מציאה גן בקנה מידה גדולה ב ג elegans שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

סיכום

בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.

תקציר

התערבות RNA על ידי האכלת חיידקי תולעים להביע dsRNAs כבר כלי שימושי כדי להעריך את תפקוד גן בג elegans. בעוד אסטרטגיה זו עובדת היטב כאשר מספר קטן של גנים ממוקדים למציאה, מסכי האכלה בקנה מידה גדולה מראים את יעילות מציאה משתנה, אשר מגבילה את השירות שלהם. יש לנו דקונסטרוקציה פרוטוקולי מציאה RNAi שפורסמו בעבר ונמצאו כי המקור העיקרי למציאה מופחתת ניתן לייחס לאובדן של פלסמידים dsRNA-קידוד מהחיידקים האכילו את בעלי החיים. בהתבסס על תצפיות אלה, פיתחנו פרוטוקול האכלת dsRNA שמקטין באופן משמעותי או מבטל הפסד פלסמיד כדי להשיג מציאה תפוקה יעילה, גבוהה. אנו מראים כי פרוטוקול זה יהיה לייצר דפיקה חזקה, לשחזור למטה של ג elegans גנים בסוגי רקמות רבים, כוללים תאי עצב, וייאפשרו מציאה יעילה במסכים בקנה מידה גדולים. פרוטוקול זה משתמש האכלת dsRNA זמינה מסחריספרייה ומתארת ​​את כל צורך לשכפל את הספרייה ולבצע מסכי dsRNA הצעדים. הפרוטוקול אינו מחייב שימוש בכל ציוד מתוחכם, ולכן יכול להתבצע על ידי כל ג elegans מעבדה.

מבוא

מבחינה היסטורית, מסכי גנטיים בג elegans בוצעו על ידי טיפול בבעלי חיים עם mutagen כימי כגון methanesulfonate אתיל ליצור מוטציות אקראיות בתוך ה-DNA. צאצאים או grandprogeny של בעלי החיים mutagenized אז בודדו תערוכה שפנוטיפ חריג רצוי. המוטציה אחראית לגרימת פנוטיפ מכן זוהתה באמצעות תהליך מיפוי עתיר עבודה או על ידי רצף הגנום כולו של התולעת שעברה מוטציה. ישנם יתרונות רבים לביצוע מסכי mutagenesis הכימי כגון הם יוצרים נגעים קבועים בתוך הגנום התולעת שיכולה לגרום לשני פנוטיפים לזכות-of-פונקציה ואובדן של פונקציה, אבל תהליך המיפוי הוא איטי ויקר.

התערבות פעמיים תקוע RNA (dsRNAi) מספקת אמצעים חלופיים כדי לזהות גני המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים. בשיטה זו, dsRNA רצף הקידוד של גני אנדוגניים התאמה מוחדר לתולעת.DsRNA מעובד in vivo כדי ליצור RNAs (21-22 נוקלאוטיד) הקטן שישמש כמדריכים כדי למצוא להיקשר mRNAs אנדוגני ההתאמה, מיקוד אותם להשמדת ^1. הליך זה הוא מהיר יחסית, אבל בגלל dsRNA מטרות mRNA ולא ה-DNA, רק פנוטיפים ירידה של הפונקציה הם נצפו באמצעות גישה זו.

מבוא של dsRNAs לבעלי חיים יכול להיות מושגת על ידי הזרקה ישירה של dsRNA ^2, על ידי שריה בחי dsRNA ^3, או על ידי האכלת בעלי חיים חיידקים שמבטאים ⁴ dsRNA. כל אחת משיטות אספקה ​​אלה גורם לתופעות מציאה מערכתיות כמו רוב התאים של החיה להביע SID-1, ערוץ הטרנסממברני מסוגל לייבא dsRNA ^5. שימש במקור כגישת גנטיקה הפוכה למציאת הביטוי של גנים בודדים אחד בכל פעם, את הפיתוח של שתי ספריות האכלה עכשיו מאפשר מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. DsRNA הספריות, הזמינות מסחרי מכילות baהשיבוטים cterial המייצגים אף אחד 55% או 87% מכל ג elegans גנים ^{6, 7.}

למרבה הצער, מסכי האכלת dsRNAi בקנה מידה גדולה לעתים לגרום יעילות מציאה משתנה ^8-10. בעוד שהרמה המוחלטת של מציאה ידי RNAi אינה נמדדת בקלות, ביעילות מציאה מופחתת נצפתה במסכים בקנה מידה גדולים חייבת להיגרם על ידי mRNAs גן ספציפי שיורית שלברוח השפלה ידי RNAi. זה, בתורו, יכול להיות תוצאה ישירה של אובדן פלסמיד dsRNA מחיידקים נמאס לבעלי חיים במסכים אלה. תמיכה ברעיון הזה, חיות מאכילה את התערובות של חיידקים, בהם רק 50% מהחיידקים להביע dsRNAs נגד גן ממוקד, להראות מצטמצם באופן דרמטי (אם יש) השפעות מציאה כאשר לעומת השליטה האכיל חיות ^11. של מציאה גן במידה הופכת לדאגה קריטית בעת ביצוע מסכי dsRNAi כמו רוב הגנים בג elegans הוא haplosufficient וכך ביטוי גנים חייב להיות מופחת על ידי t 50% לפחותo לגרום לאובדן של פונקצית פנוטיפים ^12.

