מאמר שיטה

שימוש במערכת מעקב תלת מימד אוטומטית לתיעוד פרטים ושל דגי זברה בוגרים

12.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50681

⸱

5 בדצמבר 2013

 ,  , 
1R&D, xyZfish

במאמר זה

סיכום

מתואר השימוש במערכת וידאו אוטומטית תלת מימדית שיכולה לעקוב אחר יחידים וקבוצות של דגי זברה. כדוגמה ליישום אנו בוחנים את ההשפעות של אנטגוניסט הקולטן NMDA MK-801 על דגי זברה.

תקציר

כמו חיות ימיות רבות, דג הזברה (Danio rerio) נע במרחב תלת-ממדי. לכן עדיף להשתמש במערכת הקלטה תלת מימדית כדי ללמוד את התנהגותו. מערכת מעקב הווידאו האוטומטית המוצגת משיגה זאת על ידי שימוש במערכת מראה והליך כיול המתקן את השגיאה הניכרת שנוצרה על ידי מעבר האור ממים לאוויר. בעזרת מערכת זו ניתן להקליט גם יחידים וגם קבוצות של דגי זברה בוגרים. לפני השימוש יש לכייל את המערכת. המערכת מורכבת משלושה מודולים: הקלטה, שחזור נתיב ועיבוד נתונים. מוצגים הפרוטוקולים שלב אחר שלב לכיול ושימוש בשלושת המודולים. בהתאם למערך הניסוי, המערכת יכולה לשמש לבדיקת ניאופוביה, סלידה לבנה, לכידות חברתית, ליקויים מוטוריים, חקר אובייקטים חדשים וכו'. זה מבטיח במיוחד ככלי צעד ראשון לחקר ההשפעות של תרופות או מוטציות על דפוסי התנהגות בסיסיים. המערכת מספקת מידע על התפלגות אנכית ואופקית של דג הזברה, על מרכיבי xyz של פרמטרים קינמטיים (כגון תנועה, מהירות, תאוצה וזווית סיבוב) והיא מספקת את הנתונים הדרושים לחישוב פרמטרים ללכידות חברתית בעת בדיקת מים רדודים.

מבוא

דג הזברה הפך למודל חשוב למחקר ביולוגי ופרמקולוגי1-3. מעקב אחר דפוסי התנועה והתפוצה המרחבית של דג זברה בודד ושל דגי זברה הוא לא יסולא בפז. מחקרים ישנים יותר מיישמים כימות ידני על סמך תמונות מוקלטות4. כעת, מערכות מעקב וידאו אוטומטיות דו-ממדיות נמצאות בשימוש נפוץ5. עם זאת, מכיוון שדגי הזברה ובעלי חיים ימיים ולא מימיים רבים אחרים נעים במרחב תלת מימדי, העניין במערכות תלת מימד הולך וגדל6. מערכת התלת מימד המתוארת פורסמה לראשונה בשנת 20077. לפרטים טכניים והשוואות למערכות אחרות ראה8. היתרון הבסיסי של מערכת זו בהשוואה למערכות אחרות הוא שהיא רוכשת שתי (אופציונלי שלוש) תצוגות סינכרוניות ועצמאיות באמצעות מערכת שיקוף ומשתמשת בפרוטוקול כיול דו-שלבי. בשלב הראשון מכוילת הגיאומטריה התלת מימדית של מערכת הסטריאו (שנוצרה על ידי המצלמה והמראות). בשלב השני מתוקנות השגיאות הלא ליניאריות שהוצגו על ידי שבירת האור. כאשר חוקרים בעלי חיים ימיים, ההשפעה של שבירת האור יכולה להיות ניכרת כאשר היא לא מתוקנת. מערכות אחרות שפורסמו עד כה (אפילו פיתוחים חדשים יותר9) משמיטות את הליך הכיול הדו-שלבי. לפרטים טכניים על זיהוי אובייקטים, חסימה עם מעקב אחר אובייקטים מרובים, רעש ג'יגינג וכו'. הקורא מופנה לפרסומים המקוריים8,9. המערכת אומתה לחקר תגובות התנהגותיות דמויות חרדה10,11,8,11,12, ובמחקר ראשוני, להתנהגות אנטגוניסטית בדגי זברה13. הוא נבדק גם עבור מיני דגים אחרים (דג זהב8, זנב חרב, דוקרני נמר) ועבור עכברים9.

להלן מתוארים הפרוטוקולים לכיול ולשימוש במערכת ותוצאות ניסוי הבודק את ההשפעות של האנטגוניסט הלא תחרותי לקולטן NMDA MK-801 על דג זברה רדוד מוצגות כדוגמה מייצגת להדגמת סוג הנתונים שניתן להשיג עם המערכת.

הן בסביבה הטבעית והן באקווריומים, דג הזברה שוחה בדרך כלל במיםרדודים 14. נראה כי העדפות ה-Shoaling תלויות במספר גורמים, כגון גידול, מין וזמינות מזון14,15. מעניין שהמרחק בין דג זברה בודד במים רדודים הופך קטן יותר כאשר קיימים אותות של סכנה פוטנציאלית, כגון פרומוני אזעקה16 או חידוש11. לכן פרדיגמת ה-shoaling משמשת גם לבדיקת תרופות נוגדות חרדה17. היררכיות דומיננטיות18 ולמידה חברתית19 הן היבט מרתק של התנהגות דג הזברה. בגלל האופי ההתנהגותי החברתי המפותח שלו, דג הזברה הפך גם לעניין עבור מחקר אוטיזם20,21.

MK-801 דווח כמשנה התנהגות חברתית בדג הזברה5,22,23, מה שמזכיר את השפעותיו על יונקים24. עם זאת, ל-MK-801 יש גם השפעות רבות אחרות על התנהגויות אחרות (כגון התנהגות שחייה, הימנעות מעכבת והעדפת מקום25-27). לכן זה קריטי, בניסויים ראשוניים, להשיג כמה שיותר מידע מתצפיות בסיסיות. זה יספק את הבסיס לתכנון ניסויים ממוקדים יותר.

סקר של מכשיר ההקלטה והתוכנה

בתצורתו הנוכחית, מיכל התצפית (25 ס"מ x 25 ס"מ x 18 ס"מ, אורך x רוחב x גובה), המחזיק את דג הזברה, ממוקם בתא התצפית (91 ס"מ x 46 ס"מ x 56 ס"מ, אורך x רוחב x גובה). החדר מכיל גם מצלמה, מראה התלויה בזווית של כ->45 מעלות מעל המיכל, ופסי תאורת LED. איור 1 מציג תרשים פשוט. המצלמה מתעדת הן את המבט הקדמי והן את המבט העליון (מראה) כדי לבנות את המסלולים התלת-ממדיים של דג הזברה על ידי קביעת קואורדינטות ה-x, y וה-z שלו. למטרות התמצאות, וקטורי הקואורדינטות מוצגים בפינה השמאלית הקדמית של מיכל התצפית (מיקום ביחס למצלמה), התואם את הווקטורים המוצגים בתצוגות התלת מימד (למשל איור 15) שנוצרו על ידי מודול שחזור הנתיב (ראה בהמשך). קצב הדגימה תלוי במצלמה ובמחשב. בניסויים שלנו זה בערך 40 פריימים לשנייה (fps). הרזולוציה המרחבית של המסגרות המוקלטות היא 640 x 480 פיקסלים (תצורה זו נבחרה כאיזון אופטימלי בין רזולוציה מרחבית לזמנית). נדרש Windows XP ומעלה.

לפני ההקלטה הראשונה, יש לכייל את המערכת כדי לקבוע את מיקומי דפנות המיכל ופני המים, לקבוע את גורם קנה המידה של המסגרות המוקלטות ולהתאים את השגיאה הגדולה שנוצרת משבירת האור בעת מעבר ממים לאוויר. באופן עקרוני, יש לבצע כיול רק במהלך ההתקנה הראשונית ולאחר הזזה או החלפה של חלקים מההגדרה, כגון מצלמה או מראה. עם זאת, כדאי לבדוק מעת לעת אם הכיול עדיין תקין ולכייל מחדש, במידת הצורך.

