x 104 תאים/ס"מ2) בבארות של תא של 8 בארות. התאים צריכים להיות מצופים במדיה שלמה המתאימה לסוג התא, אם כי יש לייצר מדיה ללא אנטיביוטיקה וללא פנול אדום, התורם לפלואורסצנטיות ברקע. שים לב שהתנאים לניסויים בתאים, כגון הטווח האופטימלי של מספרי מעבר, עשויים להיות שונים עבור שורות תאים בודדות.
- דגירה של תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 (או בתנאים המתאימים לסוג התא) כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי. תאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המוגלוטינין (HA) של נגיף השפעת יוצר צבירים בסדרי גודל של עשרות ננומטרים עד מיקרומטרים, וצבירים אלו מראים מיקום משותף (colocalization) משתנה עם אקטין (איור 5). התפלגויות מרחביות אלו מאששות דימות בקנה מידה גס יותר של שני חלבונים אלו28, ואת התלות של ההתפלגויות המרחביות של HA באקטין19. ניתן להשתמש בדימויי FPALM רב-צבעוניים כדי לתאר בנוסף את הצפיפות, השטח וההיקף של צבירים אלו, ואת מידת המיקום המשותף בין שני המינים הן בקנה מידה ננומטרי והן בקנה מידה מיקרומטרי. רזולוציית התמונות המתקבלות ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיה ברזולוציה גבוהה מבוססת לוקליזציה מספקת יכולות רבות עוצמה להדמיה ביולוגית. המסלול מרכיבים אופטיים בודדים המונחים על השולחן למיקרוסקופ פונקציונלי ברזולוציה גבוהה המסוגל לדמות בו זמנית מינים פלואורסצנטיים מרובים בדגימה ביולוגית מציב מספר אתגרים. היבטים מסוימים של ההיערכות קריטיים יותר מאחרים; אנו משתדלים להלן לספק הדרכה למשתמשים פוטנציאליים המתמודדים עם ההיבטים הקשים ביותר של המסלול.
צעדים קריטיים
רזולוציית התמונה המשופרת המסופקת על ידי FPALM וטכניקות דומות דורשת תש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
S.T.H. ו-M.J.M. מחזיקים בפטנטים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. S.T.H. מכהן במועצה המדעית המייעצת של Vutara, Inc.
תודות
המחברים רוצים להודות לפיליפ אנדרסן, מתיו פרנט ושון קרטר על תכנות מחשבים, סיוע טכני ושיחות מועילות ולפט ביארד על הסיוע האדמיניסטרטיבי. עבודה זו מומנה על ידי פרס הקריירה של NIH K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, המכון הטכנולוגי של מיין MTAF 1106 ו-2061, והקרן לשיפור כלכלי של מיין.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי LabTek II חרוזי | Nunc | ||
| Invitrogen | F-8801 | חרוזים לכיול | |
| חרוזי Tetraspeck | Invitrogen | T-7279 | ארבעה חרוזים צבעוניים לכיול |
| שמן טבילה אובייקטיבי | Zeiss | 518F | שמן טבילה למטרה NA גבוהה (תלוי בבחירת המטרה) |
| HPLC מים | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Media | ATCC | 30-2003 | או Cellgro 10-090 |
| אנטיביוטיקה | GIBCO | 15070-063 | |
| סרום | Thermo Scientific | SH30087.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 52887 | |
| Optimem I | GIBCO | 11058-021 | |
| Trypsin | MPBiomedicals | ||
| פרפורמלדהיד | פישר AA433689M זהירות | : רעיל |
מקורות
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