יש לנו בשימוש בפרוטוקולי האכלה שפורסם בעבר לבצע מסכי בקנה מידה גדולה ומצאנו את אותו אפקט מציאה משתנה שדווח על ידי אחרים ^8-10. בחיפוש אחר סיבות אפשריות, מצאנו כי כמעט 60% מהחיידקים האכילו את חיות במסך איבדו את הפלסמיד dsRNA. פיתחנו פרוטוקול כפילויות והקרנת ספרייה שמפחית באופן משמעותי או מבטל הפסד פלסמיד ומאוד משפר את יעילות מציאה. פרוטוקול זה מתאים לביצוע מסכי בקנה מידה גדולים בג elegans ויכול לשמש מסך אחד משתי ספריות dsRNA הזמינות המסחרית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מוצאים כי למעשה 100% מהחיידקים נמאס לבעלי חיים במסך לשמר את פלסמיד dsRNA הקידוד ולגרום לנשירה חזקה וpenetrant מאוד של פנוטיפים פונקציה בכל הרקמות שנבדקו.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות גנים הנדרשים לתהליכי מגוון ביולוגיים במגוון של סוגי רקמות. כבקרת איכות דרושה במהלך המסך, בעלי חיים ניזונים חיוביים ושליליים חיידק-להביע dsRNA שליטה להפגין תופעות RNAi ברקמת המטרה.

פרוטוקולי האכלה פורסמו אחרים לגדול חיידקי dsRNA להביע, בנוכחות או מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין 50 או 25 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ^8-10. אנחנו גילינו שהחיידקים גדלו באחד מהתנאים האלה מאבדים פלסמיד dsRNA בתדירות גבוהה. ואכן, מצאנו שגם כאשר חיידקים גדלים לילה בריכוזים גבוהים מאוד (עד 2 מ"ג / מיליליטר) לאמפיצילין יותר מ 50% מהחיידקים לא תכיל עוד פלסמיד. בעוד הצמיחה בcarbenicillin בדרך כלל הביאה בשייר גבוה יותר של פלסמיד, 25 מיקרוגרם / מיליליטר לא היה מספיק כדי למנוע אובדן פלסמיד. במקום זאת, מצאנו כי ריכוז carbenicillintions של 500 מיקרוגרם / מיליליטר נדרש למניעת אובדן פלסמיד במהלך צמיחה בתרבויות נוזלית וcarbenicillin 2 מ"ג / מיליליטר שנדרש למניעת אובדן פלסמיד כאשר חיידקים גודלו על מצעים אגר מוצקים.

בגלל שמירת פלסמיד היא קריטית להצלחה של מציאה, משמש רק carbenicillin כאשר חיידקי dsRNA בתרבית בפרוטוקול זה. יש לנו מותאם בקפידה את הריכוז של carbenicillin משמש בתרבויות התפתחות החיידקים שתוארו בפרוטוקול זה כדי להבטיח כי חיידקים שאינו מכילים פלסמיד לא גדלים בתרבויות אלה. עם זאת, כאמצעי בקרת איכות, אובדן פלסמיד נקבע במספר שלבים של הפרוטוקול. כדי להבטיח מציאה יעילה, יותר מ 80% מהחיידקים בכל אחד מהשלבים הבאים חייבים לכלול פלסמיד dsRNA. אם יותר מ20% מהחיידקים בכל צעד של הפרוטוקול איבדו את הפלסמיד dsRNA, לבדוק את איכות carbenicillin בשימוש. צריכה להיות מוכן Carbenicillin טרי היום בו שימוש. להכין carbenicillin הטרי ולחזור על התרבות.

1. כיצד לקבוע אובדן פלסמיד

1. הסר מדגם קטן של חיידקים (כפי שתואר על כל צעד רלוונטי) ולהוסיף אותו למים סטריליים 450 μl.
2. שימוש במדגם בדילול זה 100 μl ליצור 01:10 נוספים, 1:100, ו1:1,000 דילולים סדרתי באמצעות מים סטריליים, ערבוב את הפתרונות באופן יסודי בין הדילול.
3. מורחים של דילול כל 100 μl לצלחות LB וLB AMP ודגירת צלחות אלה לילה בשעה 37 ° C.
4. למחרת, לזהות את צלחת LB המכילה בין 100 500 מושבות חיידקים. לספור את מספר המושבות על צלחת ועל צלחת LB AMP המקבילה (המכיל את אותו הדילול של חיידקים).
5. לקבוע אובדן פלסמיד מספירת המושבה אלה. אחוזים מחיידקים שאינו מכילים פלסמיד, מחושב באמצעות משוואה 1, וצריך להיות פחות מ 15% ליעילים dsRNA להפיל.