התוכנה מורכבת משלושה מודולים. מודול ההקלטות מתעד את המסגרות (שתי דוגמאות למסגרות מוצגות באיור 2). מודול המסלול משחזר את הנתיבים עבור כל דג זברה. מודול עיבוד הנתונים מחשב מגוון של פרמטרים קינמטיים ומרחביים סטנדרטיים. לצורך ניתוח נוסף, ניתן לייבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני או לתוכנה סטטיסטית.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. כיול

  1. הנח מיכל תצפית ריק בתא כך שרגלי המיכל יוכנסו לחורים המסופקים ליישור נכון. כוונו את המיכל כך שהקירות השקופים למחצה (מטרת המבנה שלהם היא להפחית השתקפויות) יפנו לצד הרחוק ומימין למצלמה.
  2. פתח את מודול ההקלטה, בחר 'בקרת מצלמה' והתאם את 'רווח' ו'תריס' (לאחר ביטול הבחירה בהם, תיבות בצד ימין) כך שהתמונה תהיה ברורה. הנח את מראת הצד בזווית של כ-45 מעלות בצד שמאל של מיכל התצפית כך שמבט מהצד של המיכל על צג המחשב יהיה גלוי במלואו. יתר על כן, המראה צריכה להיות מיושרת כך שהדופן הקדמית של המיכל תיראה כקו אחד (כפי שמצוין על ידי החץ באיור 3).
  3. חבר את לוח הכיול ליציאה המקבילה (של כרטיס המצלמה) ולחץ על כפתור 'הפעלה/כיבוי של לוח LED' במודול ההקלטה כדי להפעיל את הנוריות.
  4. הנח את לוח הכיול במיכל התצפית הריק כך שניתן יהיה לראות את 5 נוריות הלד בחזית, העליונה והצד view על צג המחשב כמו באיור 3 (לפעמים הכבל חוסם את התצוגה, במקרה זה הזז אותו). ודא גם שהנוריות נמצאות מתחת לסימני מפלס המים (סימנים אלו חרוטים במיכלי התצפית בגובה 135 מ"מ מהחלק התחתון הפנימי של המיכל) ושמיקום הפאנל יציב (כך שהוא לא יזוז בעת מילוי המיכל במים בשלב 1.9).
  5. כבו את האורות בתא התצפית וסגרו את הווילון (היזהרו לא לגעת בכבל של לוח הכיול או במראה הצדדית).
  6. לחץ על כפתור 'מיקום נתונים' וצור או בחר תיקיה עבור הכיול files. קבצים אלה ישמשו עבור כל ההקלטות (או הניסויים) הבאים עד שיהיה צורך בכיול מחדש. לפיכך, באופן אידיאלי הפוך את נתוני הכיול לחלק משם תיקיית הכיול.
  7. כוונן את שלוש התיבות האדומות על מסך המחשב כך שכל אחת מהן מקיפה רק את 5 נוריות ה-LED בכל אחת משלוש התצוגות (איור 4, פאנל שמאלי). השתמש שוב ב'רווח' ו'תריס' תחת 'בקרת מצלמה' כדי לקבל תמונות ברורות של נוריות הלד, ללא תמונות של נקודות אור אחרות (הנובעות מרעש, השתקפויות או טיפות מים על דופן המיכל), כמו באיור 4, לוח ימני.
  8. כבה את הנוריות ולחץ על כפתור 'איסוף כיול ללא מים'. על מסך המחשב מופיעים 5 תגים ('x') ממוספרים מ-0-4. הפעל את הפאנל. מיקומי התגים צריכים להיות חופפים לנורות הלד. אם לא, חזור על שלב 1.7 (ראה איור 4 להמחשה של הקצאת תגים שגויה בחלונית השמאלית והקצאת תגים נכונה בחלונית הימנית).
  9. מלאו את תא התצפית במים עד לסימן. נוריות הלד צריכות להיות מתחת למפלס המים (כפי שהוסבר בשלב 1.4). אם הם מעל פני המים, רוקנו את המיכל וחזרו לשלב 1.4. בעת מילוי המים למיכל, היזהר שלוח ה-LED לא יזוז. עם זאת, אם זה קורה, רוקן את המיכל וחזור לשלב 1.4. זה חשוב, מכיוון שהכיול מבוסס על קביעת ההבדלים בין מיקומי הנוריות המוקלטים ללא ועם מים.
  10. לחץ על כפתור 'איסוף כיול עם מים'. שוב, כמו בשלב 1.8, יופיעו על המסך חמישה תגים, אשר ברוב המקרים יתקזזו מעט מאלה שהתקבלו במהלך הכיול ללא מים. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך לכוונן מחדש את הרווח והתריס. חזור על הפעולה עד שהתגים ממוקמים כהלכה על גבי הנוריות (כמו באיור 4, לוח ימין).
  11. הדליקו את האורות בתא התצפית, כוונו את הרווח והתריס (תחת 'בקרת מצלמה') כך שהתמונה לא תהיה בהירה מדי.
  12. איור 5 מציג את שש הנקודות שיש לבחור ברצף על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני. ודא שהנקודות נמצאות בקווים המיועדים: 1. מפלס מים במבט קדמי, 2. רכס עליון שמאלי של מיכל במבט עליון, 3. קו אנכי המתאר את הקיר הקדמי במבט מהצד. אורך התור אינו חיוני. בין עמדות לחיצה 1 ו-2, 3 ו-4, ו-5 ו-6, יופיעו קווים ישרים (המספרים בפועל לא יופיעו על המסך). לחץ על 'איסוף מידע על מיכל' כדי לשמור מידע זה.
  13. הסר גם את מראת הצד וגם את לוח ה-LED ומלא את המים בדיוק עד לסימן. בחר 'התחל הקלטה'. חלון חדש מבקש את משך הזמן בדקות. למטרה הנוכחית דקה אחת מספיקה. לחץ על אישור.
  14. לאחר ההקלטה, צא ממודול ההקלטה, פתח את מודול המסלול, בחר את תיקיית הכיול (שנעשתה בשלב 1.6) עם 'מיקום נתונים' (טעינת הקובץ עשויה להימשך זמן מה). תיקיה זו מכילה את קבצי הכיול ואת הקבצים של הנתונים שהוקלטו זה עתה (שלב 1.13).
  15. לחץ על כפתור 'השגת רקע'. חלון חדש נפתח, מבלי לשנות דבר לחץ על אישור. המתן עד שתופיע תמונה (הפוכה) של מיכל התצפית על הצג. לאחר מכן לחץ על 'טען רקע'. תמונת הרקע תתוקן. נפתח חלון חדש המבקש להתאים את הקופסאות. פשוט לחץ על אישור.
  16. לחץ ברצף על הכפתור השלישי עד השביעי: 'טען התכתבות ללא מים', 'כיול מצלמות וירטואליות', 'טען התכתבויות שבורות', 'אסוף גיאומטריות של מיכל', 'אחזר מידע על מיכל בעלי חיים'. שלב אחרון זה יכול להימשך מספר דקות. זה הושלם כאשר שלושה קווים לבנים מופיעים על המסך (שהם הקווים ששורטטו בשלב 1.12). לחץ על כפתור "שמור מידע על מיכל".
  17. לחץ על כפתור 'איסוף נפח'. כעת, כפי שמוצג באיור 6, סמן ברצף את 8 הפינות של גוף המים, שהוא קוביה. עבור כל נקודה, לחץ עליה תחילה בתצוגה הקדמית ולאחר מכן בתצוגה העליונה.
  18. בחר 'תלת מימד' בפינה השמאלית של החלון. כעת נפתח חלון חדש המציג את קווי המתאר של תיבה עם תחתית לבנה (כמו באיור 15, אך ללא המסלול). לחץ לחיצה ימנית על העכבר כדי לבחור סיבובים ותרגומים של תצוגת התיבה. אם לא מופיעה תמונה או אם התמונה אינה של קוביה (כלומר בשלב 1.17 הפינות נלחצו באמצעות לחצן העכבר הימני בסדר שגוי), בצע את הפעולות הבאות: בעת היציאה, אך לא סגירת מודול המסלול, באמצעות Windows עבור לתיקיית הכיול (שנעשתה בשלב 1.6), בחר תיקיית משנה 'נתוני מיכל בעלי חיים' ומחק את הקובץ בשם TankVertices וחזור על שלב 1.17.
  19. מזל טוב, הכיול הושלם. באופן אידיאלי, יש לבצע ריצת מבחן עם דג דמה כדי לבדוק אם הכל עובד כשורה. החדשות הטובות הן שכיול מחדש צריך להתבצע רק אם מיקומי המראה או המצלמה השתנו (אפילו רק במעט) או אם יש בעיות במעקב (ראה סעיף 3).

