פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Summary

תצוגת הפאג היא טכניקה רבת עוצמה כדי ללכוד חלבונים או moieties חלבון הפועלים באינטראקציה עם מולקולה משותקת של עניין. ברגע שהחלטה מהסוג של ספריית cDNA הפאג ליצור והמסך נעשתה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בחירת זיקה יעילה שמוביל לזיהוי של interactors.

Abstract

שימוש הפאג רקומביננטי כפיגום להציג מנות חלבון שונות המקודדים על ידי ספריית cDNA המשובטת directionally למולקולות פיתיון משותקים הוא אמצעי יעיל כדי לגלות אינטראקציות. הטכניקה במידה רבה נעשתה שימוש כדי לגלות אינטראקציות בין חלבונים אבל מולקולת הפיתיון להיות אתגר לא צריכה להיות מוגבלת לחלבונים. הפרוטוקול המובא כאן בצורה מיטבית כדי לאפשר למספר צנוע של פיתיונות שיוקרנו בחזרות על מנת למקסם את זיהוי של שיבוטים עצמאיים המציגים אותו החלבון. זה מאפשר ביטחון רב יותר שחלבוני אינטראקציה שזוהו הם interactors הלגיטימי של מולקולת הפיתיון. ניטור כייל הפאג לאחר כל בחירת זיקה עגולה מספק מידע על אופן בחירת הזיקה מתקדמת, כמו גם על יעילותן של בקרות שליליות. אמצעי אחד titering הפאג, ואיך ומה להכין מראש כדי לאפשר את התהליך הזה כדי להתקדם בצורה יעילה ככלאפשרי, מוצג. תכונות של amplicons לאחזר הבאים בידוד של פלאק העצמאי מודגשות כי ניתן להשתמש כדי לברר כיצד גם מבחר הזיקה התקדם. פתרון בעיות טכניקות כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות או לעקוף בהתמדה התאושש הפאג מוסברים. אמצעי להפחתת זיהום נגיפית התלקחות הם דנו.

Introduction

למה להשתמש בתצוגת הפאג ובחירת זיקה במקום טכניקות אחרות עצום זמינות לגילוי וחקירת אינטראקציות חלבון עם מולקולות אחרות? תצוגת הפאג יכולה לטעון כמה יתרונות ייחודיים על פני שיטות אחרות לזיהוי אינטראקציות חלבון ליגנד ^1-3 כוללים את הפעולות הבאות:

רפרטואר רחב מאוד של מולקולות פיתיון

הסיבה החשובה ביותר היא בגיוון של מולקולות מסוגלות לפעול כפיתיון בבחירת זיקת ^4. תצוגת הפאג היא אמצעי חזק מאוד של בידוד שברי חלבון הפועלים באינטראקציה עם חלבונים אחרים, נוקלאוטידים, פחמימות, וכו ^'5 בעיקרו של דבר, אם פולימר / מולקולה יכולה להיות מחוברת לתמיכת ההשבה, זה יכול להיות מוקרן לזיקה עם חלבונים המוצגים הפאג. בנוסף, מולקולת הפיתיון ניתן לגשת כדי לקבוע אם הוא שומר על פעילות ביולוגית כאשר משותק ^6, אם תנאים המשמשים לrלהסיק / לחסל את פעילותו יעיל ⁶ או, להציג את השינויים שלאחר translational לפיתיון לפני בחירת זיקה.

התנגדות הפאג לגורמים חיצוניים

סיבה שנייה לשימוש בתצוגת הפאג, היא שזה אפשרי כי כמה פיתיונות עשויים לדרוש לחץ סביבתי (חום, ריכוזי osmolyte גבוהים, cofactors הספציפי, וכו '.) כדי ללכוד חלבוני האינטראקציה שלהם, או החלבונים המוצגים הפאג ייתכן שיהיו הצורך לשנות איכשהו לפני בחירת זיקה. הגורם העיקרי שלמד הוא האינטראקציה בין הפיתיון וחלבון, לא המצב שמאפשר האינטראקציה להתרחש או אם הוא קטלני לאורגניזם המבחן. הפאג T7 הוא גם מתאים במיוחד למחקרים כאלה, כי זה יכול לעמוד בתנאי ניסוי קשים שניהם שלמים ובת קיימא (למשל מרבי התרמית פורסם לכדאיות T7 הוא ~ 60 ° C ^7). כדוגמא לשינוי הפאג מוצג פרוteins, כאשר בוחן את proteome זרע thaliana ארבידופסיס למצעי חלבון של אנזים התיקון, חלבון Isoaspartyl תיל Transferease (PIMT), הווירוס המשמש במחקרים אלה היה "בני" במשך שבוע אחד, לפני כל בחירת זיקה עגולה, כדי לעודד הקדמה של isoaspartate (isoAsp) שאריות צמחים בחלבונים רגישים ⁶ דבר שאינו אפשרי באורגניזמים שיכולים לזהות ולתקן / לעכל מומים כאלה.