"משוואת 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. מה שהופך את צלחות הספרייה כפולה

סקירה: ספריית dsRNA תגיע מהיצרן (OpenBiosystems) כ10,566 שיבוטים חיידקים ב96 צלחות היטב. אחסן את הצלחות מייד במקפיא -80 מעלות צלזיוס. צלחות הספרייה המקוריות תשוכפלנה וכל מסכים ההאכלה ישתמש בצלחות הספרייה הכפולות כמקור לחיידקים. מומלץ לאחסן את המקורי ולשכפל צלחות ספרייה במקפיאים נפרדים. על מנת להקל על הטיפול בו, לשכפל רק 10 לוחות ספרייה ליום מומלץ.

1. הסר את צלחת ספרייה (ים) ממקפיא -80 מעלות צלזיוס ולהסיר את חותם נייר הכסף ואילו תרבויות עדיין מוקפאות. החלפת מכסה הפלסטיק של צלחת הספרייה והניח את הצלחת על משטח ישר להפשיר על טמפרטורת חדר (כבר לא מ -30 דקות).

הערה: שמנו לב כי עמ משמעותיercentage של חיידקים נמצאו בכל טוב של צלחות ספרייה המקוריות אינו מכיל פלסמיד. עם זאת, מכיוון שהחיידקים בספרייה הם משאב יקר זה לא מומלץ לבדיקת אובדן פלסמיד בתרבויות הספרייה המקוריות.

2. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 150 μl של תקשורת כפילויות ספרייה היטב בכל צלחת כפולה תחתונה 96, גם דירה ריקה.
3. מערבבים את תרבויות חיידקי ספרייה מופשרת על ידי pipetting למעלה ולמטה פעמים 4:56 בעזרת פיפטה רבה מוגדרת 100 μl. ואז להסיר 10 μl של כל תרבות מעורבת ולהעביר לבארות המתאימות צלחת כפולה. תמשיך להעביר תרבויות מצלחת ספרייה לשכפל את צלחת ביצוע מסוים לשנות טיפים פיפטה לכל העברה.
4. לאחר כל התרבויות מצלחת ספרייה הועברו, לכסות את הבארות של צלחת ספרייה המקורית עם נייר כסף דבק חדש באמצעות רולר ברייר על מנת להבטיח חותם יסודי. החזר את מכסה הפלסטיק על הצלחת ולמקם אותו זקוף במקפיא -80 ° C עד התרבויות refrozen (לפחות 30 דקות). לאחר מכן להעביר את צלחות ספרייה המקוריות בחזרה לקופסא אחסון ספרייה.
5. Shake תרבויות צלחת ספרייה כפולות שטוחות ל8-10 שעות על 37 מעלות צלזיוס (450 סל"ד בmicroshaker, מסלול מ"מ 3).
6. לקבוע אובדן פלסמיד בכל צלחת ספרייה כפולה. מצאנו כי שיעור גבוה של החיידקים בבאר כל צלחת הספרייה המקורית לא מכיל פלסמיד dsRNA. חשוב שהחיידקים אלה אינם תורמים לצמיחה בספרייה כפולה. כדי למנוע הצמיחה שלהם, ריכוז גבוה של carbenicillin משמש בתקשורת כפילויות ספרייה (3 מ"ג / מיליליטר). לאחר התרבות של צלחת השכפול באמצעות תנאים אלה מצאו שיותר מ 90% מחיידקים מכילים פלסמיד dsRNA. הסר מדגם μl 10 מבאר תרבות נציג של כל צלחת כפולה ולהוסיף אותו למים סטריליים 450 μl. באמצעות דגימות מדוללים אלה, לקבוע אובדן פלסמיד כל ספרייה כפולהצלחת פי 1.1-1.4 צעדים. אם אובדן פלסמיד המשמעותי הוא ציין (> 20% מחיידקים בספרייה כפולה אינם מכילים פלסמיד), לסדר את התקשורת והתרבות באמצעות carbenicillin הטרי וחזור פרוטוקול מהשלב 2.1.
7. לאחר דגירה, הנח גיליון נייר דבק חדש ישירות על בארות הצלחת הכפולות, ולמקם מכסים בצלחת מעל נייר הכסף הזה. מקם את צלחות ספרייה הכפולות זקוף במקפיא -80 מעלות צלזיוס (לפחות 30 דקות) עד קפוא. הוקפאו פעם אחת, להעביר את הצלחות לקופסא אחסון ספרייה כפולה עבור אחסון לטווח ארוך.