2. הקלטה

  1. הנח את מיכל התצפית המלא עד לסימנים במים לתוך תא התצפית כך שרגלי המיכל מוכנסות לחורים המסופקים ליישור נכון. כוונו את המיכל כך שהקירות השקופים למחצה (או הקירות הלבנים בדוגמה שלנו - ראו דיון) פונים לצד הרחוק וימינה כפי שניתן לראות מהמצלמה.
  2. הדליקו את האורות בתא, הכניסו את הדג (הניסיוני או הדמה) למיכל וסגרו את הווילונות. הערה: המערכת יכולה להקליט מספר דגים (ראה סעיף תוצאות מייצגות); עם זאת, רצוי לצבור ניסיון עם המערכת על ידי הקלטת דג בודד תחילה.
  3. פתח את מודול הרשומה. על המסך מופיעה התמונה של התצוגה הקדמית והעליונה (מראה) של המכולה. ייתכן שהתמונה לא תהיה אידיאלית (למשל חשיפת יתר, למשל איור 7) וייתכן שיהיה צורך להתאים אותה (שלושת השלבים הבאים) כדי להשיג ניגודיות טובה בין דגים לרקע (למשל איור 8).
  4. בחר 'בקרת מצלמה' ובחלון 'הגדרות כלליות' שנפתח, כוונן את 'תריס' ו'רווח' (לאחר ביטול הבחירה בתיבות המתאימות מימין, ראה איור 9) באופן שהתמונה לא תהיה חשופת יתר על המידה ויש ניגודיות טובה בין הדג לרקע.
  5. בצד שמאל של חלון 'בקרת מצלמה' בחר 'איזון לבן/צבע' ובחלון החדש בטל את הבחירה בתיבה 'אוטומטי' והתאם את ערכי האדום והכחול (ראה איור 10) כדי להשיג את ניגודיות הצבעים הטובה ביותר הן מלפנים והן מלמעלה view.
  6. ייתכן שיהיה צורך לעבור כמה פעמים בין התאמת צבע (תחת 'איזון לבן/צבע') לבין התאמת רווח ותריס (תחת 'הגדרות כלליות') כדי לקבל את הגדרת המצלמה הטובה ביותר. שים לב שגם אם אתה מרוצה ללא כל התאמה, חיוני לבטל את הבחירה בתיבות 'תריס', 'רווח' ו'אוטומטי' (כפי שהוסבר בשלבים 2.4 ו-2.5), אחרת הרקע ישתנה במהלך ההקלטה מה שלא יאפשר לחלץ את המסלולים. אל תשנה אף אחת מההגדרות האחרות. בסיום, סגור את חלון 'בקרת מצלמה'.
  7. מהתפריט הראשי של מודול הרשומות בחר 'מיקום נתונים' כדי ליצור או לפתוח תיקיה שנוצרה קודם לכן. שימו לב שכל הקלטה (למשל דג או שאול) מקבלת תיקייה משלה, שבאופן אידיאלי אמורה להיות תת-תיקייה של תיקיית הניסוי.
  8. לחץ על 'התחל הקלטה'. נפתח חלון המבקש את משך ההקלטה בדקות (הזן רק מספרים שלמים). לחץ על 'אישור', שמתחיל את סשן ההקלטה בפועל.
  9. אם ההקלטה הושלמה, צא מהתוכנית. לפני הקלטת הדג הבא מומלץ להפעיל מחדש את המחשב. השתמש באפשרות הפעל מחדש ב-Windows כדי לשמר את הגדרות המצלמה (משלבים 2.4 ו-2.5). הצורך להפעיל מחדש את המחשב בין ההקלטות נובע מכמה בעיות בכרטיס המצלמה.
  10. לפני שתעבור למודול המסלול לשחזור נתיב, העתק והדבק את תיקיות המשנה 'נתוני מיכל בעלי חיים' ו'נתוני התכתבות' מתיקיית הכיול (שנעשתה בסעיף הראשון של פרוטוקול זה) לכל תיקיה שנוצרה במהלך ההקלטה. בתיקיות האחרונות הללו קיימות שתי תיקיות משנה אחרות, כלומר 'נתונים גולמיים' ו'חותמות זמן'. הראשון מכיל את כל המסגרות המוקלטות בפורמט JPEG; האחרון מכיל מידע על המספר הכולל של המסגרות והמרווחים בין המסגרות (ב-msec).