מטבולית אינרטי

יתר על כן, הפאג הם בדרך כלל עמיד בפני רעלים מטבוליים ומפריע מולקולות קטנות שהייתי, לכל הפחות, לגרום לתופעות pleiotropic על אורגניזמים בדיקה פעילים מטבולית. בעקבות שטיפות חומרא, הרעל מוסר לפני נפח גדול של חיידקים הם הציגו לזיהום כל כך הרעל מדולל למגוון בלתי מזיק לחיידקים או שכפול הפאג שלאחר מכן. בעוד חקירת מטרות חלבון של תיקון PIMTאנזים, S-Adenosyl מתיונין (AdoMet) שימש כדי להפעיל את האנזים משותק מייקר כייל צלחת היטב כדי לאפשר לכידת חלבון מטרה תוך הסתמכות על S-Adenosyl הומוציסטאין (AdoHcy) כדי להשבית את האנזים ולספק שליטה שלילית שימושית לאבטח ב הידיעה שהווירוס לא להיות מושפע לרעה על ידי אחד AdoMet או AdoHcy ^6. בנוסף, בני משפחות מסוימות המאוחר עובר חלבון נפוץ (LEA), נחקרו במעבדה זו, ידועים לשנות את צורתם בנוכחות תוספים כגון סוכרוז ^8, שיכול להשיג ריכוזים גבוהים ככל 200 מ"מ בזרעי סויה בנקודה בשלות פיזיולוגית ^9. הווירוס לא צפוי להיות מושפע על ידי תוספת של 200 סוכרוז מ"מ בכל סיבוב זיקת בחירה, אולי הכרחי לאינטראקציות חלבון LEA לקוח מסוימות, וזה לא במקרה של אורגניזמים מבחן מעשי באופן אוטונומי ^10.

מעבדה זו מתמקדת בdiscoverinאינטראקציות בין חלבונים G בזרעים בוגרים, מיובשים או נובטים העומדים בבסיס המנגנון של הגנת proteome המאוחסנת במהלך התייבשות ¹¹ או תיקון של רכיבים של proteome המאוחסנת, כי הם רגישים להיווצרות isoAsp פעם הזרע ספג ^6. לפיכך, הייצור והטיהור של החלבונים רקומביננטי הנדרשים כפיתיון במצב פעיל, ולהבטיח שהם יישארו כך, לפני ואחרי שהם משותקים, אם כי קשים לעתים קרובות, הוא אבן יסוד לעבודה שלנו. עם זאת, כמו כל תרחיש ייצור חלבון רקומביננטי הוא שונה, תנאי אופטימיזציה לייצור חלבון רקומביננטי לא התייחסו כאן. משתמשים מתבקשים לנסות, בכל מקום אפשרי, כדי לקבוע אם החלבון המשותק הוא עדיין פונקציונלי (למשל, אם זה הוא אנזים, לעשות assay אנזים בבארות צלחת microtiter). זה יספק קצת ביטחון שהפיתיון הוא פעיל מבחינה ביולוגית ואם כן, כי כל אינטראקציות שהתגלו הןקצת יותר סיכוי יש להם שייכות ביולוגית.

Protocol

תיאור גרפי של ההליך המתואר להלן (איור 1) מדגיש את שני מרכיבים העיקריים לבחירת זיקה באמצעות ספריית תצוגת הפאג:) ספריית תצוגת הפאג cDNA צפויה לקודד חלבונים עם זיקה לפיתיון ו; B) פיתיון רקומביננטי מטוהר חלבון. ייצור של פיתיון (חלבון רקומביננטי) נבדק בהרחבה ובספרות מתאר את שיטות עבודה מומלצות לאבטחת חלבון מסיס, פעיל רקומביננטי מE. ^12-13 coli, שמרי אוקריוטים ^14, חרק ^15-16, צמח ^17-18, או ^19-20 תאי יונקים בשפע.

בפרוטוקול הבא, hexahistidyl מתויג חלבון רקומביננטי שמש כפיתיון. זה מאפשר אימות שחלבוני הפיתיון יישארו בבארות אחרי שלבי דגירה ושטיפת הלילה.