3. יצירת עותקים זמניים של הספרייה בOmniplates

סקירה: כדי להתחיל להכין את האוכל למסך dsRNA, חיידקים מצלחות ספרייה כפולות מועברים לomniplates אגר מוצק וגדלו בין לילה. כדי למנוע אובדן פלסמיד על תקשורת מוצקה, omniplates מכיל carbenicillin ב2 מ"ג / מיליליטר. החיידקים על צלחות אלה יכולים לשמש לתקופהמשבוע אחד, ולא מראה שום ירידה בפלסמיד. אנחנו עדיין לא נבחנו לירידה בפלסמיד בחיידקים הגדלים על omniplates ארוך יותר משבוע אחד.

1. הסר את הצלחת כפולה ספרייה (ים) ממקפיא -80 מעלות צלזיוס ותוריד את חותם נייר הכסף ואילו התרבויות עדיין מוקפאות. לאחר הסרת נייר הכסף, להחליף את כיסוי הפלסטיק של הצלחת והניח את צלחת הספרייה כפולה על משטח ישר להפשיר בטמפרטורת חדר (כבר לא מ -30 דקות).
2. לעקר את משכפל סיכת Boekel 96. הסיכות של משכפל נקי יש לשטוף במים מזוקקים ולאחר מכן חיטוי לפני כל שימוש. כדי לעקר את המשכפל, למקם אותו לתוך אמבטיה אתנול (3/4 בעמוקים בצלחת פיירקס) ולאחר מכן לצרוב אתנול ציפוי הסיכות את השימוש במבער בונזן. לאפשר ללהבה לכבות ולאחר מכן לחזור.
3. הנח את המשכפל מעוקר לתוך הבארות של הצלחת כפולה מופשרת ולהשתמש בו כדי לעורר בעדינות התרבויות. נפחים קטנים של התרבות ידבק הסיכות של המשכפל.
4. מוציא בזהירות את המשכפל מהבארות של הצלחת כפולה ולמקם אותו (סיכות למטה) בעדינות על פני השטח של omniplate, נזהר שלא לנקב את פני השטח אגר. השאר את המשכפל על פני השטח של omniplate ל3-4 שניות, כך שחיידקים מהסיכות של המשכפל מועברים על גבי המשטח אגר.
5. הסר את המשכפל ולאפשר הנפח הקטן (2-3 μl) של תרבות חיידקים לספוג לתוך אגר. דגירה omniplates ההפוכה ל15-18 שעות ב37 ° C. omniplates אלה יכול לשמש למחרת בבוקר כדי לחסן 96 תרבויות גם נוזלית. לחלופין, ניתן לאחסן עד omniplates המכיל מושבות חיידקי לילה לשבעה ימים ב 4 ° C.
6. לצלחות כפולות נוספות העתק העברה, יש לשטוף את הטיפים משכפל עם מים סטריליים וחזור על תהליך העיקור על ידי הצבת המשכפל באתנול ובוערים את זה פעמיים, כמו בעבר. עיקור פעם אחת, המשכפל ניתן להשתמש בצלחת כפולה הבאה.

4. הכנה של חיידקים להאכלת תולעים

Overview: חיידקים לתולעי האכלה ערוכים לתרבויות 1 מיליליטר נוזל (בפורמט גם 96) באמצעות חיידקים מomniplates. תרבויות נוזלי אלה גדלו בין לילה ליצירת תרבויות חיידקי nonlogarithmic רוויות. גידול בין לילה מבטיח כי כל התרבויות יכילו ריכוזים דומים של חיידקים ולכן כל התולעים יהיו נמאס את אותה הכמות של מזון. אין אובדן פלסמיד במהלך צמיחה זו צריך להיות שנצפה.

1. לוותר על 1 מיליליטר של תקשורת צמיחת חיידקים לתוך באר כל 2 מיליליטר 96 גם צלחת עמוקה היטב באמצעות pipettor חוזר ו50 מיליליטר Combitip.
2. הנח משכפל סטרילי על פני השטח של omniplates המכיל מושבות חיידקים שנוצרו בשלבים 3.1-3.6 ביצוע מסוימים שפינים נמצאים בקשר עם כל אחת מ96 מושבות החיידקים.
3. להעביר בזהירות את המשכפל מפני שטח של omniplate לתוך הצלחת העמוקה גם ביצוע מסוים שהפינים לא לגרד את דפנות הבארות עמוקות עד ששקועים בתקשורת צמיחה. הזז אתמשכפל באיטיות בתנועת כיכר הבאה הקיר הפנימי של הצלחת גם העמוקה כדי לסלק את החיידקים לתוך תקשורת הצמיחה. היזהר שלא להתיז וצלב לזהם בארות.
4. בארות שליטה: לכל צלחת תרבות 96 היטב גם עמוקים להוסיף חיידקי dsRNA-להביע לגם אחד שישמש כביקורת חיובית לפנוטיפ מציאה ציפה ולהוסיף חיידקים המכילים וקטור ריק dsRNA (pL4440) כביקורת שלילית למשנהו גם . אנחנו מחדש פס שליטת חיידקי פעם בשבוע על צלחות LB המכילים טטרציקלין (15 מיקרוגרם / מיליליטר) וcarbenicillin (2 מ"ג / מיליליטר) כך שהחיידקים יישארו טריים ולשמור על פלסמיד-להביע dsRNA.
5. באמצעות inoculating לולאת סטרילי להסיר מושבה מבודדת היטב אחת מצלחת השליטה (על אותה הכמות של חיידקים המועברים על ידי המשכפל) ולחסן גם ריק בצלחת התרבות גם העמוקה. להקליט את המיקום של הבאר, כי כבר מחוסנת. לחלופין, את הלולאה עם ג חיידקיםיועבר לצינור Eppendorf המכיל 250 תקשורת צמיחת μl, vortexed ולאחר מכן נעשה שימוש כדי לחסן כמה בארות.
6. נער את הצלחות עמוקות היטב במצב שטוח ב650 סל"ד בmicroshaker (מסלול: 3 מ"מ) על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. התרבויות יהיו רוויות בבוקר שלמחרת. בלי קשר, את הריכוז של carbenicillin שימוש בתרבויות אלה צריך למנוע אובדן פלסמיד.
7. לקבוע אובדן פלסמיד ב1 תרבויות מיליליטר הלילה. התרבויות ישמשו באופן ישיר כדי להאכיל את התולעים למסך. חשוב שיותר מ 80% מהחיידקים בכל תרבות מכילים פלסמיד dsRNA. לקבוע אובדן פלסמיד לשתי תרבויות מייצגות פי 1.1-1.4 צעדים. ציפייה: יותר מ 90% מחיידקים בכל תרבות יכילו פלסמיד dsRNA. אנחנו מעולם לא נצפו ירידה בפלסמיד המשמעותי בתרבויות הלילה אלה גם כאשר גדלו לרוויה. עם זאת, אם הירידה בפלסמיד המשמעותי הוא ציין (> 20%), מהדורה מחודשת תקשורת הצמיחה באמצעות carbenicillin ונציג טרייםלאכול פרוטוקול מהשלב 4.1. ניתן להפעילו מחדש מomniplates מקורי תרבויות עוד omniplates הם פחות מ 1-2 שבועות.
8. ברגע שהשתמש כדי להתחיל 1 מיליליטר תרבויות, omniplates מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד למסך הושלם והוא יכול לשמש כמקור למזון להתחיל כל תרבויות חוזרת.
9. לאחר דגירה הלילה של תרבויות, להשתמש פיפטה רבה 12 ערוצים להסיר 150 μl של תרבית חיידקים מהצלחת גם העמוקה ולהוציא על פני השטח של צלחת ההאכלה. חשוב לא כדי לחדור את פני השטח של אגר במהלך ההעברה כתולעים להתחפר ולא להאכיל בחיידקי dsRNA-להביע. ניתן לבצע העברה ארבע בארות בכל פעם (איור 1). כדי לעשות זאת, הנח את הטיפים פיפטה על כל ערוץ שלישי של פיפטה הרבה (כמו שיש רק 4 בארות לשורה בצלחת ההאכלה). אחרי כל סט של 4 בארות מועבר, לשנות לטיפי פיפטה חדשים, סטרילי. כל צלחת 96 תרבות העמוקה היטב תדרוש 96 טיפיםלהעברה לשמונה צלחות האכלה 12 היטב.
10. חנות זורעים צלחות זקופות בלילה החשוך ולכן חיידקים יכולים לספוג לתוך אגר.

5. יצירת L1 נעצר ג elegans זחלים

סקירה: זחלים נעצרו-L1 נמצאים בשימוש כדי להתחיל תרבויות תולעת מסונכרנות על צלחות האכלת dsRNA. זחלים אלה שנוצרו על ידי הלבנת אוכלוסיות של מבוגרים הרה להולדת לבודד את ביצים בריאים ולאחר מכן מאפשר לביצים לבקוע בתקשורת ה-S-שלמה בלי אוכל. בהיעדר מזון זחלי L1 בקעו יעצרו את הפיתוח, שהניבו אוכלוסייה סינכרוני של זחלי L1. במהלך המסך, להכין זחלים-נעצר L1 טריים כל שבוע כמו החיות מורעבות אלה הופכים חולים לאורך זמן וחייבות להיות מושלכות. הבחירה של רקע הגנטי של בעלי החיים המשמשים במתח הזנת dsRNA יכולה להשתנות בהתאם ליישום, למסכים עצביים בארי-1; מוטציות lin-15B מומלצות.