3. שחזור נתיב

  1. פתח את מודול המסלול, לחץ על 'מיקום נתונים' כדי לבחור את התיקיה שנוצרה עם מודול ההקלטה ולאחר מכן לחץ על כפתור 'הגדרת מערכת' כדי לפתוח את 'הפרמטרים' (ראה איור 11).
  2. בחר סף צבע לתצוגה עליונה ותחתונה. ערך התחלתי טוב הוא 1,000. אם ערך זה נמוך, סביר יותר שהתוכנה תקליט רעש. עם זאת, אם הערך גבוה מדי, הדג עשוי להיות מתחת לטווח הזיהוי. מאוחר יותר (שלבים 3.11 ו- 3.12) ייתכן שיהיה צורך להתאים מחדש את ספי הצבע. שימו לב גם שסף הצבע העליון והתחתון לא חייבים להיות זהים.
  3. בחר סף גודל תצוגה עליון ותחתון. ערך התחלתי טוב לדג זברה בינוני הוא 10, לדג גדול מאוד 20, ולדג קטן מאוד 5. ככל שסף הגודל גבוה יותר, כך הסיכוי לקלוט רעש קטן יותר. עם זאת, אם הוא גבוה מדי, ייתכן שגם התוכנה לא תוכל לזהות את הדג. שוב, בשלב 3.11 ו- 3.12 ייתכן שיהיה צורך להתאים מחדש את ספי הגודל. שימו לב גם שסף הגודל העליון והתחתון לא חייבים להיות זהים.
  4. עבור 'סף גודל עליון' ערך של 3,000 הוא בדרך כלל טוב ועבור 'אורך ספציפי' השאר אותו על 220 (כבר מוגדר מראש). 'מספר הדגים' מתייחס למספר הדגים במיכל התצפית. 'מספר מקסימלי של נקודות' מתייחס למספר הכולל של מסגרות. זכור (או רשום) את המספר הזה או מספר מעט נמוך יותר (לדוגמה, 45,703 עשוי להיזכר כ-45,000). לחץ על אישור.
  5. לחץ ברצף על הלחצנים 'טען התכתבות ללא מים', 'כיול מצלמות וירטואליות' ו'טען מידע על מיכל בעלי חיים'. הודעת שגיאה תיווצר אם תיקיות המשנה של הכיול 'נתוני מיכל בעלי חיים' ו'נתונים מתאימים' לא הועתקו לתיקיית הניסוי הנוכחית (ראה שלב 2.10). אם כן, העתק והדבק את תיקיות המשנה הללו כעת ולחץ שוב על הכפתורים.
  6. לחץ על הכפתור 'השגת רקע'. חלון חדש יבקש למלא 'מאת' ו'אל' בערכי ברירת המחדל 0 ו-100, בהתאמה. שנה את ה-100 למספר המקסימלי של פריימים (בדוגמה שניתנה בשלב 3.4 ניתן לפשט זאת כ-45,000). לחץ על אישור.
  7. המתן עד להופעת תמונה (מעוותת). לאחר מכן לחץ על 'טען רקע' מה שיביא ליצירת תמונת הרקע הנכונה. הדג לא אמור להיות גלוי בתמונת רקע זו. אם הדג גלוי, נסה להשיג רקע טוב יותר מקטעי הקלטה אחרים (למשל נסה 0-1,000, 1,000-2,000 וכו' בשלב 3.6).
  8. אם הדג לא זז כלל במהלך ההקלטה, הדרך היחידה להשיג רקע היא להסיר את הדג ולבצע הקלטה קצרה חדשה ללא הדג, אך עם אותן הגדרות 'בקרות מצלמה' (זה חשוב). רכוש את הרקע והעתק את תיקיית המשנה 'נתוני רקע' לתיקיית הניסוי הנוכחית. כעת לחץ על 'טען רקע', אל תלחץ על 'רכוש רקע'. שים לב שפתיחה וסגירה של הווילון גורמות לעתים קרובות לשינוי מסוים ברקע, ולכן ייתכן שיהיה צורך להתאים את הספים בשלבים 3.2 ו-3.3 כדי להפחית את הרעש. שלב 3.11 מראה כיצד לבדוק אם יש רעש.
  9. לאחר טעינת הרקע, התאם את שלוש התיבות האדומות (בעזרת העכבר) כפי שמתואר באיור 12. הקופסאות מסמנות את האזורים שבהם התוכנה מחפשת את הדגים. סגור את התיבה משמאל (כלומר צמצם אותה לקו או לנקודה) מכיוון שהצד view משמש רק לכיול (כפי שהוסבר בשלב 1.7).
  10. לחץ על כפתור 'התחל ליצור מסלולים'. נפתח חלון המבקש את מספר המסגרת ההתחלתית. לכו עם ברירת המחדל '0'. לאחר לחיצה על 'אישור', נפתח חלון 'הקצאות תגים' (ראה איור 13). לחץ על 'צעד קדימה' עד שהתג ('X0') יופיע על המסך. אם התג לא ממוקם על תמונת הדג, לחץ על 'לא' עד שהוא ממוקם כהלכה. לאחר מכן לחץ על 'Go'. אם זה אף פעם לא מוקצה נכון (או בכלל) לחץ על 'Go' בכל מקרה וחפש את הבעיה (השלב הבא).
  11. שחזור השביל מתחיל. באופן אידיאלי, יש למקם את התג תמיד (או לפחות רוב הזמן) על תמונת הדג. אם הוא ממוקם לעתים קרובות בצורה שגויה, פתח את חלון 'מידע' (אפשרות שנייה מעל מסך הווידאו). איור 14A מראה את המקרה האידיאלי, שבו רואים רק את קווי המתאר של הדגים. איור 14B מציג מקרה של רעש מוגזם המונע את הקצאת התגים הנכונה. אם אתם רואים תמונה ברורה של הדג ללא רעש (כמו באיור 14A), אולם התג לעולם או רק לעתים רחוקות יוקצה כהלכה, אז הסיבה הסבירה ביותר היא שהכיול כבוי. כיול מחדש וביצוע מחדש של שחזור הנתיב. אם במהלך הכיול, המראה והמצלמות אינן מוזזות, ניתן להשתמש בנתוני הכיול החדשים עבור ההקלטות שבוצעו בעבר.
  12. במקרה של רעש מוגזם (כמו באיור 14B), לחץ על 'עצור' בתפריט הראשי ובחר ספי צבע וגודל חדשים (שלבים 3.2 ו-3.3). בדוק גם אם ניתן להקטין מעט את התיבות האדומות (שלב 3.9) (למשל כדי לא לכלול את הרעש שנוצר על ידי תנועות מים בחלק העליון). שימו לב שלפעמים התוכנית 'תקועה' (אם לא ניתן היה להקצות תג בכלל): במקרה זה הפעילו מחדש את התוכנית.
  13. צפו במסלול על מסך התלת מימד (אפשרות שלישית מעל המסך). איור 15. מייצג דוגמה למסלול. על ידי לחיצה ימנית על העכבר, בחר בין סיבוב לתרגומים של תצורת התלת מימד.
  14. לאחר השלמת המסלול, לחץ ברצף על הכפתורים 'שמור' (לא 'עצור', שמוחק את המסלול!), 'ניקוי מסלול' ו'החלקת מסלול'. נפתח חלון חדש המציג את פרמטרי המסנן להחלקה (איור 16). אל תשנה את ערכי ברירת המחדל לפני שצברת ניסיון נוסף עם המערכת. לחץ על 'אישור'.
  15. בשלב זה אמור להיות ברור מדוע בחירת הגדרת מצלמה טובה (עם ניגודיות טובה בין דג לרקע) לפני ההקלטה (ראה שלבים 2.4-2.6) הייתה כל כך חשובה. המשך לעיבוד נתונים.

4. עיבוד נתונים

  1. ראשית, הסתכלו על התיקייה ששימשה לתיעוד הדגים (איור 17). הוא מכיל תיקיות משנה 'נתוני מיכל בעלי חיים' ו'נתוני התכתבות' שהועתקו מתיקיית הכיול (שלב 2.10), תיקיות המשנה 'חותמות זמן' ו'נתונים גולמיים' שנוצרו במהלך הקלטת הדגים ותיקיות המשנה 'נתוני רקע' ו'מסלולים' שנוצרו במהלך שחזור הנתיב.
  2. איור 17 מראה גם כי תיקיית המשנה 'מסלולים' מכילה שלושה קבצים. הקובץ point.smoothed-file הוא הקובץ שישמש להמשך עיבוד נתונים. במקרה של רישום דגים מרובים (למשל ניסוי שאולינג), עבור כל דג ייווצר קובץ נקודה.smoothed-נפרד.
  3. איור 18 מציג את החלק העליון של קובץ point.smoothed-לדוגמה. השורה הראשונה נותנת את המספר הכולל של דגימות או פריימים, השורה השנייה את משך ההקלטה (בדקות) והשורה השלישית את הקואורדינטות (רצף: x, z, y) של מרכז גוף המים ביחס למצלמה. לאחר מכן מופיע קו אחד לכל מסגרת שנותן את קואורדינטות x-, y-, z (במ"מ) עבור הדג ואת משך הדגימה (בשניות).
  4. ישנן שתי דרכים לעבד את הנתונים המסופקים ב-point.smoothed-files: השתמש במודול עיבוד הנתונים או השתמש בתוכנות אחרות, כגון Excel או MATLAB כדי לבצע חישובים שאינם משולבים (עדיין) במודול עיבוד הנתונים.
  5. פתח את מודול עיבוד הנתונים, בחר 'פרויקט' בסרגל הכלים, ולאחר מכן מהתפריט הנפתח בחר 'חדש' ולאחר מכן מלא שם עבור הניסוי. בחר 'ערוך פרויקט' בסרגל הכלים, בחר 'הוסף לפרויקט' מהתפריט הנפתח, ואחריו 'קבוצה חדשה' ומלא שם לקבוצה (למשל 'פקדים'). שימו לב, ברגע זה לא ממש משתמשים בשמות הפרויקטים והקבוצות, אך יש למלא את השמות. ניתן להשתמש בתיקיות שנוצרו לאחסון קבצי הפלט (ראה שלב 4.10).
  6. בחר קבוצה (למשל 'פקדים') בחלון הימני (ראה איור 19). סרגל הכלים ישתנה. בחרו 'עריכת קבוצה', לאחר מכן 'הוספה לקבוצה' מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן 'מדידות חדשות'. פעולה זו תפתח דפדפן. פתח את התיקיה שנעשתה במהלך ההקלטה (שלב 2.7), בחר את תיקיית המשנה 'מסלולים' ולאחר מכן את ה-point.smoothed-file. בדוגמה המוצגת באיור 19, עבור קבוצה-A נטענו שישה קבצים, עבור קבוצה-B ארבעה קבצים. (שימו לב שבדוגמה המאויירת לקבצים המוחלקים יש את הסיומות 0 ו-1, מכיוון שבניסוי זה נבדקו שני דגי זהב בו זמנית).
  7. לניתוח, בחר את הקובץ המוחלק בנקודה בחלון הימני, בחר 'עיבוד נתונים', בחר 'נקודות קצה בודדות' מהתפריט הנפתח וכדוגמה בחר 'הקפאת משך זמן' (איור 20). נפתח חלון לציון הקפאה מבחינת סף המהירות וסף משך הזמן. בדוגמה הדג מבלה 25.86% מזמן התצפית על הקפאה.
  8. כדי להכיר את התוכנית, נסה דוגמאות אחרות, כגון מרחק נסיעה, התפלגות עומק (המאפשרת לך לקבוע את מספר רמות העומק) ותדירות פרץ.
  9. ישנם חישובים מתקדמים יותר, כגון ניתוח ספקטרלי של למשל רכיב ה-z של התאוצה. במקרה זה, בחר 'תכונות סדרות זמן', לאחר מכן 'ניתוח תחום תדר TD', 'ניתוח ספקטרלי' ו'ספקטרום האצה Z'. אנליזת פורייה תבוצע על הפרמטר המצוין (להסבר7). לא כל האפשרויות המוצגות בתפריט עדיין מיושמות במלואן. לדוגמה, 'פיתול הנתיב' נוסף רק באופן ניסיוני.
  10. בבחירה באפשרות 'עיבוד אצווה באמצעות סף ברירת מחדל', יחושבו כ-200 נקודות קצה. בהקשר זה, 'ברירת מחדל' פירושה שהוגדרו מפרידים. לדוגמה, כיום התפלגות העומק מחושבת לשלוש רמות עומק, התפלגות זוויתית מחושבת לארבעה חלקים (כלומר רבעים) וכו'. לאחר יצירת הפרמטרים נפתח חלון חדש המבקש את המיקום והשם של הקובץ שייווצר. אלה יישמרו בפורמט CSV וניתן לייבא אותם לתוכנות אחרות, כגון Excel, להמשך עיבוד.
  11. בניגוד למודול ההקלטה ומודול המסלול, מודול עיבוד הנתונים הוא מודול מתפתח שיותאם עוד יותר לדרישות החוקרים.