1. ELISA לשימור חלבון רקומביננטי בולס צלחת microtiter

1. מארקצלחת microtiter עם דיו קבוע, ומיועד, שבארות יכילו ריכוזי חלבון ש. לבצע את זה ב 3 חזרות של בארות. כולל 3 חזרות של סדרת ריכוז שליטה שלילית (חלבון שאינו מתויג hexahistidyl; BSA עובד גם בדיקת רקע זה).
2. לשטוף את הצלחת בהרחבה במים ולהסיר את המים על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על 4 שכבות נייר מגבת בין שוטף.
3. לשתק, ב3 הבארות הראשונות, לטריס, pH 7.5, (או חיץ של בחירה) את הריכוז הגבוה ביותר של חלבון רקומביננטי (10 מיקרוגרם / מיליליטר) 100 μl. הוסף לשלוש הבארות הבאות חלבון רקומביננטי ב( 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר), וכו ', עד ל1.0 ng / ml. לעשות את אותו הדבר עם סדרת ריכוז BSA.
4. כסה מנות בניילון הנצמד ומשאיר לילה בשעה 4 ° C.
5. למחרת בבוקר, להסיר חלבון על ידי מצמוצי צלחת הפוך על מגבת נייר שכבות 4-5.
6. בארות לשטוף 5x עם 200 μl 1x TBS בכל פעם, ומשאירות את החיץבבארות ל~ 1 דקות בכל פעם והסרת לשטוף חיץ על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על מגבות נייר לאחר כל שטיפה.
7. לחסום את צלחת ELISA על שייקר סיבובי באמצעות 200 μl 5% (w / v) BSA או 200 μl 5% (w / v) חסימה מגיב ב TBS בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות (או לילה יושב נייח על 4 מעלות צלזיוס, אם נוח ) עטוף בניילון הנצמד.
8. הסר פתרון חסימה עודף על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על מגבות נייר. שטוף 4x 1 דקות בכל פעם עם 200 μl של 1x TBS, הסרת הפתרון לשטוף ידי מצמוצי הצלחת הפוכה.
9. לדלל סם האמת שלו נוגדן הראשוני 1/2, 000 בחסימת מאגר ולספק 100 μl היטב כל אחד. דגירה 1-2 שעות בטמפרטורת חדר עם נייח הצלחת.
10. הסר את הנוגדן הראשוני על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על מגבות נייר. שטוף 4x 1 דקות בכל פעם עם 200 μl של 1x TBST. הסר את כל שטיפה על ידי מצמוצי הצלחת הפוכה.
11. לדלל את הנוגדנים משני(המצומד עיזים אנטי עכבר phosphatase אלקליין), בחסימת מאגר דגירה 100 μl בכל טוב במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם נייח הצלחת.
12. הסר את הנוגדנים משני על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על מגבות נייר. שטוף 4x 1 דקות בכל פעם עם 200 μl של 1x TBST. הסר את כל שטיפה על ידי מצמוצי הצלחת הפוכה.
13. הנח 200 μl של פתרון מצע para-nitrophenylphosphate (pNPP) היטב כל אחד. המצע הוא מוצק ב-20 ° C כך להפוך aliquots ולאחזר את המספר הנדרש של aliquots ההכרחיים לגילוי מהמקפיא הרבה לפני זמן ולכן הוא מופשר לחלוטין בשלב הזה.
14. ב30 דקות לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 3 M NaOH היטב כל אחד.
15. קראו את הספיגה ב 405 ננומטר באופן מיידי על קורא צלחת ELISA.

שים לב: אם חלבון רקומביננטי של עניין לא מייחס את עצמו לבארות, זה אפשרי לשנות את ההרכב אלקטרוני / pH של החיץ משמעותי (pH חיץ קרבונט 10.0) או להוסיף chaotropes (אוריאה) כדי לנסות לסייע קובץ מצורף חלבון לבארות צלחת microtiter. עם זאת, לבסס מחדש כי חלבון רקומביננטי: 1) נשאר קשור אל בארות צלחת microtiter בתנאים לבחירת הזיקה ו; 2) שומר על הפעילות הביולוגית שלה לאחר פינוי pH / chaotrope הגבוה מומלץ.

2. גידול מאכסן (BLT5403) לtitering

1. החיטוי (איור 2 א) עשר 250 צלוחיות מיליליטר Erlenmeyer ו3 צינורות תרבות. הפוך נוזל LB ואגר LB למילוי צלחות תקשורת מוצקות. אגר מגניב LB ל50 מעלות צלזיוס ולהוסיף לאמפיצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר לפני asceptically לשפוך לתוך צלחות פטרי בזרימת מכסה המנוע (איור 2).
2. גם במכסת מנוע לזרום פס (איור 2) LB, 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין צלחת אגר (LB ^AMP100) למושבות אחת של BLT5403 מהמנייה המשיכה ב15% (v / v)גליצרול ב -80 ° C (איור 2 ג). מניחים צלחת הפוכה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחממה לגידול (איור 2 ד).
3. בבוקר, לחסן 50 מיליליטר LB ^AMP100 בבקבוק 250 מיליליטר Erlenmeyer עם מושבה אחת הרים מהצלחת. דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד שייקר אופקי (2E דמויות ו2F), ולהשתמש בספקטרופוטומטר לפקח צפיפות תאים בOD ₆₀₀ = .5-.6 (איור 2H).
4. יוצקים את התאים לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר או דומה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (איור 2G). תאים בדרך כלל נשארים קיימא ל~ שבוע 1.
5. הפוך 500 מיליליטר LB, למקם אותו בבקבוק Fernbach מבולבל וחיטויו. ברגע שזה הוא סטרילי, הנח את הבקבוק ב4 ° C (איור 2G) או בטמפרטורת חדר עד הלילה של "יום אחד" בהמשך.

הערה: תאי המאכסןBLT5403, מבטאים מקור שמקורן בפלסמיד של חלבון קפסיד ילידי T7 בלעדיו T7 האמצע, ונמוך עותק הווקטורים לא יכולים לשכפל את הצלחה, הם מאוד רגישים לנגיף. זה הכרחי כדי למנוע זיהום. זיהום סופו של דבר יתרחש ובשלב זה כל המשטחים במגע עם חיידקי הווירוסים / נגועים חייבים להימחק עם 70% (v / v) אתנול או שפשפו שימוש בחומר ניקוי (איור 2 ט). אם זה אינו יעיל, יש צורך בטיהור יסודית של כל המשטחים שיכולים לעמוד Envirocide (איור 2J). התחל BLT5403 תאים ממניות מקפיא כל סיבוב של בחירת זיקה חדש כדי לסייע לצמצם זיהום של המניה ב 4 ° C, ולהבטיח תאים נמרצים נמצאים בשימוש בפרוטוקול. הטיפים פיפטה מחסום סינון הם חיוניים.

3. בחירת זיקה

יום אחד

1. מארק צלחת microtiter עם דיו קבוע, ומיועד, שבארות תכיל אשר protEins / תיקונים. (עקב בעיות זיהום, צלחות לא לעשות שימוש חוזר). לבצע את זה ב3 משוכפלי בארות עבור כל חלבון וטיפול.
2. לשטוף את הצלחת בהרחבה במים ולהסיר את המים על ידי מצמוצי הצלחת הפוך על 4 שכבות נייר מגבת בין שוטף. לשתק, לטריס, pH 7.5, (או חיץ של בחירה) חלבון רקומביננטי (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בשש בארות, או ארגון ה-BSA (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בשלוש בארות, עבור סכום כולל של 9 בארות 100 μl לראשון סיבוב של בחירת זיקה. כסה צלחת בניילון הנצמד ומשאיר לילה בשעה 4 ° C (איור 2G).
3. ודא שיש 9 x 250 צלוחיות מיליליטר Erlenmeyer (ראה 2.1 לעיל) ניקו, autoclaved, ושכותרתו כראוי (קידוד עם סרט צבעוני עובד היטב, איור 2F).
4. לחשב את הנפח של lysate הפאג להשתמש עבור כל מבוסס גם על כייל של הספרייה שבשימוש ואת מספר הפאג שיוקרנו.
5. ודא כי תאי BLT5403 טריים מוכנים לשימושלtitering בחירה זו זיקה עגולה מחר (איור 3 א).
6. ודא TBS 1x מספיק (150 mM NaCl, 50 מ"מ טריס בסיס, pH 7.6) ו1x TTBS (TBS 1x + 0.05% (v / v) Tween 20) זמינים לביצוע 10 x 200 שוטף μl למספר בארות בשימוש . בנוסף, preincubate TTBS בטמפרטורת מבחר זיקה. ודא כי גיבוי, אטום, 50 מיליליטר צינור פלקון של 1x TTBS קיים בטמפרטורת מבחר זיקה עם מספיק 1x TTBS.
7. הכן 3 טיפולים x 3 חזרות X 3 triplicates של 1.5 מיליליטר Eppendorf צינורות (27 סך הכל) עם 990 μl של LB ^{100 AMP} כל אחד ולתייג כראוי (למשל 10 ^-2). אלה הם לחיידקים הנגועים נאספו מבארות צלחת microtiter מחר. סמן את הדילול בצד אחד של הצינור (10 ^-2) ומספר עולה בצד השני ("1"). לכל צינור Eppendorf, גם תווית צינור ורוסיליקט אחד ואחד צלחת ^AMP LB ^100. בw זהאיי, הצלחות ומבחנות ורוסיליקט ממוספרות 1, 2, 3, 4, 5, וכו '. כדי להפוך את Titering ללכת מהר יותר. אחר כך המספר פשוט ניתן להתאים לדילול והטיפול בצינור Eppendorf (למשל צינור # 12 היה שלושה עותקים שלישיים של השכפול הראשון של ארגון ה-BSA השליטה לדילול 10 ^-5). צינורות Eppendorf חנות וLB ¹⁰⁰ צלחות ^AMP לילה בשעה 4 ° C (איורים 2G ו 3 ב).

לדוגמא: התחל תיוג 1.5 מיליליטר Eppendorf צינורות לשלושה 10 ^-2 דילולים של הפאג משכפול BSA אחד גם 1, 2, ו -3 (שלוש קריאות בשלושה עותקים של כייל הפאג עבור שכפול אחד), ולאחר מכן לסמן מבחנות ורוסיליקט 1, 2, ו -3 שבו החיידקים הנגועים יהיו מעורבים עם חיידקים נגוע וagarose העליון לפני המזיגה על LB ¹⁰⁰ צלחות אגר ^AMP (איור 3 ג).

8. עבור ד הסידוריilutions, צינורות Eppendorf תווית ו, לכל אחד, להוסיף 900 μl של LB ^{100 AMP.} לאחר דילולים הראשוניים (10 ^-2) של חיידקים נגועים נעשים עבור כל חלבון / טיפול, שכפול ושלושה עותקים, מחר, הם יהיו מעורבבים היטב ו100 μl נלקח מהם והוסיף לצינור המתאים Eppendorf המכיל 900 μl LB ^{100 AMP} לדילול 10 ^-3 (צינורות 4, 5, ו -6 לבקרת שכפול אחד BSA). אלה יהיו מעורבים גם בתורו שלהם ו10 ^-3 דילולים ישמשו כדי להפוך את 10 ^-4 דילולים (7, 8, 9). השתמש 10 ^-4 דילולים ל10 ^-5 דילולים (10, 11, 12), וכו '. כדי לקבל את כייל לראשון מבין שלושה משוכפלי BSA (בארות).
9. אותו ייעשה עבור שכפול BSA שני (גם 2), שכפול BSA שלוש (גם 3), שלושה שכפולים של הפיתיון המורעל, ולבסוף שלושה שכפולים של בארות הפיתיון. בסופו של הדבר, לא אמור להיות צינורות שכותרתו וrom 1-135 (135 הוא שלושה עותקים האחרונים של השכפול האחרון של הפיתיון בדילול המרבי של 10 ^-6). אחסן Eppendorf הצינורות האלה לילה בשעה 4 ° C (איור 3 ג מציג את אפנדורף וצינורות ורוסיליקט לכל דילולים של triplicates של שלוש החזרות (שלוש בארות) של ארגון ה-BSA.
10. התחלת 2 או 3 צינורות התרבות של תאי BLT5403 (הרימו ממושבות אחת מצלחת LB ^AMP100 טרי מפוספסת לילה; משלב 2.2 לעיל) גדל בייקרה דוגרים (2E דמויות ו2F) כתרבות לילה. ל500 מיליליטר LB (הנקודה 2.5 לעיל), להוסיף לאמפיצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר ומניח את בקבוק Fernbach במהדק בחממה הרועדת כך שזה יהיה על 37 מעלות צלזיוס ומוגזים למחרת בבוקר (איור 2F).

