הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

28.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50688

⸱

7 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical, וכו '.

תקציר

מערכת העצבים enteric היא רשת עצומה של תאי עצב וגליה לאורכו של מערכת העיכול ששולטת תפקודי תנועתיות מערכת העיכול. הליך לבידוד והתרבות של אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב וגליה ממקלעת myenteric מתואר. יכולות להישמר בתרבויות העיקריות במשך 7 ימים, עם קשרים המתפתחים בין תאי עצב וגליה. רצועת השריר האורכי עם myenteric מקלעת המצורפת הוא נגזל השריר המעגלי הבסיסי של המעי גס והעכבר או נתון לעיכול אנזימטי. בתנאים סטריליים, האוכלוסייה העצבית וגליה המבודדת נשמרות בתוך צנטריפוגה הבאה גלולה ומצופית על coverslips. בתוך 24-48 שעות, תוצאה neurite מתרחשת ויכול להיות מזוהה על ידי תאי עצב סמני הפאן עצביים. לאחר יומיים בתרבות, פוטנציאל פעולת אש נוירונים בודד כפי שנצפה על ידי מחקרי מהדק תיקון. יתר על כן, גליה enteric יכולה להיות גם identifמטען חבלה על ידי צביעת GFAP. רשת של נוירונים וגליה בפרד קרוב יוצרת בתוך 5 - 7 ימים. נוירונים מעיים יכולים להיות פרטני וישירות נחקרו באמצעות שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, ותא בודד PCR. יתר על כן, ניתן לבצע הליך זה בבעלי חיים מהונדסים גנטי. מתודולוגיה זו היא פשוטה לביצוע ולא יקר. באופן כללי, פרוטוקול זה חושף את המרכיבים של מערכת העצבים enteric באופן מניפולציות בקלות, כך שאנו עשויים לגלות טובים יותר את הפונקציונליות של ENS במדינות נורמליות ומחלה.

מבוא

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצומה של עצבים וגליה שפועלת לכל האורך של מערכת העיכול (GI). ENS פונקציונלי שולט בכל ההיבטים של מערכת העיכול, כולל תנועת מעיים, קליטה / הפרשת נוזלים, תחושה של גירויים, וכו '(לסקירה ראה 1). הוא מכיל מעל 500 מיליון נוירונים, יותר מאשר נמצא בחוט השדרה, והוא מכיל בכל כיתת מוליך עצבי במוח. יתר על כן, ENS הוא ייחודי בכך שהוא יכול לתפקד רפלקסיבי ללא קלט ממערכת העצבים המרכזית 2. הבנה של ENS היא קריטית, לא רק כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי הרגיל שלו, אבל כדי להבין את מעורבותה במגוון רחב של neuropathies אשר יכולה להיות מולדים (מחלת הירשפרונג של), שנרכשה (Chagas), משנית למחלת הברית (gastroparesis הסוכרתי), תרופה המושרה (תסמונת מעי אופיואידים), או עקב פציעה (ileus לאחר ניתוח) 1. בנוסף לכך, תאי עצב מעיים יכולים להיות מחדשservoir לזיהום נגיפי (אבעבועות רוח זוסטר) 3. בגלל דמיונה למוח ואת הרמות הגבוהות של סרוטונין במעיים, לעתים קרובות יש תרופות שנועדו לטיפול בליקויים במערכת עצבים מרכזיים תופעות לוואי בלתי רצויות על ENS 2. זה גם ראוי לציין כי neuropathies רבים כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון מראה שינויים תאיים דומים בתאי העצב, הרבה לפני ההופעה שלהם בתאי עצב מרכזיים המעיים, מה שהופך ENS מודל נגיש ללמוד פתוגנזה של מחלות אלו 4. לכן, הבנה מעמיקה של ENS היא הכרח בהבנת מצבי מחלה ומניעה / ניבוי תופעות לוואי תרופתי.

הנוירונים של ENS נחקרו באופן מסורתי בחזיר באמצעות הכנות wholemount 5-7 או נוירונים בתרבית 8. למרות הקלות שבה ניתן ללמוד נוירונים בחיה הגדולה הזה, מודל זה יש מגבלות רבות, כוללחוסר של זנים מהונדסים גנטי, חוסר של חומרים כימיים ספציפיים למין זה, ואת העלות הגבוהה הקשורה עם ההזמנה ודיור נושאים אלה. יש ההתפתחות של מודל מערכת עצבים enteric עכברי את היתרון הייחודי של דפיקה שונות מתוך מערכות, מגוון רחב של שיטות אחרות שהוקמו, שניתן להשתמש בשילוב עם טכניקת תרבית התאים, ואת היכולת לספק אימות למודל חזיר גינאה .

ENS מורכב משלושה plexi הפועלים אורך של מערכת העיכול: myenteric מקלעת החיצונית (בין השריר האורכי וחוזר) האחראית בעיקר לפעולות הנפיחה של המעיים, כמו גם plexi submucosal והרירי, ( מצא מתחת ובתוך הרירית, בהתאמה), אשר במידה רבה שולטת בקליטה / הפרשת נוזלים וזיהוי של גירויים 1. שיטה זו מתחילה בבידוד של הכנת מקלעת שרירים / myenteric האורך (LMMP) על ידי קילוףאת השכבה החיצונית של השרירים מערכת העיכול. כך יצמצם את הזיהום באופן דרמטי בנושאים שעולים כאשר השכבה הרירית מעורבת בבידוד. כתוצאה מכך, תהליך זה הוא אידיאלי ללימוד שליטה העצבית של תנועתיות ולא פעולות הפרשה של ENS.

השיטה שהוצגה כאן תוצאות בתרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מעיים. לפחות שני סוגים שונים של תאי עצב מבוססים על תצפיות בהווה ואלקטרו immunocytochemical קודמות 9. הנוכחות של גליה היא יתרון מאוד, כפי שהם לא רק סוג תא חשוב ללמוד בזכות עצמם, אבל הם תורמים להישרדות של תאי עצב enteric 10 ולשמור על ביטוי הקולטן מולדת על פני התא העצבי 11. יתר על כן, ליקויים של גליה enteric עלולים להוביל למצבים חריגים במערכת העיכול מחלות תנועתיות, טבע 12 'נוירו gliopathies'. לכן, תרבות ENS מוצגת כאן Results בכמה סוגי תאים כי הם בשלים לחקירה.

היתרונות למתודולוגיה זו הם להקל על בידוד, דרישות כלי זולות, וזמן קצר כדי ללמוד את הטכניקה על ידי אנשי מעבדה מנוסים. מגבלות המתודולוגיה כוללות תשואה נמוכה כוללת של תאים מרקמות כרכים גבוהים והרחקה של נוירונים ENS מplexi הרירי וsubmucosal. הליך זה יהיה יתרון מאוד לחוקרים המתמחים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, תא בודד PCR, ושיטות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות היו בהתאם ובאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת וירג'יניה.

1. הכנת coverslips הזכוכית פולי-D-ליזין וLaminin מצופה סטריליים ב24 גם צלחות

  1. כל הנהלים לשלב 1 מבוצעים בתנאים סטריליים; מתחת למכסת מנוע, ועם חומרים כימיים סטריליים. coverslips זכוכית והמים deionized כפולים (DDH 2 O) צריכים להיות מעוקרים מראש. הכנת צלחות ניתן לעשות עד שבועיים לפני בידוד תא עצב.
  2. מתחת למכסה המנוע, להשתמש במלקחיים סטריליים למקום coverslips זכוכית autoclaved ב12 בארות של צלחת 24 באר.
  3. הכן את מניית פולי-D-ליזין מבעוד מועד. הוסף 50 מ"ל של ddH2O סטרילי עד 5 פולי-D-ליזין מ"ג. וורטקס וחנות ב3 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הפשירי aliquots לפני השימוש.
  4. לריכוז סופי של מניית פולי-D-ליזין 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2: 80 פיפטה μlמניית של פולי-D-ליזין על גבי כל כוס coverslip (2 2 ס"מ). תנו פתרון להתפשר על 10 דקות.
  5. הסר ואקום באמצעות פולי-D-ליזין ולשטוף coverslips 3x עם סטרילי DDH 2 O.
  6. לאפשר צלחות להתייבש במשך לפחות שעה 2 מתחת למכסת המנוע.
  7. צלחות עשויות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או - 20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לציפוי laminin.
  8. הכן את מניית laminin מבעוד מועד. הפשירי laminin על קרח ולשמור על קרח בעת השימוש. לדלל את ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל; לשים לב לריכוז הרבה, כל מגרש יהיה שונה. בהתאם לריכוז רב, כ 20 מיליליטר DDH 2 O יתווסף לכל בקבוקון של laminin. Aliquot (5 מ"ל) ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquots על קרח לפני השימוש.
  9. coverslips מעיל עם 5 מיקרוגרם / 2 ס"מ; laminin μl פיפטה 200 מניות laminin על כל coverslip.
  10. דגירה פתרון laminin על coverslips במשך שעה 1.
  11. לשאוב פתרון laminin שנותר ולשטוף coverslips פעם אחת עםDDH 2 O. הימנע מגירוד פני השטח של coverslips.
  12. צלחות לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.

2. הכנה מראש של Neuron פתרונות בידוד

  1. הכן את פתרון קרבס (מ"מ: 118 NaCl, KCl 4.6, 1.3 אא 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 גלוקוז, ו2.5 CaCl 2). מקום 13.79 גרם NaCl (FW 58.44), 0.686 גרם KCl (FW 74.55), 0.312 גרם לאא 2 PO 4 (FW 120), .289 גרם MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 גר 'NaHCO 3 (FW 84.01), גרם גלוקוז 3.96 (FW 180.2), ו0.555 גרם CaCl 2 (FW 111) ב2 ליטר DDH 2 0. לצנן עד 4 ° C.
  2. הכן לשטוף תקשורת (F12 תקשורת עם 10% עוברי שור בסרום (FBS) ואנטיביוטיקה / antimycotic): לבקבוק 500 מ"ל של F12 תקשורת, להוסיף 50 מ"ל FBS ו5 מ"ל של נוזל אנטיביוטי 100x / antimycotic (Gibco).
  3. הכן תקשורת נוירון enteric (Neurobasal מדיה עם B-27, L-גלוטמין,, Neurotr 2 מ"מ 1% FBS 10 ng / ml, גליה נגזרפקטור ophic (GDNF), ונוזלי 100x אנטיביוטיקה / antimycotic). כדי להפוך את מניית GDNF, להוסיף 1 מיליליטר ddH2O לGDNF מיקרוגרם 10 ולהקפיא בחזרה ב50 aliquots μl, חנות ב -80 ° C. לבקבוקון 50 מ"ל של תקשורת נוירון השלם, לשלב 47.5 מ"ל Neurobasal מדיה, 50 מניות 1 מיליליטר B-27 (50x), 500 FBS μl, 500 μl 200 מ"מ L-גלוטמין (Gibco) μl GDNF ו500 אנטיביוטי / μl נוזלי 100x antimycotic. תקשורת נעשית בקבוצות קטנות 50 מ"ל על מנת להבטיח טריות GDNF וכדי למנוע זיהום של כמויות גדולות של תערובת תקשורת סלולארי יקרה זה.

3. קציר הכנת מקלעת שריר / Myenteric אורכית (LMMP) מעכברים

  1. אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה צריכה להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. עכברים וובסטר שוויצרי למבוגרים במשקל מעל 25 גרם (בדרך כלל מעל 8 שבועות של גיל) הם שוכנו בקבוצות של 6 לפני ניסויים. רקמות משני עכברים המשמשות לבידוד של נוירונים enteric ileal וגליה ושלושה עכברים משמשיםבידוד של תאי מעי הגס.
  2. הכן את אזור ניתוח. אסוף את המספריים קטנים כירורגיות, מלקחיים זווית, צמר גפן, שלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל, ומוט זכוכית / פלסטיק (מכחול). ודא כי כל הציוד נשטפים ביסודיות ושטף לפני השימוש כדי למזער את הזיהום. צעד זה יכול להתבצע ביום שלפני הניסוי.
  3. הנח פתרון קרבס על קרח ואת הבועה עם carbogen (חמצן 95%, 5% CO 2) במשך לפחות 30 דקות כדי לייצב את רמת החומציות.
  4. הפעל ציוד שונים וכימיקלים חמים לייצב בטמפרטורות רצויות; אמבט מים חום (ים) עד 37 מעלות צלזיוס צנטריפוגות מגניבה, עד 4 מעלות צלזיוס, מקום הפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) וטריפסין 0.5% באמבט מים (37 מעלות צלזיוס ). תקשורת נוירון השלמה ומדיה לשטוף צריכה להישאר בקירור.
  5. קרח קר מקום 150 מ"ל בעבע קרבס בשלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל שכותרתו 'מלוכלכת', 'נקי', ו 'LMMP'. כוס בועה שכותרתו 'LMMP' עם carbogen.
  6. בעקבות אישור מועדת אתיקה, להרדים מ 'ouse על ידי נקע בצוואר רחם או במשותף מחנק 2.
  7. מקם את העכבר בrecumbence הגבי על פני השטח, עור נקי כירורגית עם EtOH 70%, ולהרים את עור בטן באמצעות מלקחיים. בעזרת מספריים, חלל בטן פתוח ולחשוף את איברי עיכול פנימיים.
  8. הסר את האורך של מערכת העיכול על ידי הרמת חלק של מעי ומגלה לפדרו. חיתוך באמצעות לפדר עם מספריים כדי להסיר בעדינות ולפענח מעי ומעי גס, נזהר שלא למשוך לפדר מהמעי / המעי הגס.
  9. לאחר באורך המלא של מעי נפרם, הסר את המעי על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי ולקיבת פרוקסימלי לcecum. הערה: הליך זה יכול גם להתבצע עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס דיסטלי לcecum להפרוקסימלי ל פי הטבעת.
  10. רקמות ניתן לחלוקה נוספת בין מעי גס הפרוקסימלי ודיסטלי, וjejenum, ומעי. שאר הליך זה יתייחס לבידוד של המעי; לאהוא התהליך זהה לבידודה של LMMP מעי גס. הנח את כל המעי במכל זכוכית עם הקרח הקר קרבס מסומן 'מלוכלך'.
  11. ליצור כלי לניקוי המעי; בוטה מחט גדולה 20 G באמצעות אבן הגשה ולצרף אותו למזרק גדול (10 מ"ל) המכיל קרח קר קרבס.
  12. יש לנקות את צואה מהמעי על ידי חתך המעי לשלוש או יותר חתיכות גדולות. הסר סעיף ileal מהכוס ומניח את המחט הקהה לסוף פיסת ileal.
  13. בעדינות תריץ את קרבס דרך סעיף הבטן עד שכל החומר צואתי יוסר לתוך מיכל פסולת נפרד. הנח את הסעיף ניקה לתוך המכל של קרבס המסומן "נקי". חזור על פעולה עד כל המעי הוא ניקה.
  14. כדי להסיר LMMP, לחתוך את המעי למקטעים קטנים, כ 4 - 2 ס"מ. הנח קטע של מעי בפלסטיק או מוט זכוכית; מעי צריך להתאים מלבב, אבל לא יהיה רופף או מתוח (~ 2 מ"מ). בגין הסרת LMMP בעדינות על ידי הסרת פיסות לפדר עדיין לצרףאד לדרכים (GI) במערכת העיכול באמצעות מלקחיים. למנוע את מערכת העיכול ממסתובב סביב מוט בעדינות על ידי הצמיד לצינור המוט באמצעות האגודל.
  15. הפרד LMMP מהשריר מעגלי הבסיס; ראשון לשפשף בעדינות את הקצה של המלקחיים לאורך כל הקו שבו לפדר צורף, מלמעלה עד למטה של ​​המגזר, בעדינות יוצר פער בשריר האורכי. ואז בעדינות להקניט אחד את השריר האורכי באמצעות מקלון צמר גפן רטוב עם קרבס.
  16. מתחיל בחלק העליון של הפער בשריר האורכי ולהקניט מרחק באמצעות שבץ האופקי הקל תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי; לעשות את זה לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור לפדר.
  17. ואז בעדינות מתחיל לעקוף את צינור העיכול; נע מלמעלה למטה ובחזרה כמו השריר האורכי מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. כאשר שלם,LMMP יבוא ממני באופן טבעי את השארית של צינור העיכול.
  18. מניחים הרצועה דקה כתוצאה של שריר האורכי בכוס המסומנת "LMMP '. חזור על פעולה עבור כל המגזרים.
  19. לאחר שכל הרצועות של LMMP כבר נאספו מעכבר אחד, חזור על תהליך עבור כל עכברים אחרים בשימוש. יש לשטוף היטב את הכוסות 'מלוכלכות' ו 'נקיות' לפני השימוש חוזר.
  20. יש לשטוף את LMMP 3x להסיר זיהום ביולוגי. מלא שלושה 2 מ"ל אפנדורף צינורות עם הקרח הקר קרבס. מניחים את רצועות LMMP בצינור הספין הראשון במשך 30 שניות ב356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר את רצועות LMMP לצינור מלא נקי קרבס הבא. חזור על תהליך זה עבור כל צינור הנותר.

4. תקציר LMMP

  1. הכן את פתרון עיכול על ידי הצבת 13 מ"ג collagenase סוג 2 ו 3 מ"ג BSA בcarbogen-בעבע פתרון 10 מ"ל קרבס.
  2. מגזרי מקום LMMP השטוף לפתרון עיכול וscis שימושsors כדי לגזור LMMP לחתיכות קטנות.
  3. תקציר LMMP למשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם שייקר בזמן שמבעבע בעדינות עם carbogen.
  4. לאחר העיכול יושלם, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ל8 דקות ב 356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C.
  5. מכאן ולהבא צריכים לעשות את כל ההליכים בתנאים סטריליים במכסת מנוע תרבית תאים! כל חומרים כימיים ומכלי צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש.
  6. במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון טריפסין 0.05% על ידי הצבת 1 מ"ל חימם טריפסין 0.25% ו 4 מ"ל חימם HBSS לתוך צינור תא 50 מיליליטר סטרילי תרבות.
  7. לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. לא להשתמש בשואב אבק, זה כנראה יהיה למצוץ את התא גלולה עקב מהירויות נמוכות צנטריפוגה. מוציא בזהירות את התא גלולה והמקום לתוך צינור נקי עם 5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05%.
  8. לעכל את התאים בתמיסת טריפסין 0.05% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם הרעד במשך 7 דקות. לא תעלה על 7 ק"מn טיפול טריפסין מוחלט או נוירונים יאבדו.
  9. לנטרל טריפסין עם 10 מ"ל של תקשורת לשטוף קרה אחרי 7 דקות של הטיפול בטריפסין.
  10. צנטריפוגה תאים ל8 דקות ב 356 x גרם. להסיר ולסלק תקשורת.
  11. במהלך צנטריפוגה, לאזן את קטע של רשת Nitex עיקור על גבי תא צינור 15 מ"ל סטרילי תרבות.
  12. לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. בעדינות תערובת תאי resuspend ידי triturating ב3 תקשורת נוירון שלמה מ"ל. הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה וכל הצעדים העתידיים שבו תערובת תא triturated. צריך לעשות את כל triturations בעדינות רבה. פתרון תא סינון דרך Nitex הרשת לתוך צינור 15 מיליליטר תרבית תאים הנקי.
  13. אופציונלי: צינור תרבית תאים שווי ומניח במיקסר חולה בקירור (או כל מיקסר המספק סיבוב) עם גלגול והטיה עדינים למשך 30 דקות. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ.
  14. אופציונלי: לאחר מיקסר חולה, להוסיף 2 תקשורת לשטוף קרה מ"ל לשטוף את התאים.
  15. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (8 דקות, 356 XG). להסיר ולהשליך supernatant.
  16. Resuspend תאים ב-1,200 תקשורת נוירון המלאה μl. Triturate תאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל. לא ליצור בועות אוויר. פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הגושים שבורים ותאים מושעים לנוזל.
  17. הוסף 750 μl של מדיה מלאה לכל אחת מהבארות המכילות 12 coverslip זכוכית מצופה מראש ולהוסיף 100 μl של פתרון תא triturated.
  18. דגירה נוירונים בתרבית תאי חממה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  19. שינוי מחצית התקשורת הסלולרי כל 2 ימים.
  20. הנוירונים הם מוכנים להקלטות אלקטרו לאחר 1 - 2 ימים בתרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מייד לאחר הבידוד של תאים שמקורם LMMP, נוירונים וסוגי תאים אחרים לא יהיה מוכן מאליו. חיים, ניתן לראות תאים עגולים של הפנוטיפ לא ברור, כמו גם שאריות רקמה מברי רקמה מתעכלים חלקי ורקמות חיבור. סחופה זה לא עניין ויוסרה במידה רבה עם שינוי התקשורת הראשונה ביומיים. אל תנסו לנקות את השקופיות לפני זה כמו התאים הבריאים, קיימא יוסרו גם כן.

אחרי יום אחד בתרבות, הנוירונים יתחילו להראות תוצאה neurite. זיהוי ספציפי של תאי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעלי חיים המשמשים

פרוטוקול זה כבר מותאם לעכברים וובסטר שוויצרי. עם זאת, שיטה זו היא להתאמה בקלות ליונקים אחרים בינוני וקטנים כגון חולדות ולזנים אחרים של עכברים. יש לנו לבצע בהצלחה בידודים ראשוניים עם C57 עכברים וקולטניים μ-אופיואידים לדפוק-outs. עם זאת, ייתכן גם שזנים אחרים של עכברים עשויים להיות בעייתיים עקב שינויים מורפולוגיים במערכת העיכול. יתרה מזאת, קיימים הבדלים בין זני עכבר ידועים (C57BL / 6 לעומת BALB / ג) ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים גדולים קיימים.

תודות

המכון הלאומי לבריאות גרנט DA024009, DK046367 & T32DA007027.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Reagents
Fisherbrand Coverglass למשקפי כיסוי צמיחה (קוטר 12 מ"מ)Fisher Scientific12-545-82 
פולי-D-ליזיןסיגמאP6407- 5 מ"ג 
צלחת תרבית תאים 24 בארותCELLTREAT229124עשוי להשתמש בכל מותג
LamininBD Biosciences354 232 
ddH2Oיכול להכין במעבדה 
15 מ"ל צינור צנטריפוגה סטריליGreiner Bio-one188261יכול להשתמש בכל מותג
50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטריליGreiner Bio-one227261יכול להשתמש בכל מותג
NaClFisher BioReagentsBP358-212MW 58.44
KClFisher BioReagentsBP366-500MW 74.55
NaH2PO4 .2H2Oפישר כימיקליםS369-3MW137.99
MgSO4Sigma AldrichM7506-500GMW 120.4
NaHCO3Sigma AldrichS6014-5KGMW 84.01
גלוקוזפישר כימיקליםD16-1MW 180.16
CaCl22H2Oסיגמא אולדריץ'C5080-500GMW 147.02
F12 מדיהGibco11330 
סרום בקר עובריאיכות ביולוגית בע"מ110-001-101HIרשאי להשתמש בכל מותג
אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית 100x נוזליGibco15240-062 
Neurobasal A mediaGibco10888 
200 מ"מ L-גלוטמיןגיבקו25030164 
גורם נוירוטרופי נגזר גליה (GDNF)נוירומיקהPR27022 
מספריים חיתוך מחודדיםפישר סיינטיפיק8940עשוי להשתמש בכל מותג
ניתוח רקמות מלקחייםפישר סיינטיפיק13-812-41עשוי להשתמש בכל מותג
אפליקטורים עם קצה כותנהפישר סיינטיפיק23-400-101עשוי להשתמש בכל מותג
250 מ"ל זכוכית מדורגתפישר סיינטיפיקFB-100-250עשוי להשתמש בכל מותג
2 ליטר בקבוק זכוכית ארלנמאיירפישר סיינטיפיקFB-500-2000עשוי להשתמש בכל מוט
פלסטיק (מברשת צבע לילד)Crayola05 3516עשוי להשתמש בכל מותג
CarbogenAirgasUN 31565% CO2
10 ml מזרק Leur-lockבקטון דיקינסון309604ניתן להשתמש בכל מותג
21 גרם x 1 1/2 אינץ'. מחט היפודרמיתבקטון דיקינסון305167עשוי להשתמש בכל מותג
קולגנאז סוג 2וורת'ינגטוןLS004174 
סרום בקר אלבומיןביואנליטי אמריקאיAB00440 
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה אפנדורףפישר סיינטיפיק13-864-252עשוי להשתמש בכל מותג
Nitrex Mesh 500 ומיקרו; MElko Filtering Co100560רשאי להשתמש בכל מותג
Pipette SetFisher Scientific21-377-328רשאי להשתמש בכל מותג
SharpeiningStone Fisher ScientificNC9681212רשאי להשתמש בכל מותג
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (קולט אדים לתרבית תאים)NuaireNU-425-400עשוי להשתמש בכל מותג
10 L רועד WaterbathEdvotek5027עשוי להשתמש בכל מותג
Microcentrifuge 5417REppendorf5417Rעשוי להשתמש בצנטריפוגה אחת גדולה יותר עם מתאמי גודל
Allegra 6 Series CentrifugeBeckman Coulter366816עשוי להשתמש בכל מותג
HuluMixer Sample MixerInvitrogen15920D 
חממת מעיל מים CO2 AutoFlowNuiareNU-4750עשויה להשתמש בכל מותג
סולם איזון אנליטימטלר טולדוXS104עשוי להשתמש בכל מותג

מקורות

  1. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
  2. Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
  3. Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
  4. Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
  5. Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
  6. Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
  7. Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
  8. Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
  9. Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
  12. Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
  13. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
  14. Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
  15. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  16. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
  17. Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שריר אורכיעיכול אנזימטיבידוד תאיםאימונוהיסטוכימיהאלקטרופיזיולוגיהדימוי סידןPCR של תא בודדצביעת GFAP
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.