תוצאות

דגי זברה (Danio rerio) נקבות בנות שישה חודשים, מזן פרא ('short-fin') לא מוגדר, נרכשו מחברת Aquatica Tropicals, Inc. בסך הכל נעשה שימוש ב-120 דגי זברה. הדגים עברו אקלמיזציה לתנאי המעבדה למשך כ-8 שבועות באקווריומים של 38 L לפני תחילת הניסויים. טמפרטורת המים הייתה שווה לטמפרטורת החדר (~23° C). משטר תאורה: 14 שעות אור (6:00-20:00), 10 שעות חושך. דגי הזברה הוזנו שלוש פעמים ביום: ב-8:00 פלייקס טרופיים של Tetra; ב-12:00 זחלי ארטמיה חיים; ב-15:00 פלייקס טרופיים של Tetra. בימי הניסויים, דגי הזברה הוזנו בפלייקס ב-8:00 בלבד. מיד לאחר ההקלטה השנייה, דגי הזברה הורדמו והורגו באמצעות 300 mg/L של tricaine methanesulfate (MS-222).

עבור קבוצת הביקורת נעשה שימוש ב-14 רביעיות (i.e. קבוצות של ארבעה דגי זברה) (n =14), ועבור קבוצת ה-MK-801 ב-16 רביעיות (n = 16). לאחר חשיפה של 1 hr ל-10 µM MK-801 (החל מהשעה 9:30) במיכלים של 1 L, הועברו הרביעיות למיכלי התצפית. ההקלטה החלה מיד (בשעה 10:30) ונמשכה 20 min. לאחר מכן, נותרו דגי הזברה במיכלים למשך 3.5 hr. במהלך תקופה זו, סופקה אוורור באמצעות צינור המחובר למשאבת אוויר. בשעה 14:00 בוצעה הקלטה שנייה של 20 min. מטרתן של שתי ההקלטות הייתה לבחון את השפעות ההתרגלות ו/או את ההשפעות הדועכות של התרופות (זמן מחצית החיים של MK-801 בחולדות הוא כ-2 hr28). ניתחנו (1) מרחקים חברתיים ממוצעים (המכונים גם מרחקים בין-אינדיבידואליים11,29) כמדד ללכידות חברתית, (2) התפלגות אנכית על פני עשר רמות עומק, (3) התפלגות אופקית על פני ארבעה אזורים רדיאליים (ראה Figure 24A, האינסרט למיקומי האזורים) ועל פני רבעים (ראה Figure 24B, האינסרט למיקומי הרבעים), ו-(4) את שלושת הרכיבים (x,y,z) של מרחק הנסיעה. הנתונים חושבו כממוצע לכל להקה. לאחר שמבחני Shapiro-Wilkins הדגימו שלא כל המשתנים התפלגו נורמלית, הוחלו מבחני Mann-Whitney U על כל המשתנים כדי להשוות ממוצעים בין קבוצת הביקורת לקבוצת ה-MK-801. השוואות אלו בוצעו בנפרד עבור מפגשי הבוקר ומפגשי אחר הצהריים. קבענו α = 0.05/4 = 0.0125, כיוון שנעשה שימוש בארבע (קבוצות של) משתנים (ראה לעיל).

איור 2A מציג פריים לדוגמה טיפוסי עבור דגי זברה של קבוצת הביקורת, ואיור 2B מציג פריים לדוגמה טיפוסי עבור דגי זברה שטופלו ב-MK-801, שניהם הוקלטו במהלך סשן הבוקר. שימו לב כי דגי הזברה של קבוצת הביקורת היו קרובים לתחתית, קרובים לדופן הקדמית (כלומר, הצד הקרוב ביותר למצלמה) ונשארו קרובים זה לזה (כלומר, הלכידות החברתית הייתה גבוהה). לעומת זאת, דגי הזברה שטופלו ב-MK-801 היו קרובים לחלק העליון, לא הראו העדפה כלשהי במישור האופקי ושחו במרחק ניכר זה מזה (כלומר, הלכידות החברתית הייתה נמוכה). איור 21 מציג מסלולי תנועה נבחרים. לדגי הזברה של קבוצת הביקורת הייתה נטייה ברורה להישאר בצדו הקדמי של מכל התצפית. יתרה מכך, הם נשארו קרובים לתחתית רוב הזמן. דגי זברה שטופלו ב-MK801, לעומת זאת, שחו בכל מקום במישור האופקי. עם זאת, הייתה להם העדפה ברורה למפלסי העומק העליונים בשעה 10:30. בשעה 14:00, ההתפלגות האנכית שלהם הפכה להומוגנית יותר.

ניתוח כמותי של הנתונים אישש את התיאור שלנו. איור 22A מראה כי המרחק החברתי הממוצע (i.e. המרחקים הממוצעים בין הפרטים בקרב ארבעת דגי הזברה של הרביעיות) היה עבור דגי זברה שטופלו ב-MK-801 גדול פי שלושה לפחות מאשר עבור דגי זברה של קבוצת הביקורת במהלך הבוקר (בשעה 10:30), כאשר U = 0 ו-p<0.00001. לאחר 3.5 שעות של הרגלה (בשעה 14:00), המרחק החברתי בדגי זברה של קבוצת הביקורת עלה, בעוד שבדגי זברה שטופלו ב-MK-801 הוא נותר כמעט ללא שינוי. עם זאת, הוא נותר שונה באופן מובהק בין שתי הקבוצות (U = 19, p<0.0005). איור 22B מציג את ציר הזמן של המרחק החברתי עבור שתי קבוצות הניסוי הן עבור השעה 10:30 והן עבור השעה 14:00.

גם ההתפלגות האנכית הייתה שונה מאוד עבור שתי הקבוצות. איור 23 מראה כי הן בבוקר (10:30) והן אחר הצהריים (14:00), דגי זברה מקבוצת הביקורת בילו את רוב הזמן בשתי עד שלוש רמות העומק הנמוכות ביותר (כלומר, הרמות הקרובות ביותר לתחתית מיכל התצפית). לעומת זאת, דגי הזברה שטופלו ב-MK-801 שחו את רוב הזמן קרוב לפני השטח של המים בשעה 10:30 (איור 23A). לאחר 3.5 hr של הסתגלות, בשעה 14:00, הם היו מפוזרים באופן שווה פחות או יותר על פני כל רמות העומק.

ההתפלגות האופקית הייתה שונה מאוד גם היא עבור שתי הקבוצות הניסוייות. ב- איור 24A אנו רואים כי דגי זברה שטופלו ב-MK-801 שהו פחות זמן באזור החיצוני ויותר זמן באזורים האמצעי והמרכזי בהשוואה לדגי זברה מקבוצת הביקורת. ההבדלים בין הקבוצות ביחס לרביעים היו בולטים אף יותר (איור 24B). לדגי zebrafish של קבוצת הביקורת הייתה העדפה חזקה מאוד לשני הרבעים הקדמיים (1 ו-4), כלומרצדו של המיכל הקרוב ביותר למצלמה. לעומת זאת, דגי זברא (zebrafish) שטופלו ב-MK-801 היו מפוזרים באופן שווה למדי בין ארבעת הרביעים.