שים לב: סיבוב שלושה וארבעה עשויים לדרוש דילולים משוערים של ככל 10 ^-10 נפח של pHage לנפח לLB ^AMP100.

יום שני

11. למחרת בבוקר, במקום 9 x 250 צלוחיות autoclaved, ריקות מיליליטר Erlenmeyer (אחד לכל צלחת microtiter גם) במלחציים בייקרו דוגרים. לחסן 500 מיליליטר LB ^{100 AMP} עם 500 μl מאחת תרבויות הלילה של BLT5403 תאים התחיל אתמול בלילה (ראה שלב 3.8 לעיל), לאטום ולהתחיל אותו הולך וגדל (37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד). הפעל ספקטרופוטומטר (איור 2H) ולהגדיר אותו כדי לקרוא את הספיגה ב 600 ננומטר.
12. הסר את צלחת microtiter מ4 ° C, להסיר את סרט הפלסטיק, והסר את כל חלבון מאוגד מהצלחת על ידי שטיפת 10x עם 200 μl בכל פעם של 1x TBS pH 7.5 ומצמוצי הצלחת הפוך על מגבת נייר בין שוטף. לחסום עם 200 μl 5% BSA (w / v) או 200 μl 5% (w / v) חסימה מגיב ב TBS ל1 שעות (או לילה, אם נוח) עם הצלחת העטופה בניילון הנצמד.
13. לשטוף של החסימהolution 10x עם 200 μl בכל פעם של 1x TBST, מצמוצי הצלחת הפוכה על 4 שכבות של מגבת נייר בין שוטף. אפשר למלא את הבארות עם 200 מים μl בשלב זה, לכסות אותם בניילון הנצמד ולשים אותם על 4 מעלות צלזיוס לאחסון למשך שבוע מקסימום 1.

שימו לב: הפעל את התרבות מהר מאוד כי, לפי זמן הפאג נגוע BLT5403 מהשלמת מבחר הזיקה מוכן להוסיף, התאים ב500 מיליליטר הם בין 0.6 ו1.0 OD _600. אם הם גדלים הרבה מעבר 1.0, תמוגה לא יכולה להתרחש עקב מגבלות משאבים כמו תאים מתקרבים שלב נייח. אם התאים לא להגיע OD ₆₀₀ של 0.6 לפחות לפני כניסתה של הפאג, הריבוי של זיהום יכול להיות גבוה מדי, במהירות הורג את התאים, אשר יכול להשפיע על הייצוג של lysate. אם התאים עדיין לא מתקרבים OD ₆₀₀ של 0.6 ידי השלמת מבחר זיקה, inoculate הבקבוק עם יותר BLT5403 מהשני (או אפילו משני שנייה ושלישית) מבחנות רועד ב37 ° C (איור 2F). אם OD ₆₀₀ של 1.0 מתקרב מהר מדי, כבה את התנור ושייקר ופותח את המכסה כדי לקרר את התרבות ולהרעיב את החיידקים לחמצן. לחדש חימום / רועד פעם אחת הפאג כבר הוסיף.

מכאן להשתמש בטיפי מחסום מסנן כדי למנוע הפאג זיהום צולב.

14. ברגע שהבקבוק הוא מחוסן, לשים את ספריית הפאג (100 μl) עם החלבונים, לאטום את הצלחת בניילון הנצמד ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
15. ב55 דקות, להקליט OD ₆₀₀ של התאים. זמן ההכפלה הוא בערך כל 20 דקות. חוק בהתאם (ראה "הערה" לעיל).
16. בסוף השעה אחת להסיר את הניילון הנצמד מהצלחת ולשטוף באופן מיידי על ידי ניעור הפאג לפסולת שינתה ולאחר מכן להוסיף במהירות 200 μl של שחפת 1xST. (השתמש multipipettor עם ראש μl 1 = 100 וpipettor נקבעה על 2 [כלומר מספק 200 דיכאון μl / בוכנה] לזה וזה הולך מהר). להגדיר טיימר דקות 1. לאחר 1 דקות, לנער את החיץ לפסולת הפכה, צלחת הרואין במהופך על מגבת נייר ומניח בחזרה על ספסל (צלחת C 25 °). כביסה חזור על השלבים 10x.
17. לאחר לשטוף 10 ^ה, קח 200 μl של BLT5403 תאים מצינור פלקון 50 מיליליטר ב 4 ° C ולשים אותם בתחתית הבאר שממנה לשטוף האחרון של TTBS הוסרה. לעטוף את הצלחות בניילון הנצמד ולשים ב37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לקבל כל הפאג עדיין דבוק לפיתיון כדי להדביק את החיידקים (ראה הערה בדיון בנוגע הפאג לאחזר בהתמדה ו / או רקע גבוה מללא אבחנה מחייב הפאג).
18. בסופו של 20 דקות, לגולל את הצלחות ולקחת 10 חיידקי μl מארגון ה-BSA ב25 ° C שכפול גם אחד ולשים אותו ב990 μl של LB ^{100 AMP} המסומן"1". חזור על פעולה פעמיים נוספת עבור היטב כי (צינורות 2 ו -3) וכתוצאה מכך 3 triplicates של של הפאג 1/100 דילולים שמכן. זה הוא שכפול BSA אחד נדגמו שלוש פעמים. דילולים אלה ישמשו כדי לאמוד את כייל הממוצע ± SEM עבור שכפול זה של ארגון ה-BSA.
19. לעשות את אותו הדבר עבור שכפול 2 ו -3 של ארגון ה-BSA (שלוש דגימות בשלושה עותקים של 10 μl כל אחד), לתקופה של שלוש בארות משוכפלת של חלבון הפיתיון המורעל, ועבור חלבון הפיתיון. הגדר 27 צינורות Eppendorf האלה בצד ולקבל את 170 μl הנותר של החיידקים הנגועים בבארות הולכות וגוברת של תמוגה.
20. אם החיידקים בבקבוק הוא בOD ₆₀₀ = 0.6-1.0, למזוג 50 מיליליטר תאים מFernbach בקבוקון לכל אחד מתשע 250 מיליליטר צלוחיות Erlenmeyer. קח 170 μl הנותר של חיידקי BLT5403 נגוע הפאג בשכפול BSA 1 היטב ולהוסיף אותו ל50 מיליליטר התאים המסומנים "BSA נציג 1" (סרט צהוב). האם זה עבור כל תשע הבארות ולשים אותם רועד בחממה ( איור 2F).
21. לפקח על התאים שבייקר 37 מעלות צלזיוס דוגרים מעת לעת לתמוגה (שעה בערך 3 מהזמן של חיסון). הפוך את דילולים מ27 דילולים הראשוניים (10 ^-2) בצינורות המתאימים, שכותרתו אפנדורף בתקופה זו.
22. כדי לבצע דילולים אלה מ27 דילולים הראשוניים מ3.12 לעיל, לקחת את של LB 100 μl עם חיידקים מצינור Eppendorf 1 (BSA שכפול אחד, ראשון של דגימות מהשלושה עותקים מזה גם 1/100 דילול זה) ולהוסיף אותו 900 μl של LB בצינור Eppendorf 4 (1 x 10 ^-4 דילול של שכפול BSA אחד, הראשון של דגימות שלושה עותקים מזאת היטב).
23. מחק את קצה מחסום מסנן לאחד חדש לפני קבלה של LB 100 μl עם חיידקים מצינור Eppendorf 4 להוסיף ל900 μl של LB בצינור Eppendorf 7 (1 x 10 ^-5 דילול של שכפול BSA אחד, הראשון של שלושה עותקים דגימות מזאת היטב). המשך דילולים (דשל x עד 1 10 ^-6) עבור כל triplicates של כל השכפולים של כל החלבונים והטיפולים (135 צינורות בסך הכל).
24. ברגע שהתאים lysed, להביא את התרבות ל0.5 M NaCl על ידי הוספת 5 מיליליטר מ5 מניות M NaCl ולהעביר לבקבוק צנטריפוגה שכותרתו.
25. צנטריפוגה ב XG 8,000 10 דקות ב 4 ° C. למזוג supernatant (וירוס) לתוך צינור נקי, סטרילי 50 מיליליטר פלקון.
26. הוסף כמה טיפות של כלורופורם לsupernatant יצק בצינור פלקון.
27. חנות ב 4 ° C לסיבוב בחירת הזיקה הבא.

4. יום שלישי

1. החיטוי או להלבין את כל מעבדתי שנעשה שימוש ביצירת זיקת בחירת הסיבוב הזה כדי להתכונן לסיבוב הבא.

5. Titering

1. מספר רבים צלחות ^AMP מוצקות LB ¹⁰⁰ כפי שיש דילולים בסדר עולים (יש כעת אמורה להיות צלחת 1 לכל צינור וצינור Eppendorf ורוסיליקט, כל אחד עם המספר זהה). Put הצלחות בחממת 37 ° C (איור 3D).
2. להמס agarose העליון (1.0 גרם Bacto Tryptone, תמצית שמרי 0.5 גרם, 0.5 גרם NaCl, 0.6 agarose גרם, להפוך ל100 מיליליטר, החיטוי) על ידי שחרור הפקק של בקבוק agarose העליון ולסירוגין במיקרוגל את הבקבוק ומתערבל בו כדי לערבב אותו עד שהחלק העליון agarose נמס לחלוטין. שים את הבקבוק באמבט המים להתקרר ל50 ° C (איור 3E).
3. קח טפטפת מיליליטר ורוסיליקט 10 עם משאבת פיפטה המצורפת. להדליק מבער בונזן. הפעל בעל צינור פלקון קלקר או מכסה קריר במהופך על הספסל ובמקום צלחות LB100 AMP 1 עד 6 (טרי מתוך האינקובטור 37 מעלות צלזיוס) על זה, עליון (איור 4 א) פלייט 1. הקלקר שומר על הצלחות חמות.
4. שים 250 μl BLT5403 תאים מ4 ° C לכל אחת ממבחנות ורוסיליקט הממוספרת הכינו ביום אחד למעלה (סעיף 3.7 ומספרים 4B ו4C). Arנע צינורות ורוסיליקט הממוספרים באותה סדרה עולה כדילולים ב1.5 מיליליטר Eppendorf הצינורות (איור 4 א).
5. שים 100 μl מהדילול בצינור Eppendorf 1 ב250 μl של תאים במבחנה בורוסיליקט 1 (4D דמויות ו4E). מחממים את 5 הראשונים בשל פיפטה מעל הלהבה קצת (! ~ 3 swipes לא יותר מדי, איור 4F) ולצלול לתוך agarose העליון המותך. משוך את 3 מיליליטר ולספק במהירות לתוך המבחנה על גבי התאים / הפאג (איור 4G).
6. מערבבים על ידי מצליף עם אצבע בזמן שמחזיק את הצינור ביד השנייה (איור 4H) ולשפוך את התכולה על הצלחת (איור 4I). הטה את הצלחת ולהשתמש במבחנה לרדוף אחרי בועות וכתמים יבשים עד שכל הצלחת מכוסה בagarose העליון. להגדיר אותו בצד, זקוף על הספסל להתקרר.
7. מחק את צינור ורוסיליקט, להוציא את קצה מחסום מסנן, מקבלטרי אחד ולהמשיך עד שכל דילולים כבר מצופים. אחזר ¹⁰⁰ צלחות ^AMP LB מן החממה כפי שהם מתרוקנים, אך לא יותר מ 6 בכל פעם או שהם מגניבים וagarose העליון מתמצק במהירות רבה מדי.
8. לאחר agarose העליון הוא מוצק, להפוך את הצלחות הפוכות (חשוב לעשות את זה). אחרת, אגר / agarose "בוכה", מתעבה על המכסה, יורד למטה בagarose העליון ודורס אותו, לוקח את הפאג עם זה שהופך אותו בלתי אפשרי כייל במדויק) וגם: 1) לשים את הצלחות ב37 ° C חממה [תחזור 4 שעות מאוחר יותר לספור את כייל כT7 הוא אגרסיבי] או: 2) השאירו אותם במהופך על הספסל והם מוכנים למחרת בבוקר לספור כייל.
9. אם ניקח את כל אמצעי הזהירות הנדרשת כדי להגן מפני ניפוץ הזכוכית, או פציעה אם כן, לשים את הפקק של בקבוק agarose העליון חזרה על agarose העליון רופף ומיקרוגל עד שהיא רותחת. לעשות את זה פעמיים. תן לזה להתקרר, להדק אתכובע ולשים אותו משם. סובב את אמבט המים עד לטמפרטורה הרגילה שלו או לכבות אותו. שים דילולים במקרר 4 ° C. הם יהיו צורך לפרש את כותרות ו / או לבצע שוב כמה Titering.

6. קביעה וחישוב כייל

1. בדוק את השלט נוצר על הצלחות וזורקים אותם עם תמוגה מחוברות (לדוגמא איור 5 א 10 ^-2 דילול). לקבוע אילו מדילולי סדרתי שנותרו יצרו כמה מספיק פלאק כדי לאפשר מניין מדויק (5A דמויות 5B nd). רשום את מספר הלוחית מצלחות אלה (טבלת 1; איור 5 ב).
2. הכפל את המספר של פלאק על ידי הדילול ולאחר מכן להכפיל את המספר הזה על ידי 100 כדי לקבל את המספר של פלאק יוצרי יחידות לכל מיליליטר של חיידקים נגועים נלקחו מהבארות (כלומר רק 10 μl של חיידקים נגועים נלקחו עבור כל אחד מtriplicates והיםo זה חייב להיות כפול 100 כדי לקבל ספירה לכל מיליליטר). ממוצע מספר יחידות יצירת לוחית (PFU) למיליליטר, (PFU / מיליליטר של חיידקים חי נגועים נלקחו מתוך צלחת microtiter היטב), על פני שלושה triplicates לקוח מכן.
3. טופס הממוצע גדולה של התגים לשלוש בארות לשכפל ולחשב את סטיית התקן של ממוצע זה (טבלת 1). זה מה שיירשם בדמותו של הגידול בכייל הפאג לכל סיבוב בחירת זיקה וטיפול (איור 5 ג).

7. בידוד פלאק, PCR, ורצף

1. בסופו של סיבוב בחירת זיקת 4, בחר 18 בודד, מוגדרים היטב, מושבות רובד ו, באמצעות פיפטה פסטר סטרילי, קיסם, קצה פיפטה צהוב או מכשיר דומה, ליבת רובד אלה מצלחות Titering. אם משתמש בצינורות או טיפים, להרטיב ראשון בתוך עם טריס-HCl, pH 8.5 בצינור Eppendorf (איור 5D).
2. אם באמצעות צינורות, לוודא שהצינור ורוסיליקט מחזיק שום טיפות עודפות של טריס, לדכא את הנורה, ועימה עדיין דחוס, לדחוף את קצה פיפטה ורוסיליקט באמצעות שלט גם מבודד זכות לצלחת פטרי מפלסטיק מתחת (איור 5E). שחרר את הנורה עם קצה פיפטה עדיין בagarose אגר / העליון ולמצוץ את הליבה (איור 5F, ראה חץ).
3. לגרש את הליבה ל100 μl טריס-HCl, pH 8.5 בצינור המתאים (איור 5G) ובקצרה המערבולת.
4. מחממים 20 μl מכרך זה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה נפח המחומם ב13,000 XG בצנטריפוגה המעבדתיים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. קח 3 μl מsupernatant של aliquot זה כדי לשמש בתגובות PCR עם פריימרים T7-UP וT7-DOWN.
6. לכל אחד מהרובד המבודד 18, פתרונות מחוממים, להפוך את תגובת 50 μl-PCR באמצעות חישול בטמפרטורה של 58 מעלות צלזיוס ו35 מחזורים.
7. הפעל 20 μl של EACתגובת h ב 1% (w / v) agarose ג'ל המכיל 0.015% (v / v) ethidium ברומיד. דמיין עם transilluminator באמצעות הגנה על העין מתאימה ומעבדת nitrile כפפות. (זהירות: ברומיד ethidium הוא mutagen חזק.) צלם את הג'ל ולהיפטר מחומרים מזוהמים כראוי (6A דמויות ו6 ב).
8. אם amplicons הם מוצרים יחיד, ולא מוקטור ריק (מוצר פועל ליד 100 נ"ב על 1% (w / v) agarose ג'ל טה; 6A דמויות ו6B חיצים), לנקות 30 μl שנותר לשימוש כתבנית סידור. אם לא רק מוצר אחד על הג'ל (איור 6 ב, לוח 15), לחתוך את הלהקה הבולטת ביותר (ים) מג'ל ולחלץ את ה-DNA מג'ל באמצעות ערכה.
9. רצף amplicons שאינן וקטורים ריקים באמצעות פריימר T7-UP.
10. בחן את כל רצף לזרועות מקשר ו, ממידע זה, לקבוע היכן תחילתו של הכנס הוא ממוקם. השתמש Baכך במקור מקומי יישור כלי חיפוש (תפציץ; הספרייה הלאומית לרפואה) כדי לקבוע את זהותו של cDNA המקודד, בין אם ההוספה היא במסגרת, ואם כן, מה חלק של חלבון רצף קידוד (CDS) כבר מוצג ונתפס על ידי פיתיון.

Results

היכולת לפגוע ביכולתו של הפיתיון כדי לקיים אינטראקציה עם חלבונים המוצג הפאג (מטבולית מרעיל את הפיתיון) מספקת שליטה שלילית חזקה לטכניקה זו. כמו כן, מומלץ לקבוע אם הפיתיון, כאשר חייב צלחת microtiter היטב, שומר על תפקודו. שתי בדיקות אלה יגבירו את הביטחון כי חלבונים התאוששו על ידי פיתיון nonpoisoned אינטראקציה, המוצג הפאג הם לגיטימיים.

דגימת שלושה triplicates מכל טוב, מוסיפה במידה ניכרת לזמן והעבודה הכרוך בבחירת הזיקה...

Discussion

על ידי הפעלת הניסוי בשלוש בארות משוכפלים, ניתן להבחין הפאג שנרכש באופן עצמאי של אותו החלבון מחייב את הפיתיון גם אם הם זהה שיבוט (כלומר אין הבדל ברצף נוקליאוטידים של אזור CDS שכבר נרכש, אבל אלה היו נאסף מבארות עצמאיות). אחרת, הדרך היחידה להבחין בין הפאג קידוד אותו החלבון מחייב את הפיתיון היא אם הם באופן עצמאי להפוך אזורים עיבד שונים בחלק כלשהו של רצף נוקליאוטידים.

השימוש באחד בקבוק Fernbach לגדול בה כל הח...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
טריפטון	בקטון דיקינסון ושות'
211705 תמצית שמרים	בקטון דיקינסון	212750
אגר	בקטון דיקינסון	214010
נתרן כלורי	פישר מדעי	BP358-10
אגרוז	מוצרי מחקר בינלאומיים	A20090
מגיב	חוסם EMD כימיקלים בע"מ	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
נתרן הידרוקסיד	Fisher Scientific	BP359-212
נתרן דודציל סולפט	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	גנוטיפ: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, מוצרי מחקר מלח	נתרן בינלאומי	A40040
אתידיום ברומיד	פישר סיינטיפיק	BP102-1
אלבומין סרום בקר (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
הנוגדן העיקרי Penta-HIS	Qiagen Inc.	34660
עיזים נגד עכברים אלקליין פוספטיז מצומד	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP פריימר	EMD כימיקלים בע"מ		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
פריימר	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR ערכת טיהור	Qiagen Inc.	28104
ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
חימום בלוק	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96 בארות צלחות תרבית תאים	קורנינג	קוסטאר 3590
תנור חממה איזוטמפ	פישר מדעי	516D
פסטר פיפטות, 5 & # 190; בפישר	סיינטיפיק	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
כפפות, ניטריל	פישר סיינטיפיק	19-170-010C
צינורות סטריליים 1.5 מ"ל	ארה"ב סיינטיפיק בע"	1615-5500
10 מ"ל בורוסיליקט פיפטס	פישר סיינטיפיק	13-678-25E
צינורות תרבית בורוסיליקט	פישר סיינטיפיק	14-961-27
Uniskan I, קורא לוחות ELISA	מעבדות Labsystem ו-Flow, הלסינקי, פינלנד	Type 362