1. פיק 10-20 L4 להrvae לשש צלחות נפרדות NGM המכילות דשא של OP50 חיידקים ולהמתין 6-7 ימים עד הצלחות מכיל טריה הטילו ביצים רבות ומבוגרים הרה.
2. הסר את החיות וביצים מהצלחות על ידי הוספת 3 מיליליטר של מים על פני השטח של כל צלחת ולהשתמש באצבע עטויה בכפפה כדי לסלק את הביצים, חיידקים, ובעלי חיים מאת פני השטח של כל צלחת למים. הקפד לכסות את כל האזורים בצלחת, תשומת לב מיוחדת לדשא בקטריאלי. הסר את המים, חיידקים, התולעים וביצים מכל צלחת באמצעות פיפטה זכוכית ולהעביר לצינור אחד סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
3. להוסיף עוד 3 מיליליטר של מים על פני השטח של כל צלחת, pipetting למעלה ולמטה על פני השטח כדי להסיר את כל חיידקים, תולעים וביצים הנותרים. הוספת הנפח הזה לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
4. ספין צינור חרוטי ב1,500 סל"ד דקות 1 בצנטריפוגה בראש הטבלה. תולעים וביצים צריכים גלולה לחלק התחתון של הצינור והחיידקים יישארו על תנאי. בזהירות לשאוב אבל כל 4 מיליליטרשל הנוזל מהצינור להיות בטוח, כדי למנוע את התולעים וביצי pelleted.
5. Resuspend את כדור התולעת במים שיורית ולהעביר אל צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי באמצעות פיפטה מזכוכית. תביא את הנפח עד 10 מיליליטר עם מים סטריליים.
6. ספין ב1,500 סל"ד דקות 1 כמו קודם. לשאוב supernatant עוזב 200 מים μl כדי לא להפריע גלולה תולעת / הביצה.
7. הוסף 10 מיליליטר מים לחרוטים לשטוף את התולעים וביצים ולסובב כמו קודם להסיר את חיידקים נוספים.

שים לב: בשלבים 5.8-5.11 תולעים וביצים חשופות לפתרון אקונומיקה. אקונומיקה תהרוס תולעים ולהשאיר את הביצים יחסית ללא פגע. עם זאת, אם ביצים נשארות בתמיסת אקונומיקה יותר מדי זמן, הם גם יושמדו. להגדיר טיימר כאשר אקונומיקה מתווספת בשלב 5.8 כדי להיות בטוח שביצים לא נשארים חשופות לאקונומיקה ליותר מ 10 דקות.

8. הסר את כל אבל 200 μl של supernatant, שוב הימנעות גלולה, לאחר מכן להוסיף 10פתרון מיליליטר אקונומיקה ולהתחיל טיימר.
9. דגירה תולעים וביצים בתמיסת אקונומיקה ל3-4 דקות, מדי פעם לערבב על ידי היפוך. ואז להסתובב ב1,500 סל"ד 45 שניות בצנטריפוגה שולחן. חפש גלולה בחלק התחתון של הצינור, זה צריך להיות קטן יותר וקומפקטי יותר מהגלולה המקורית ועלול לקחת על מראה צהוב.
10. לשאוב את פתרון אקונומיקה עוזב 200 μl מאחורי כדי שלא להפריע גלולה.
11. הוסף עוד פתרון אקונומיקה טרי 10 מ"ל ולהפוך כמו קודם. כאשר שעון העצר קורא 10 דקות, לסובב שוב ולשאוב את פתרון אקונומיקה, והשאיר 200 μl מאחורי ובמהירות להוסיף 10 מיליליטר מים סטריליים. לבחון את הפתרון תחת מיקרוסקופ לנתח. הזחלים ורבים מהמבוגרים צריכים מומסים בתמיסת אקונומיקה, ומשאירים בעיקר ביצים מאחור.
12. ספין כמו קודם ל45 שניות, ושוב לשאוב supernatant כדי לא להפריע גלולה. גלולה זו צריכה להכיל בעיקר ביצים ותהיה מאוד רופף.
13. הוספת anotהמים מיליליטרה 10, להפוך לערבב, ספין ולשאוב משאיר מעט מים מאחור. חשוב להסיר כמה שיותר פתרון אקונומיקה ככל האפשר.
14. הוסף 4 מיליליטר מדיה S-מלא לצינור חרוטי, resuspend את הביצים ולהעביר למיליליטר בקבוק Erlenmeyer סטרילי 100. מניחים את הבקבוק בחממה 20 מעלות צלזיוס בסט שייקר נע מהר מספיק כדי לגרום לתכולת הבקבוק למערבולת. זה יספק אוורור מספיק כדי לתמוך זחלי L1 כאשר הם בוקעים. בתוך 15 שעות כל הביצים בקעו צריך לייצר אוכלוסייה סינכרוני של זחלים נעצרו L1.

זחלי L1 נעצרו צריכים להיעשות טריים כל שבוע במסך. ברגע שאת המנה הראשונה כבר נעשתה, ניתן להתחיל קבוצות שלאחר מכן על ידי הוספת 500 זחלים נעצרו L1 (מ אצווה של השבוע שעבר) לכל אחת מארבע צלחות סטנדרטיות, זורעים 6 סנטימטר (המכילות 100 תרבות לילה μl של OP50), וטופחו על 20 ° C למשך 4 ימים. ביום הרביעי הצלחות צריכה להכילניתן מולבנות ביצים רבות ומבוגרים הרה להולדת ולהכין ביצים טריות לזחלי L1 יותר מסונכרנים.

6. העברת זחלי L1 נעצרו על צלחות האכלה

סקירה: כדי לבצע מסך dsRNA, 20-30 זחלים נעצרו L1 מועברים לצלחות האכלת dsRNA. השפעות מציאה מוקדמת כגון מעצר או הקטלניות זחל יקויימו אחרי בעלי החיים נמאס על חיידקי dsRNA-להביע ל2-3 ימים. בהתאם למסך שנערך, פנוטיפים רצויים אפשר לראות גם בבעלי החיים המקוריים שהונחו על צלחת ההאכלה (בעלי החיים P0) או בצאצאים (החיות F1) שלהם. המצגת של הפנוטיפ תהיה תלויה במספר משתנה ובי perdurance של החלבון מקודד על ידי גן הביטוי שהוא הפיל את והזמן במהלך התפתחות בהם נדרש הגן של עניין. החל תרבויות האכלת dsRNA רק עם 20-30 בעלי חיים צריך לאפשר תצפית של פנוטיפים שני P0 וF1 לפניimals למצות את מקור מזון.

כדי להעביר בקלות 20-30 חיות לצלחות האכלה, לקבוע תחילה את הריכוז של L1 נעצר בעלי חיים בתרבות L1 נעצרה.

1. מערבבים את בקבוק Erlenmeyer מכיל את זחלי L1 נעצרו להפיץ את בעלי החיים.
2. הסרת aliquot 10 μl ומקום נפתח חכם על גבי צלחת NGM 6 סנטימטר unseeded ב4-5 טיפות למטה מרכז הצלחת ולוודא כי כל אמצעי התקשורת הוא גורש מפיפטה.
3. בעזרת הקצה של קצה פיפטה להפיץ את נקודות השעיה תולעת יוצר קו רצוף אחת של נוזל החובק את הקוטר של הצלחת.
4. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור את כל בעלי החיים שמתחילים בקצה אחד של הקו של נוזל וממשיכים לקצה השני לפני שהנוזל נספג לתוך הצלחת ובעלי החיים להתפזר. זה עשוי לדרוש מיקוד מחודש מתמיד של ההיקף לנתח כדי להיות בטוח שאין חיות הם החמיצו.
5. חזור על פעולה זו במשך שלוש נפרד 10 μlaliquots ומחשבים את הממוצע של שלושה מספרים כדי לקבוע את המספר הממוצע של תולעים לכל μl של השעיה תולעת ולהקליט מספר זה ישירות על בקבוק Erlenmeyer.

7. בגין מסך ההאכלה

סקירה: כדי להתחיל את מסך dsRNA, 20-30 זחלי L1 נעצרו מתווספים היטב בכל 12 גם צלחות האכלה המכילות דשא דק של חיידקי dsRNA-להביע. צלחות האכלה מכילות מדיה צמיחה נמטודות סטנדרטית (NGM) והם השלימו עם 500 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin (כדי למנוע אובדן פלסמיד) ו1 מ"מ IPTG (לגרום ביטוי dsRNA). בעלי חיים מותר להאכיל ולפתח במשך כמה ימים ב20 ° C. שני משטרי האכלה אופייניים לבעלי חיים הם 3 ימים בעת ביצוע מסך P0 ו6-7 ימים בעת ביצוע מסך F1. משך ההאכלה, לעומת זאת, יכול להיות מגוון בהתאם לפנוטיפים מסוימים ביקשו במסך.

1. השתמש בהשעיה של זחלים נעצרו L1 ומים סטריליים כדי להכין כל כךlution המכיל 2,000 מיליליטר / תולעים. כל צלחת האכלה 12 גם תדרוש 120 μl של השעיה בתולעת זו. מערבבים היטב כדי להבטיח חלוקה שווה של בעלי חיים ולהעביר את בעלי החיים למאגר סטרילי עבור pipetting.
2. באמצעות פיפטה הרבה להגדיר עם טיפים בכל עמדה שלישית (ראה איור 1) העברה 10 μl של פתרון התולעת ישירות על גבי דשא החיידקים של צלחות ההאכלה. הקפד לא לחדור את פני השטח של אגר, כמו תולעים להתחפר לתוך אגר ולא להאכיל בחיידקי dsRNA-להביע.
3. רמיקס פתרון התולעת במאגר (בעדינות על ידי משכשך את זה) אחרי כל שתי שורות של צלחות האכלה, תולעים ליישב במהירות. המשך מחלק ההשעיה התולעת עד שיש את כל צלחות האכלת תולעים. נבחן כמה בארות מוקדמות על פי ההיקף לנתח על מנת להבטיח שכל אחד גם הוא מקבל 20-30 תולעים.
4. צלחות חנות זקופות בתיבת humidified בחממה 20 מעלות צלזיוס. למחרת, לאחר ווההשעיה rm ספגה לתוך הצלחת, להפוך הצלחות ולחזור ללחות ב20 ° C. בעלי חיים על צלחות אלה יכולים להיות שנצפו לאחר 3 ימים (לפנוטיפים P0) ושוב לאחר 6 ימים (לפנוטיפים F1).

שים לב: החיידקים שנשארים על צלחת ההאכלה לאחר 7 ימים של צמיחת תולעת נבדקו על אובדן פלסמיד וכמעט 100% שמר פלסמיד dsRNA.

תוצאות

פנוטיפים מציאה P0 יתחילו להופיע אחרי 2-3 ימים של האכלת בעלי חיים dsRNA להביע חיידקים. כמה פנוטיפים מוקדם כוללים מעצר והקטלניות זחל ויש לשים לב ב2-3% מכלל בארות ההאכלה. אותם פנוטיפים יהיו גם נצפו בבעלי החיים דור F1. הנוכחות של ביצי F1 שאינן מצליחין לבקוע היא עוד פנוטיפ F1 משותף, ויחד, שלושת פנוטיפים אלה יקויימו בכמעט 10% מכלל הבארות במסכי F1.

אנחנו השתמשנו בפרוטוקול המתואר כאן לבחון השפעות מציאה במשך כמה גנים המתב...

דיון

יש לנו תיארתי פרוטוקול שמשתמש בספריית האכלת dsRNA זמינה מסחרי כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדולה בג elegans. אנו מספקים את כל ההוראות כדי לשכפל את הספרייה ולהשתמש בו ביעילות. אנו מראים כי גישה זו היא מסוגלת לזהות גני המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים ברקמות שונות של בעלי החיים. בעוד פנוטיפים שאנו מתארים כאן הם לצפייה (UNC, EGL, וDpy) בקלות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לחפש גנים הנדרשים לכמעט כל תהליך ביולוגי. לדוגמא, יש לנו בשימוש בפרוטוקול זה כדי לזהות גנים הנדרשים להעבר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>מגיב / חומר< / חזק>
96 בארות פלקון צלחת תחתונה שטוחה	פישר סיינטיפיק	353072
רדיד דבק	ארה"ב סיינטיפיק	2923-0100
Nunc omniplate	פישר סיינטיפיק	267060
2.0 מ"ל עמוק 96 בארות פוליפרופילן מאסטרבלוק	ארה"ב סיינטיפיק	5678-0285	מכסים הניתנים לחיטוי
לצלחות באר עמוקות	ארה"ב סיינטיפיק	5665-6101
50 מ"ל קומביטיפים	ארה"ב סיינטיפיק	4796-5000	מאגר עטוף בנפרד
	ארה"ב סיינטיפיק	2977-8500	הניתנות לחיטוי
	ארה"ב Scientific	CC7682-7512	ספריית
הזנת dsRNA	OpenBiosystems	חנות	RCE1181 -80 & deg; C
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
טטרציקלין	פישר סיינטיפיק	BP912-100
קרבניצילין			אפשר 2-4 שבועות למשלוח www.biochemicaldirect.com
בקטריולגי אגר אולטרה-טהור דרגה A	Affymetrix	10906	עבור לוחות תולעת<
Brayer	roller USA Scientific	9127-2940
B– משכפל קל 96 פינים	פישר סיינטיפיק	05-450-9
מיקרושייקר	תומס סיינטיפיק	1231A93	3 מ"מ מסלול
12 ערוצים רב ערוצי פיפט (0.5-10 μ l)	USA Scientific	7112-0510
פיפט רב-ערוצי 12 ערוצים (30-300 μ l)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus פיפטור ידני	USA Scientific	4026-0201