בכל הנוגע לפרמטרים קינמטיים, אנו מגבילים את הדיון כאן למרחק הנסיעה (איור 25). דגי הזברה שטופלו ב-MK-801 נעו יותר מדגי הזברה מקבוצת הביקורת. באופן מעניין, הבדל זה היה משמעותי במיוחד עבור רכיב ה-y של מרחק הנסיעה. זהו הכיוון של המצלמה (ראו איור 1). ואכן, דגי ביקורת נשארו רוב הזמן קרוב לדופן הקדמית ברביע 1 ו-4 (כפי שניתן לראות באיורים 24A ו-24B). דגי זברה שטופלו ב-MK-801, לעומת זאת, נעו הלוך ושוב בין החלקים הקדמי והאחורי של המיכל.

כאן הצגנו רק דוגמה לאפשרויות השונות לניתוח הנתונים שהתקבלו מהניסוי. בשלב זה אנו נמנעים ממתן פרשנות ביולוגית ספציפית לתוצאות. עם זאת, ראוי לציין כי נמצא ש-MK-801 גורם לנסיגה חברתית30 ומפחית התנהגויות חקירה חברתיות בחולדות31, והוא נחקר כמודל לתסמינים שליליים של סכיזופרניה30. הוא גרם גם להיפראקטיביות31, התנהגות סיבובית32, ליקויים תחושתיים33 והפחתה של עיכוב פרה-פולס (prepulse inhibition)34 ביונקים. למרות שלא בדקנו באופן ספציפי ליקויים אלו, נראה כי הממצאים שלנו עולים בקנה אחד איתם. נדרשים מערכי ניסוי ספציפיים יותר כדי לקבוע אם ההשפעות המתוארות של MK-801 בדגי חזית (zebrafish) ניתנות להשוואה לאלו המתוארות ביונקים. ניתוחים וניסויים נוספים יהיו נחוצים גם כדי להחליט אם חרדה, בעיות נשימה, דסאוריינטציה מרחבית, הפרעת קשב, סטריאוטפיות וכו' מילאו תפקיד משמעותי בשינויים ההתנהגותיים שגרם MK-801 בדגי החזית.

דיאגרמה של מערך המדידה האופטית עם מצלמה, מחשב, קובייה ומראה; מחקר פוטוניקה.
איור 1. תרשים סכמטי של המערך. המצלמה לוקטת פריימים (כלומר, תמונות סטילס) המראים הן את המבט הקדמי והן את המבט העליון של מיכל התצפית. הפריימים נשמרים במחשב לעיבוד המשך. שימו לב למיקומי ממדי ה-xyz, החשובים לתיאור מאפייני התלת-ממד של התנועות והמיקומים של דגי הזברה. שני הקירות המוצלים באיור (ותחתית המיכל) נצבעו בניסוי שלנו (ראו תוצאות מייצגות) בלבן, בעוד ששני הקירות האחרים היו שקופים. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניסוי התנהגות במיכל דגים, שני מיכלים עם פיזור דגים, מערך למחקר התנהגותי.
איור 2. פריימים לדוגמה. שימו לב כי מבטים חזיתיים או עליונים לבדם מאופיינים באובדן מידע. הדבר נראה בבירור במיוחד בפנל B, שבו שלושת דגי הזברה מצד שמאל נראים כנמצאים בקרבה זה לזה במבט החזיתי, בעוד שהמבט העליון מראה שזה לא המצב. מאידך, המבט העליון אינו מספק אינדיקציה למרחק מהקרקע. A) דגי זברה של ביקורת. B) דגי זברה שטופלו ב-10 µM MK-801. שימו לב כי צבע הרקע (כחול) נוצר על ידי תוכנת ההקלטה ונבחר כדי להשיג ניגודיות טובה. הצבע האמיתי של הקירות מאחור ומצד ימין ושל הקרקע היה לבן. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

מערכת מעקב אחר התנהגות בעלי חיים מימיים; מערך לניתוח וידאו; פאנל כיול; תהליך ניטור.
איור 3. כיוון מראת הצד. החץ הלבן משמאל מציין את הקיר הקדמי (הקרוב ביותר למצלמה) במראת הצד. אם נראים שני קווים, תקנו את מיקום מראת הצד עד שייראה קו אחד בלבד (שלב 1.2). 5 נורות ה-LED של פאנל הכיול נראות בבירור בכל שלוש התצוגות. שימו לב כי בשל הדלקת האורות בתא, נראות השתקפויות רבות אחרות על פאנל ה-LED (שלב 1.4). לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תהליך זיהוי חלקיקים, תיבות מסומנות באדום, דיאגרמה של ניתוח אופטי, תנאי תאורה נמוכים.
איור 4. תיוג ה-LEDs. הפאנל השמאלי מראה כי חמשת התגים (ממוספרים 0-4) שזוהו על ידי הליך הכיול אינם חופפים ל-LEDs בפועל. מלבד ה-LEDs ניתן לראות נקודות אור אחרות (למעשה השתקפויות). בפאנל הימני, ה-gain וה-shutter הופחתו כך שרק ה-LEDs נראים. כעת חמשת התגים משויכים בצורה נכונה (כפי שמתואר בשלבים 1.7-1.10). לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק תוכנה למעקב אחר התנהגות בעלי חיים מימיים המציג בקרת מצלמה והגדרות כיול.
איור 5. איסוף מידע על המיכל. מוצג רצף ששת הנקודות שיש לבחור (על ידי לחיצה ימנית בעכבר). הקווים יסורטטו באופן אוטומטי. שימו לב שהמספרים המצוינים כאן אינם מופיעים על המסך. בסיום, לחצו על 'Collect container info' (כפי שמתואר בשלב 1.12). לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תרשים ניסוי הידרודינמיקה; הגדרת מיכל דינמיקת נוזלים ועומס; רכיבים עם הערות.
איור 6. איסוף נפח. בצעו לחיצה ימנית בעזרת העכבר במיקומים המצוינים המסמנים את פינות גוף המים: ראשית סמנו את הפינה במבט חזיתי ואז במבט עליון. לאחר מכן עברו לפינה הבאה (מ-1 עד 8). שימו לב כי שמונה הנקודות מסמנות את מתאר גוף המים, ולא את המיכל. כמו כן, שימו לב שבעת לחיצה ימנית מופיע רק 'x0', אשר ייעלם שוב בעת לחיצה על הנקודה הבאה (לפיכך המספרים 1-8 אינם מופיעים למעשה על המסך). הפרוצדורה מתוארת בשלב 1.17. לחצו כאן להצגת תמונה מוגדלת.

מערך למעקב אחר התנהגות בעלי חיים מימיים עם בקרת מצלמה, לניטור תנועת בעלי חיים במיכל מים.
איור 7. ניגודיות ללא תיקון. התמונה עם חשיפת יתר והניגודיות בין הדג לרקע (במיוחד במבט מהחזית) נמוכה. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

הסדרה מימית עם דגים המשמשים במחקר של שיווי משקל סטטי; ניסוי בדינמיקה של נוזלים.

איור 8. ניגודיות מתוקנת. הניגודיות שופרה כעת בהשוואה לאיור 7. שימו לב כי הצבעים על המסך הם צבעים מלאכותיים. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק הגדרות המצלמה עבור Bumblebee2 BB2-03S2C, המראה כיוונוני בהירות, חשיפה ורוויה.
איור 9. הגדרות כלליות. לאחר בחירה ב-'Camera control' בתפריט הראשי, ייפתח חלון 'General Settings'. בטלו את הסימון בתיבות 'Shutter' ו-'Gain' והשתמשו במכוונים כדי למצוא את הניגודיות הטובה ביותר בין הדג לרקע. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק משתמש לכוונון מאזן לובן של מצלמה; מחוונים לאדום/כחול; אופטימיזציה של עיבוד תמונה.
איור 10. הגדרות צבע. בחלון 'White Balance/Color' בטלו את הסימון מתיבת ה-'Auto' והשתמש במחווני ה-'Red' וה-'Blue' כדי למצוא את השילוב הטוב ביותר לניגודיות טובה בין הדגים לרקע. פרמטרים. לאחר פתיחת ה- Trajectory Module, בחר את קובץ הניסוי באמצעות 'Data location' ולאחר מכן פתח את חלון ה-'Parameters' באמצעות 'System Setup'. כאן מוקצים ערכי התחלה מתאימים לפרמטרים. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק תוכנה למעקב אחר התנהגות בעלי חיים מימיים; פרמטרי כיול; הגדרות ניתוח וידאו.
איור 11. פרמטרים. לאחר פתיחת ה-Trajectory Module, בחרו את הקובץ הניסויי באמצעות 'Data location' ולאחר מכן פתחו את חלון ה- 'Parameters' באמצעות 'System Setup'. כאן הוקצו ערכי התחלה מתאימים לפרמטרים. .לחצו כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

הסדרה למעקב אחר התנהגות מימית, כיול מערכת תלת-ממדית, ממשק תוכנה, ניתוח מסלול.
איור 12. יישור תיבות. שימו לב כיצד התיבות האדומות עבור המבט מלמעלה והמבט מלפנים מגדירות את האזורים שבהם הדגים עשויים להימצא. התיבה משמאל הוקטנה לקו כדי להוציא אזור זה מהחיפוש. לחצו כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

ממשק תוכנה למעקב אחר בעלי חיים מימיים, המציג הגדרות כיול וניטור לניתוח התנהגות.

איור 13. הקצאת תגים. לאחר לחיצה על הכפתור 'Start generating trajectories' ובחירת פריים ההתחלה (בדרך כלל פריים #0), נפתח חלון 'Tag assignments'. יש ללחוץ על 'Step forward' עד להופעת התג ('X0') על המסך. אם התג אינו ממוקם על תמונת הדג, יש ללחוץ על 'No' עד למיקומו הנכון. לאחר מכן יש ללחוץ על 'Go'. לחץ כאן להצגת תמונה מורחבת.

דיאגרמת ניתוח דינמי עם וקטור כוח, ריכוז מאמצים; רכיבים מסומנים A, B.
איור 14. מסך מידע. פאנל (A) מראה את השיוך הנכון של התג. התג ('X0') ממוקם על תמונת הדג בשתי התצוגות. בדרך כלל קו עובר דרך התג. פאנל (B) מראה רעש מוגבר והיעדר שיוך של תג. הפריימים נרכשו מאותה הקלטה על ידי שינוי ספי סף הצבע והגודל (בשלב 2.2) מ-1,000-50 ו-10-5, בהתאמה. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניתוח מסלול בתלת-ממד, דיאגרמת וקטורים הממחישה תנועת חלקיקים בקוורדינטות קרטזיות.
איור 15. ייצוג תלת-ממדי של המסלול המשוחזר. נקודת המוצא של החצים ממוקמת בפינה השמאלית-קדמית של המכל לצורכי התמצאות (ראו גם איור 1). לפיכך, בדוגמה זו הדג נשאר קרוב לקיר השמאלי (ביחס למצלמה). לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

חלון הגדרות פרמטרים להחלקת מסלול; הגדרות מסנן: ספי noise, גודל חלון.
איור 16. החלקת מסלול. חלון זה נפתח לאחר לחיצה על כפתור 'Trajectory smoothing'. נכון לעת זו, קבלו את ערך ברירת המחדל על ידי לחיצה על 'OK'. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תרשים ארגון קבצים המראה העברת נתונים מתיקיית "fish1" לתת-תיקיית "Trajectories".
איור 17. תת-תיקיות. התיקייה שנוצרה במהלך ההקלטה מוצגת לעיל. לאחר שחזור הנתיב היא מכילה את שש תת-התיקיות המצוינות. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

נתונים מספריים בפורמט טקסט לניתוח סטטיסטי.
איור 18. קובץ מוחלק. מוצג חלקו העליון של קובץ דוגמה מסוג point.smoothed-file, המציין את מספר הפריימים, משך ההקלטה (בדקות), קואוונטות של מרכז גוף המים ביחס למצלמה, ועבור כל פריים את הקואורדינטות והמשך הזמן. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק תוכנת עיבוד נתונים לניתוח נתוני מסלול; הגדרת פרויקט והקצאת קבוצות.
איור 19. עיבוד נתונים. בחירת הקבצים לניתוח (חלון ימין). לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ממשק עיבוד נתוני ABMT תלת-ממדי המציג הגדרה לניתוח קיפאון לצורך הערכת מסלול.
איור 20. דוגמה לניתוח. ניתן לחשב את נקודות הקצה הרלוונטיות על ידי בחירתן מהתפריט. בדוגמה זו נבחר 'Duration Freezing'. התוכנה מבקשת להזין ספי מהירות ומשך זמן המגדירים קיפאון. התוצאה מבוטאת כאחוז ממשך ההקלטה הכולל. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תרשים ניתוח לוקומוציה, נתיבי מעקב בעכברים בביקורת ובעכברים שטופלו ב-MK-801 לאורך מרווחי זמן.
איור 21. מסלולים מייצגים. מוצגים שני מסלולים מייצגים עבור דגי זברה בביקורת ושני מסלולים מייצגים עבור דגי זברה שטופלו ב-10 µM MK-801 עבור סשן הבוקר שהחל ב-10:30 (שורה עליונה) ועבור סשן אחר הצהריים שהחל ב-14:00 (שורה תחתונה). המסלולים של כל דג זברה בודד מתוך כל רביעייה מוצגים בצבע שונה. עם זאת, יש לשים לב כי ייתכן שחל החלפה של תגים (tag swapping). תיקון ידני נדרש אם יש חשיבות מכרעת למעקב אחר הקווים הבודדים. הצד הקדמי השמאלי (מקור חצי החיצים) של המיכל המוצג הוא הצד הקרוב ביותר למצלמה (ראה איור 1 למיקום המכל). לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניתוח מרחק חברתי; גרף; השפעת ביקורת לעומת MK-801; תוצאות מושוות של מפגשים; סדרות זמן.
איור 22. מרחק חברתי ממוצע בין דגים. A) מרחקים חברתיים ממוצעים עבור דגי זברה (zebrafish) מקבוצת ביקורת ודגי זברה שטופלו ב-10 µM MK-801 מוצגים עבור מפגשי הבוקר והערב. מוצגים ממוצע ו-S.E.M. ***, p<0.001. B) ציר הזמן של המרחק הבין-אישי הממוצע מוצג עבור שתי הקבוצות. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניתוח עומק; גרף רב-משתני; השוואה בין קבוצת הביקורת ל-MK-801; אחוז הזמן לעומת רמות עומק.
איור 23. התפלגות עומק. A) התפלגות של דגי הזברה לאורך עשר רמות עומק שוות (כאשר רמה 1 היא הרמה הקרובה ביותר לתחתית) עבור סשן הבוקר. B) התפלגות של דגי הזברה עבור סשן אחר הצהריים. מוצגים ממוצע ו-S.E.M. *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
איור 24. התפלגויות אופקיות. (Aמוצג התوزيع הזמני על פני ארבעת האזורים הרדיאליים של קבוצות הניסוי. התמונה המוכנסת מראה את מיקומי האזורים מהמרכז להיקף: אזור מרכזי, אזור אמצעי, אזור חיצוני ואזורי פינות משולבים.Bמוצגת ההתפלגות הזמנית על פני ארבעת הרבעים של קבוצות הניסוי. המלבן המוכנס מראה את מיקומם של הרבעים. הקירות המסומנים בקוים כפולים מייצגים קירות לבנים, ואלו המוצגים בקוים בודדים מייצגים קירות שקופים. המצלמה ממוקמת משמאל למלבן המוכנס. כלומרהקרובים ביותר לרביעים 1 ו-4 (ראו גם איור 1). מוצגים ממוצעים וטעות תקנית של הממוצע (S.E.M.). כוכביות שחורות מציינות השוואות בין הקבוצות עבור מושב הבוקר וכוכביות אפורות מציינות השוואות עבור מושבי אחר הצהריים: *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. לחצו כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

גרף שיווי משקל סטטי; מרחק נסיעה לעומת קואורדינטות; קבוצת ביקורת לעומת MK-801; ניתוח נתונים.
איור 25. מרחק נסיעה. מוצגים רכיבי ה-xyz של מרחק הנסיעה עבור דגי הזברה במהלך מפגשי הבוקר והצהריים. מוצגים ממוצע ו-S.E.M. כוכביות שחורות מסמנות השוואות בין הקבוצות עבור מפגש הבוקר וכוכביות אפורות מסמנות השוואות עבור מפגשי הצהריים: *, p<0.0125; ***, p<0.001. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

דיון

הליך הניסוי המוצג כאן מאפשר תיעוד של דגי זברה בודדים, זוגות של דגי זברה (למשל כדי לחקור הזדווגות או תוקפנות) ולהקות של דגי זברה (כפי שמוצג בדוגמה המייצגת). המערכת מתאימה במיוחד להשגת מידע בו-זמנית על התפלגות תלת-ממדית (אנכית ואופקית), מאפיינים קינמטיים (למשל מהירות, תאוצה, זווית סיבוב) ופרמטרים חברתיים (למשל לכידות חברתית). בהמשך נפרט כמה נושאים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים.

בהתאם לנוהל הניסוי, ניתן לחקור מערכות התנהגות שונות. לדוגמה, כדי לחקור ניאופוביה (כלומר פחד מסביבות חדשות) יש להתחיל את ההקלטה מיד לאחר הכנסת דג הזברה למיכל התצפית (לאחר המתנה של כמה שניות בלבד עד שהמים ישקעו כדי להפחית את הרעש), ללא התרגלות מוקדמת11,17,37. מצד שני, נושאי מחקר מסוימים עשויים לדרוש מדג הזברה להיות רגיל היטב, למשל כאשר חוקרים את ההשפעות של פרומוני אזעקה16. כאשר חוקרים קבוצות של דגי זברה, הנסיין צריך להיות מודע לכך שלמרות שהתוכנה ממזערת את החלפת התגים, כרגע לא ניתן לעקוב אחר דג זברה בודד לאורך כל הדרך. זה גם לא חשוב למחקרי shoaling שבהם הדגש הוא על לכידות חברתית, אבל יהיה חיוני כאשר חוקרים תוקפנות או הזדווגות. הקצאה מחדש ידנית של תגים היא אפשרות, אך עשויה לגזול זמן רב.

לצבע דפנות מיכל התצפית ותא התצפית יכולה להיות השפעה רבה על התנהגות דג הזברה. לדוגמה, קירות לבנים תוארו כגורמים לתגובות סלידה36, 37. כאשר מנסים צבעים שונים, זכור שני דברים: 1) חשוב שהקיר הקדמי (כלומר הקיר הקרוב ביותר למצלמה) יישאר שקוף ושמכסה (אם משתמשים בו) צריך להיות שקוף; 2) בעת בחירת צבע שמעולם לא נעשה בו שימוש בעבר, קבע תחילה אם הניגודיות בין דג הזברה לרקע מתאימה להקלטה. בצע ריצת מבחן. שינוי הגדרות המצלמה להקלטה (הגברה, תריס, אדום וכחול, כפי שהוסבר בשלבים 2.5 ו-2.6) וההגדרות לשחזור מסלול (למשל סף צבע וגודל, כפי שהוסבר בשלבים 3.3, 3.5, 3.11 ו-3.12) יכול לעשות הבדל גדול. שוב, ניסיון עם המערכת יעזור מאוד להחליט מה אפשרי.

בהתאם למטרת הניסוי, מקור אור בעל מאפיינים שונים (למשל ספקטרום, עוצמה) עשוי להיות רצוי. ניתן להחליף את פסי הלד בקלות. ודא שהאור מגיע לכל חלק במיכל.

אם הניסוי דורש שדג הזברה יישאר במיכל התצפית למשך מספר שעות, הקפד לספק אוורור. ניתן לחבר צינור אוויר לפינה הימנית האחורית באמצעות קליפ. בדוק על מסך המחשב שהקליפ אינו מפריע להקלטה, כלומר שדג הזברה אינו נסתר בשום שלב מהעין. באיורים 2A ו-2B ניתן לראות את הקליפ השחור בתצוגה העליונה. באופן אידיאלי, יש לספק אוורור לפני או בין הקלטות, אך לא במהלך ההקלטה כדי למנוע רעש. שימו לב גם שהפעלה או כיבוי של אוורור חזק עלול להבהיל את דג הזברה.

אם הניסוי דורש שמירת דג הזברה במיכל למשך הלילה, כדאי לכסות את תא התצפית במכסה שקוף כדי למנוע מדגי הזברה לקפוץ החוצה (וזו תופעה שכיחה מאוד). אם הכיסוי לא מוסר לפני ההקלטה (כדי לא להפריע לדג הזברה), שקול את שתי הנקודות הבאות: 1) ודא שתמונות המראה של מקורות האור אינן חוסמות את ההקלטה (למשל על ידי הזזת מקורות האור או על ידי בחירת מכסה שמחזיר אור באופן מינימלי בלבד); 2) קחו בחשבון שהמכסה עלול להיות מעורפל בשימוש בלילה, במיוחד מכיוון שבמקרה זה יש לספק גם אוורור; אחת הדרכים להפחית זאת היא לבחור מכסה עם חורים קטנים בתוכו.

עבור ניסויים מסוימים ייתכן שיהיה חיוני לקבוע את ההתנהגות הבסיסית של דג הזברה לפני מתן תרופה. במקרה זה, ניתן להוסיף את התרופה בין הפגישות באמצעות צינור (בדומה לצינור האוורור שנדון לעיל).

למרות שההתמקדות כאן הייתה בתיעוד דג הזברה (Danio rerio), ניתן כמובן לתעד גם מיני דגים אחרים במערכת. הוא שימש לחקר התנהגויות של דגי זהב (צעירים) (Carassius auratus), דוקרני טיגריס (Barbus tetrazona) וזנב חרב ירוק (Xiphophorus helleri).

לבסוף, יש לציין כי ממדים אחרים של מיכלי התצפית אפשריים בעיקר. עם זאת, זה ידרוש הגדרה מחדש של המערכת ומציאת איזון טוב בין רזולוציה מרחבית וזמנית בעת שימוש במיכלי תצפית גדולים בהרבה. יתר על כן, צורת המיכל צריכה להיות קובייה. מספר דגי הזברה או נבדקים ניסויים אחרים הוא בלתי מוגבל תיאורטית; עם זאת, החלפת תגים גדלה עם מספר הנושאים.

גילויים

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu ו-Wei Weng הם עובדים של xyZfish, Ronkonkoma NY, המייצרת את מערכת המעקב המשמשת במאמר זה.

תודות

למחברים אין אישורים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרת מעקב AABT-3DxyZfishAABT IIכולל מצלמה, כרטיס מסך, תא תצפית עם מראה ותאורה
ציוד כיול AABT-3DcalibxyZfishמכיל לוח כיול ומראה צד
AABT-3D מיכלי תצפיתקוביותxyZfish 
תוכנת מעקב AABT-3DxyZfishv.1.0 
מחשבאופציונליWindowsXP ומעלה
(+)-MK-801 מימן מלאטSigmaM107 
משאבת אווירפיוז'ן500 
צינורות קו אוויר 3/16 אינץ'לי' s מוצרי אקווריום וחיות מחמד14508 
קליפים קלסר בינונייםOfficeDepot561339לחיבור חברת תעופה למיכל תצפית

מקורות

  1. Brennan, C. H. Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease. Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).
  2. Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).
  3. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).
  4. Kurta, A., Palestis, B. Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio). Dose-Response. 8, 527-533 (2010).
  5. Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).
  6. Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives. Fish Fish. 14, 186-204 (2013).
  7. Zhu, L., Weng, W. Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals. Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).
  8. System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).
  9. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
  10. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach. Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).
  11. Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior. Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).
  12. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  13. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  14. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).
  15. Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio. Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).
  16. Speedie, N., Gerlai, R. Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).
  17. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and. 99, 480-486 (2011).
  18. Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success. Zebrafish. 7, 109-117 (2010).
  19. Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. Learned social preference in zebrafish. Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).
  20. Mathur, P., Guo, S. Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes. Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).
  21. Tropepe, V., Sive, H. L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism. Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).
  22. Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish. Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).
  23. Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).
  24. Zou, H., et al. Low dose MK-801 reduces social investigation in mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).
  25. Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon. Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).
  26. Sison, M., Gerlai, R. Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801. Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).
  27. Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).
  28. Vezzani, A., et al. Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).
  30. Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).
  31. Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats. J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).
  32. Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain. Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).
  33. Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders. Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).
  34. Brosda, J., et al. Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).
  35. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).
  36. Maximino, C., et al. Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis. Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).
  37. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, e36931(2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים