הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50716

⸱

14 בנובמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הפונקציה של תאי עצב של יונקים בוגרים שנולדו נשארת אזור פעיל של חקירה. קרינה מייננת מעכבת את לידתו של נוירונים חדשים. באמצעות הקרנה המונחה טומוגרפיה מחשב מוקד (CFIR), מיקוד אנטומיים תלת ממדי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים.

תקציר

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהווה אתגר משמעותי. יש גישות לעכב neurogenesis למבוגרים באמצעות משלוח נגיפי פולשניים או בעלי חיים מהונדסים בלבול פוטנציאלי שהופכים את הפרשנות של תוצאות מהמחקרים אלה קשים. הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לחקור noninvasively הפונקציה של קבוצות נבחרות של מבוגר יליד נוירונים באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת המוקדים מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת מיקוד של אזורים עצביים ספציפיים. על מנת להאיר את התפקיד הפונקציונלי הפוטנציאלי שנוירוגנזה ההיפותלמוס מבוגר משחקת בוויסות של תהליכים פיסיולוגיים, פיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של מבוגר יליד נוירונים ברוממות החציוני ההיפותלמוס באופן סלקטיבי. אנו מתארים שיטה לomputer C-מודרך טומוגרפיהמשלוח ו ocal ir קרינה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מדויקת מיקוד בבעלי חיים קטנים. CFIR משתמש בהדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של מינון הקרינה, מצמצם את החשיפה לקרינה לאזורים במוח nontargeted, ומאפשר להפצת מינון קונפורמי עם גבולות חדים קרן. פרוטוקול זה מאפשר לאדם לשאול שאלות לגבי תפקידו של מבוגר יליד נוירונים, אבל גם פותח אזורים לשאלות בתחומי radiobiology, ביולוגיה של גידול, ואימונולוגיה. הכלים רדיולוגי אלה יקלו את התרגום של תגליות בספסל לצד המיטה.

מבוא

תגליות שנעשו לאחרונה הראו כי המוח של היונקים הבוגרים יכול לעבור במידה יוצאת דופן של גמישות. מבוגר יליד נוירונים נוצרים לאורך הבגרות בנישות מיוחדות של המוח של היונקים 1. מהו תפקידיו של מבוגר יליד נוירונים אלה? ויותר מכך, אין הם ממלאים תפקיד בפיזיולוגיה והתנהגות? מחקרים בנושא זה התמקדו באופן מסורתי באזור subventricular של החדרים לרוחב ואזור subgranular של ההיפוקמפוס, עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מתאפיינים נוירוגנזה באזורים אחרים במוח כגון ההיפותלמוס היונקים 2. נוירוגנזה כבר דווחה שבלאחר הלידה וההיפותלמוס המבוגר 2-10, ואת הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס יילוד אלה נותרת אזור פעיל של חקירה.

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהוות אתגר משמעותי עבור תחום מדעי המוח באופן כללי. עיכוב סלקטיבי של מפרטific אוכלוסיות עצביות נותרת מוגבלות על ידי חוסר של סמנים מולקולריים זמינים שהנם ייחודיים לאוכלוסיות עצביות אחת 11. לפיכך, מחיקה סלקטיבית של מבוגר יליד נוירונים מאבות העצביים אלה באמצעות מיקוד גנטי עדיין קשה. כמו כן, משלוח ויראלי למקד מבוגר יליד נוירונים סובל ממשתנים מבלבלים פוטנציאליים כגון החדרת פציעה ודלקת לתוך הסביבה 12.

הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לעקוף את הבלבול אלה ולחקור את השאלות האלה באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת בשיטה לא פולשנית למקד אוכלוסיות עצביות 13-15. לאחרונה, תיארתי את האזור נבטי של רוממות היונקים ההיפותלמוס החציוני (ME) שכינינו את אזור שגשוג ההיפותלמוס (HPZ) 2 . מצאנו כי כאשר עכברי נקבה בוגרים צעירים קיבלו תזונה עתירה שומן (HFD), רמות הנוירוגנזה בעכברים שהוזנו-HFD היו גבוהות משמעותי מהאוכל שלהם הנורמלי (NC) בקרות האכילו בי האזור הזה 2. כדי לבדוק אם neurogenesis למבוגרים בתוך ME ההיפותלמוס מווסת את חילוף החומרים ומשקל, שבקשנו לשבש את התהליך הזה. רוממות החציוני היא מבנה חד צדדי קטן בבסיס של החדר השלישי שממנו ההורמונים רגולטוריים הם שוחררו. על מנת לעכב את התפשטות ונוירוגנזה הבאה מבלי לשנות את הפונקציות פיסיולוגיות האחרות של האזור הזה במוח, שפיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של נוירונים בוגרים שזה עתה נולדו ברוממות החציוני ההיפותלמוס 2 באופן סלקטיבי.

מספר הקבוצות מועסק קרינה לדכא נוירוגנזה באזורים הקנונית 14-28. עם זאת, גישות רדיולוגי קודמות בדרך כלל ממוקדות שטחים גדולים, או often שלא במתכוון גם ממוקד אזורים במוח שבו מספר רב של נוירוגנזה כבר דיווחו, ולכן קשה לשייך באופן חד משמעי כל פגמים התנהגותיים שנצפו עם מומים באוכלוסיות עצביות ספציפיות. היכולת להקרנה ממוקדת יותר מסופקת על ידי פלטפורמות רדיולוגי המשלבות הדמיה מודרכת טומוגרפיה omputer ג עם הקרינה ו ocal ir קרן מסירה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מיקוד 29-36. קורות קרינה קטנות כמו 0.5 מ"מ קוטר זמינות למקד אוכלוסיות עצביות ספציפיות 35. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו למקד את ME ההיפותלמוס ולעצור את ההתפשטות ולחסום נוירוגנזה בבעלי חיים קטנים. בעקבות טיפול רדיולוגי על אוכלוסיות אב אלה, ניתן לבצע בדיקות פיסיולוגיות והתנהגותיים כדי להאיר את פונקצית הפוטנציאל של תאי בוגרים שנולדו. מיקוד הפוקוס הוא חשוב במיוחד עבור היישום שלנו מאזבלוטת יותרת המוח ממוקמת קרובה לרוממות החציוני ההיפותלמוס; הקרנה של יותרת המוח עשויה להשפיע על תפקוד הורמונלי ובהמשך לבלבל את התוצאות.

הבסיס הביולוגי לדיכוי ההקרנה הבאה נוירוגנזה עדיין אינו ברור. מחקרי קרינה קודמים הסתמכו על קורות שטח גדולות, והגיעו למסקנה כי דיכוי נוירוגנזה מתווך דרך תגובה דלקתית 14, 37. ככזה הוא לא ברור אם הקרנת מוקד מאוד יכולה לדכא נוירוגנזה, שכן הוא אינו מעורר תגובה דלקתית משמעותית. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה על ידי הקבוצה של האזור העצבי הקלאסי בהיפוקמפוס שלנו הוכיחו כי הקרנת מוקד מאוד עם מינון של 10 Gy יכולה לדכא נוירוגנזה לפחות 4 שבועות לאחר הקרנת 35.

כדי לחקור את הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס בוגרים שנולדו ברוממות החציוני, אנו משתמשים ד קרינת דיוקevice מסוגל לספק הדמיה CT בשילוב עם קורות קרינה בקוטר קטן כדי לעכב ME נוירוגנזה. שימוש בשפופרת רנטגן מצורף gantry שמסתובבת על פני טווח של 360 °, שאנו מספקים אלומת קרינת מיקרו קשת קורה עם השימוש בשלב דגימת רובוט מבוקר המאפשר סיבוב של נושא בעלי החיים במהלך טיפול בקרינה (איור 1) . גלאי רנטגן ברזולוציה גבוהה המשמשים לרכישת תמונות כאשר gantry הוא במצב האופקי 33. לצורך המחקר, תמונות CT שוחזרו בגודל voxel איזוטרופיים של 0.20 מ"מ. ההדמיה CT על הלוח אפשרה זיהוי של יעד בעוד החיה נמצאת במצב הטיפול. היעד מקומי באמצעות תוכנת CT הניווט מתכנן במינון, שנכללה עם פלטפורמת רדיולוגי זמינה המסחרית שלנו. לאחר האיתור את ההחזר על ההשקעה שלנו על ידי הדמיה של CT, בעלי החיים הועברו לתפקיד על ידי הטיפול המתאים בשלב הדגימה רובוטית שיש לו ארבע מעלותריס של חופש (X, Y, Z, θ). באמצעות שילוב של זוויות פיגום ושלב רובוט, קורות יכולות להיות מועברות כמעט מכל כיוון ביחס לבעלי החיים, וטיפולים כמו קשת stereotactic אפשריים 29. לבדיקות הדמיה אחרות אלה וכל, העכברים הוצבו במכשיר קיבוע המאפשר אספקה ​​של גז isoflurane הרדמה תוך הגבלת תנועה. מיטת חוסר התנועה היא CT תואם, ומתחברת לשלב הדגימה רובוטית 34.

אנו מצפים כי CFIR יספק התקדמות רעיונית במספר תחומי מחקר. למרות שאנו משתמשים במיקוד לפי רדיולוגי של רוממות החציוני ההיפותלמוס כהוכחה לעיקרון של טכניקה זו, CFIR יכול לשמש היעד כל אזור של הגוף של כל אורגניזם מודל קטן באופן עקרוני. בתחום מדעי המוח, למשל, אנו רואים בטכניקה זו יכולה לשמש כדי להעריך את תפקודן של אוכלוסיות אב פעיל שגשוג שהוצע לExis לא באיברי circumventricular אחרים, כגון postrema האזור 38, 39, איבר subfornical 40, ובלוטת יותרת המוח 41. מחלוקות ארוכי שנים בנוגע לתפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים וזיהוי תפקיד סיבתי בהתנהגות יכולות גם עכשיו יהיו טובות יותר לטפל. בציפור שיר, טכניקה זו עשויה להתייחס לתפקיד של neurogenesis המבוגר בשמירה על ההתנהגות החזקה ועונתית של ציוץ ציפור 42, שכבר הקשו על ידי היכולת לעכב באופן סלקטיבי נוירוגנזה באזורים מסוימים במוח. הבנת מודל התנהגותי חזק זה עשויה לשפוך תובנה חדשה את התפקיד של neurogenesis למבוגרים בויסות התנהגויות מיניים דימורפית אחרות. לחלופין, בתחום מטבולים, CFIR עשוי לשמש כדי לחקור היבטים של התפקיד של התפשטות הפטוציט ותפקידה בחילוף חומרים ומאזן אנרגיה. האפשרות להתקדמות רעיונית בתחומי מחקר רבים היא משופרת על ידי ההקדמה של טכניקה זו.

= "Jove_content"> במאמר זה, אנחנו מדגימים את היכולות של CFIR לאנטומיים דיוק מיקוד של אלומת קרינת מוקד. למרות שאנחנו בהתחלה פיתחנו פלטפורמה זו קרינת חיה קטנה מחקר (SARRP) ללימודים שלנו, מכשירים דומים אחרים זמינים באופן מסחרי, שיכול להשיג הקרנה דומה מודרך CT מוקד 43, 44 עכשיו. לפיכך, אנו מכלילים פרוטוקול CFIR זה בצעדים הנדרשים לכל פלטפורמות המחקר ולא את אלה ספציפיים לSARRP. היתרונות של CFIR פני גישות רדיולוגי קודמות לעכב נוירוגנזה הם כי טכניקה זו מאפשרת הדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של המינון, מינון קונפורמי ממזער את החשיפה לאזורים במוח nontargeted, והגיאומטריה קורה דיוק גבוה מאפשרת להפצת מינון קונפורמי עם גבולות קורה חדים. אנחנו מתארים כיצד להשתמש דמיון מודרך-CT למקד את המינון לאזור אנטומי ספציפי, ועל כך, איך לדמיין את הקרינהמינון הפצה ישירות ברקמות באמצעות מכתים immunohistochemical לγ-H2AX, סמן של הפסקות גדילי הדנ"א כפולות 35, 45-48. השימוש בגישה זו להקרנה סלקטיבית של נישות עצביות עשויה להיות השלכות משמעותיות בחושף את התפקיד הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים חדש על פיזיולוגיה ומחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שימוש בבעלי חיים

לקבל אישור מועדת טיפול בבעלי חיים והשימוש מוסדי לפרוטוקולי טיפול ושימוש סטנדרטיים. הפרוטוקול הנוכחי פותח ללימודי הקרנת מוקד בעכברים בוגרים ישנים 5.5-10 שבוע C57BL6 / J, כפי שתואר לעיל (איור 2) 2. עם זאת, בגילים אחרים וגם מינים של בעלי חיים קטנים (חולדות, אוגרים, סנאי קרקע, וכו ') יכולים לשמש, ובלבד שפרוטוקולי הרדמה יעילים ואטלס התייחסות רדיוגרפי המאפשר זיהוי של האזור של עניין (ROI) הנן זמינים.

1. כיול של פלטפורמה רדיולוגית מודרכת-CT

לבצע כיולים מבוססי סרט למינון קרינה על פלטפורמת רדיולוגי מראש לכל גודל collimator וסוג של מסנן שפופרת רנטגן בשימוש. על מנת למקד את קרן קשת של קרינה באתר היעד הרצוי, השתמש בavailabl 49 תוכנת מינון תכנון קרינהדואר ברוב פלטפורמות קרינה מסחריות לחישוב זמן אספקה ​​הנדרש המבוסס על מינון הקרינה, את עומק את האזור של העניין (ROI) המבוסס על סריקות CT של העכבר, ומהירות הסיבוב של הפלטפורמה רובוטית; פרטים בעניין זה נותרים בחוץ של פרוטוקול זה כפי שהם שונים בין פלטפורמות קרינה. לצורך המחשת ההיפותלמוס ventrobasal 2 (איור 3) עם ההדמיה CT, להפעיל את שפופרת רנטגן עם כתם 0.4 מ"מ מוקד ואנרגיה אלומת 100 kVp עם 1 מ"מ סינון אל. עבור הקרנת מוקד של HPZ, להפעיל את שפופרת רנטגן ב225 kVp, 13 mA, ובמקום מוקד 1 מ"מ עם סינון של 0.15 מ"מ Cu, כדי לספק 10 Gy של קרינה בעומק רקמה של 0.6 סנטימטר מעל טיפול זמן של 4.6 דקות. מיקוד בין ROIs שונה ידרוש חישוב פרמטרים שונים.

  1. אם לומד את ההשפעות של דיאטה עתירה שומן על נוירוגנזה ברוממות החציוני כפי שתואר 2 בעבר, לקבל נשי C57B ארבעה שבועות בןעכברי L6 / י ממעבדות ג'קסון מאוס, ובית ארבעה עכברים בכל כלוב. החלף מזון מאוכל רגיל לתזונה עתירה שומן בחמישה שבועות. לאפשר עכברים להסתגל לדיור ומזון חדשים. בצע טיפול CFIR ב5.5 שבועות ישנים. תחבורה מכפיפה לחדר הניתוח הכולל את פלטפורמת רדיולוגי. למזער את רמות לחץ בעת ההעברה. הכן את חדר הרדמה גז isoflurane. לאחר מכן, להוסיף עכבר אחת לחדר. במקביל, להכין כרית חימום (הגדרה נמוכה) שללאחר טיפול.
  2. ברגע שהעכבר נמצא תחת ואינו מגיב לדחיסת הרגל-pad, להביא את הנושא לפלטפורמת רדיולוגי ומניח על מיטת הקיבוע של השלב רובוטית. הנח את פיו של הנושא לתוך כוס ההרדמה האף קונוס, ושיניים לשומר הביס (1D איור). שכב עכבר על מיטת חוסר התנועה ולבדוק כדי לראות אם הוא ממשיך לשמור על חוסר תגובה. אם כן, קלטת את העכבר למיטה עם קלטת גזה. אמנם מקליט את העכבר למיטה, ודא שראשו מפולס למישור אופקי. זה יכול להיקבע על ידי משיכת האוזניים ולראות אם הם מפולסים. ברגע שהעכבר נמצא במיקום הנכון, סגור את מגן העופרת.
  3. לרכוש את סריקת מחשב טומוגרפיה באמצעות תוכנה של פלטפורמת רדיולוגי של הנסיין על הלוח (זה יהיה שונה בין פלטפורמות), אשר תספק סריקה מבנית אנטומיים תלת ממדית של נושא העכבר. בדקו אם ראש העכבר מפולס למישור האופקי. אם לא, חזור על שלבים 1.2-1.3 עד שראשו של הנושא מפולס.
  4. זהה את ההחזר על ההשקעה על ידי תמונת ה-CT. לחשב את המרחק מההחזר על השקעה על פני השטח של הגולגולת באמצעות זווית של ° 45 למישור האופקי, כפי שמוצג באיור 3E.
  5. שימוש בתוכנה על הלוח, לקחת את קרני ה-X של נושא העכבר מלמעלה, כפי שמוצג באיור 4 א. לאחר מכן, להסיר את העכבר מפלטפורמת רדיולוגי, לשים על כרית חימום, ולפקח עד פעיל.
  6. מתמונות CT העטרה, לחשב את העומק אנטומיים ROI הממוצע של לפחות שלושה עכברים על מנת לקבוע מינון מסירה. כדוגמא ממחקר קודם שבו 2 10 Gy של קרינה היה מנוהל על ההיפותלמוס ventrobasal, עומק את ההחזר על ההשקעה מהגולגולת (מזווית של ° 45) הוא 0.66 סנטימטר (ראה איור 3E). בידיעה, החוקרים השתמשו בתוכנת תכנון מינון (DPS) המותקנת בפלטפורמת רדיולוגי כדי לחשב את המהירות המתאימה לסיבוב ואורך הטיפול להשגת מינון הרצוי להחזר על ההשקעה.
  7. לאחר קביעת משך טיפול ומהירות סיבוב של הבמה רובוטית עם תוכנת מינון תכנון, למדוד הפצות מינון של הפרמטרים מחושבים עם סרטי קרינה רגישה GAFchromic המוטבע במודל חיקוי עכבר פלסטיק במים שווי ערך. כדי לעשות זאת, כדי לשבץ את שלושה סרטי קרינה רגישה GAFchromic בין ארבעה בלוקים נערמים אנכי מים שווי ערך פלסטיק 29 כמושמוצג באיור 4.
  8. הנח מודל עכבר מדומה המכיל סרטי GAFchromic על במה רובוטית, ולהפעיל את קרן הקרנת המוקד עם הפרמטרים מחושבים מחדש. לדוגמה, כדי למקד את ההיפותלמוס ventrobasal, קלט הפרמטרים של 0.15 מסנן Cu מ"מ, 225 kVp, 13 mA, הגדרת 1 מ"מ קוטר אלומת קרינה, זווית gantry 45 °, 1.3 סיבוב ° / sec, ו4.6 דקות כדי להשיג את ההחזר על ההשקעה מינון רדיולוגי של 10 Gy.
  9. בעקבות הקרנה, לבדוק סרטים לדפוס ועוצמת מינון קרינה. לסיבוב זווית 360 ° עם הפרמטרים המפורטים למקד את ההיפותלמוס ventrobasal, טבעת כהה בסרט מעל isocenter, נקודה פריכה קטנה בסרט isocenter, וטבעת בהירה יותר בסרט מתחת לisocenter המתאימה החרוט ממשל אלומת הקרינה יקויימו (איור 4).
  10. להרכיב סרט GAFchromic isocenter על צילומי רנטגן של נושאי עכבר ממנו הפרמטרים היו calמחושב על. המוקד המוקרן בisocenter צריך חפיפה עם אזור ההחזר הרצוי על ההשקעה כפי שמוצג באיור 4C.

שיטה חלופית: אם קושי במיקוד ROI המוח נמשך, השתמש ניגוד יוד מוזרק intrathecally כדי לשפר את ההדמיה של חדרים מתחת לתמונות CT. לשם קיצור, הליך זה נשאר בחוץ של פרוטוקול זה, אבל מתואר 35, 50 בעבר. לעומת זאת יוד יספק ציוני דרך נוספות חדרית (איור 5 א).

2. קביעת דיוק של ההקרנה Beam

נוסף לאשר דיוק קרן CFIR ידי הדמיה ישירה של אלומת הקרינה ברקמות 2, 35, 51. כדי לעשות זאת, לבצע אימונוהיסטוכימיה לזהות 51 γH2AX, חלבון היסטון וסמן מוקדם של הפסקות גדיל כפולות ה-DNA. נושאים מאוס חייבים להיות perfused transcardially וקבוע בתוך שעה אחת של קרינה. irradi הבאation, תיקון דנ"א במהירות ensues, והרמות של ΥH2Ax להקטין באופן משמעותי 35.

  1. חזור על שלבים 1.1-1.3.
  2. לאחר היעד מזוהה על CT, נושא ההזזה העכבר שבשליטת רובוטית ליישר יעד זה עם קורה משלוח הקרינה. פרמטרים של קלט מחושבים (מהירות סיבוב ואורך הטיפול להשגת מינון הרצוי) משלב 1.6 לתוך תוכנת מינון תכנון ולהתחיל בטיפול. טיפול מועבר עם gantry הצביע 45 ° מהאנכי בזמן שהעכבר מסתובב על ציר אנכי בכיוון.
  3. בעקבות הקרנה, לבצע זלוף transcardial בנושאי עכבר. בצע זלוף בתוך שעה אחת 52. בעקבות מוח זלוף, לתקן טבילה בPFA 4% / PBS ועדינות רוק הלילה בשעה 4 ° C.
  4. למחרת בבוקר, לשטוף 5 דקות ב3x PBS להסיר מקבע paraformaldehyde. לאחר מכן, לטבול בסוכרוז 30% ב 1x PBS על כיסא נדנדה ב 4 ° C.
  5. נער בעדינות על 4 מעלות צלזיוס (ually 12-16 שעה), עד שהמוח שוקע לתחתית צינור. זה משמש כצעד cryoprotection. ברגע שהמוח לשקוע, להסיר מוח עם כף מחוררת כדי למנוע 30% העברת PBS sucrose/1x עודפת. להטביע במהירות בהקפאה בינונית על קרח יבש. מערבולת מדיום הקפאה עם קצה פיפטה וליישר מוח בתבנית פלסטיק.
  6. ברגע קפוא לחלוטין, להעביר בלוקים מוח למקפיא -20 ° לאחסון.
  7. ביום שבי אימונוהיסטוכימיה תבוצע, סעיף coronally ב40 עובי מיקרומטר, ולצוף לתוך צלחת 24 גם מכילה PBS עם מכחול דק. צריכים להישמר סעיפים על מנת סידורי נכון עבור immunostaining לקבוע כיסוי הקרנה של אזור היעד.
  8. 0.01 Prewarm M פתרון נתרן ציטראט 80 מעלות צלזיוס באמבט מים כהכנה לצעד אחזור אנטיגן. במקביל, בעוד ציטרט הנתרן מתחמם, לבצע 5 שטיפות דקות 3x ב0.01 M PBS.
  9. ברגע שפתרון ציטרט הנתרן הוא על 80 מעלות צלזיוס, להטביע חלקים במוח in פתרון חיץ ציטרט הנתרן. השאר באמבט מים ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  10. הסר את הסעיף ולאפשר פתרון ציטרט הנתרן להגיע לטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לבצע שלוש שוטף של 5 דקות הליכה ב0.01 M PBS.
  11. לחסום חלקים במוח במשך שעה 1 ב-PBS-טריטון המכילה 5% נסיוב עזים נורמלים.
  12. סעיפי דגירה הלילה במוח ב-PBS-טריטון המכילים 5% נסיוב עזים נורמלים עם 1:700 ריכוז של נוגדן ראשוני עכבר אנטי phospho-H2AX ב 4 ° C.
  13. למחרת, לבצע 15 שוטף דקות 3x ב0.01 M-PBS טריטון.
  14. דגירה חלקים במוח-PBS טריטון המכיל 5% נסיוב עזים נורמלים עם נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומד עם fluorphore 488 ננומטר ב1:500 ריכוז במשך שעה 2.
  15. בצע 15 שוטף דקות 3x ב0.01 M-PBS טריטון.
  16. בצע כתם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:5,000 PBS) עבור 10 דקות לדמיין גרעין. לאחר מכן, לשטוף חלקים במוח למשך 5 דקות עם PBS.
  17. הר על אלקטרוסטטי chמיקרוסקופ arged מחליק על ידי סעיף צף בPBS. נגב את PBS העודף ולאפשר שקופיות לייבוש. Coverslip השקופיות באמצעות הרכבה בינונית ולאפשר את השקופיות לייבוש בחושך בטמפרטורת חדר למשך הלילה.
  18. קח תמונות של סעיפי העטרה סידוריים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. immunostaining ΥH2Ax (ירוק) עולה באתר של קרינה. DAPI (כחול) הוא כתם גרעיני (איור 5).

3. הכנת עכבר נושאים להקרנת הפוקוס

בחן את תוצאות immunostaining ΥH2Ax. ברגע שמרוצה מהכיול והמיקוד של אלומת הקרינה, להמשיך בניסוי. בשלב זה, את הסך כל הזמן הנדרש לטיפול בעכבר (מהגדרה של בעלי חיים להשלמת מסירת קרן) הוא כ 10-15 דקות לטיפול 10-Gy עם קרן 1 מ"מ.

  1. להזמין נקבות עכברי ארבעה שבועות בן C57BL6 / י ממעבדות ג'קסון מאוס. בית ארבעה עכברים בכל כלוב, ולעבור מזון מאוכל רגיללתזונה עתירה שומן בחמישה שבועות. עכברי אגרוף באוזן לתת להם סימני זיהוי ייחודיים. לפקח על בריאותם של עכברים יומיים. הערה: סמנים מתכתיים לא ניתן להשתמש כפי שהם יגרמו לפסי חפצים על CT.
  2. שוקל עכברים היום לפני טיפול קרינה או אחיזת עיניים. עכברי פיצול לשני מחזורים לקרינה או טיפול דמה ולהבטיח כי אין הבדל משמעותי במשקל בין קבוצות. ביום של טיפול, כאשר עכברים הם בן שישה שבועות, reweigh כל העכברים ולהקליט את המסה שלהם. בעדינות להעביר את שני הקבוצות לפלטפורמת רדיולוגי. תשמור על עצמך כדי למזער את רמות לחץ.
  3. הכן את חדר הרדמה גז isoflurane. הרדימי שני עכברים, אחד בקבוצת הקרינה שנקבעה מראש, ועוד בקבוצת ביקורת הדמה. הכן את כרית חימום שנקבעה בהגדרה הנמוכה לטיפול לאחר ניתוח.
  4. בצע את הפעולות 1.2-1.4 לעכבר כדי לקבל הקרנה. לעכבר הדמה, לשמור על עכבר בחדר הרדמה בזמן הטיפול קורה. הפוך surדואר שתא ההרדמה הנמצא בסמוך לפלטפורמת CFIR כך שום השפעה על קרינה סביבתית נלקחת פנימה אחרי היעד מזוהה על CT, להעביר נושא העכבר שבשליטת רובוטית ליישר יעד זה עם קורה משלוח הקרינה. קלט מחושב פרמטרים (מהירות סיבוב ומשך טיפול) לתוך תוכנת מינון תכנון.
  5. לאחר טיפול הקרנה יושלם, תחזור גם זיוף ועכברים מוקרנים לכרית חימום, ולפקח עד שהם מתעוררים.
  6. להחזיר שני דמה ועכברים מוקרנים למתקן חי. לפקח על כל יום. לשקול את העכברים כל חצי שבוע. כדי לאשר את ההקרנה של אזור שגשוג ההיפותלמוס הממוקד, להזריק intraperitoneal של BrdU (50 מ"ג / קילוגרם) נוירוגנזה שלושה ימים שלאחר טיפול ולבחון בין קבוצות על ידי colabeling של אימונוהיסטוכימיה לBrdU וחודש סמן עצבי אחד לאחר חשיפת BrdU ראשונית (איור 6) 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיקוד ודיוק מודרכים-CT הערכה

הכיול המכני של המערכת הוא חיוני להבטחה שקורות מזוויות שונות בכל מצטלבות בנקודה אחת. כיול בוצע עם שיטת הדמיה מבוססת אוטומטית למחצה, שבו דיוק יישור קצה לקצה כבר נמדד להיות 0.2 מ"מ 29. דיוק זה הוא קריטי מאוד כמו הנפח של מבנה רוממות החציוני ההיפותלמוס הוא קטן 2. כדי לבחון את הכיול הזה, מדדנו הפצות מינון עם סרטי קרינה רגישה GAFchromic המוטבע במודל מים שווי ערך פלסטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקרנה מודרכת-CT מוקד (CFIR) היא רומן גישת מערכת שלמה מסוגל לספק שדות קרינה למטרות בבעלי חיים קטנים שבשליטה רובוטית באמצעות CT-הדרכה 32. היכולת של CFIR לספק אלומה ממוקדת מאוד למודלים של בעלי חיים קטנים מספקת הזדמנויות מחקר חדשות לגשר מחקר במעבדה ותרגום קליני. מאמר זה מתאר את גישת CFIR למסירת קרינה מדויקת למקד אוכלוסייה עצבית ההיפותלמוס במיוחד. אנו מדגימים כאן כיצד לכייל ולאשר סגוליות משלוח קרינה באמצעות סרט X-ray וברקמת מוח על ידי אימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש JW מימון מחקר וייעוץ הסכמים עם Xstrahl, Inc

תודות

אנו מודים לג Montojo, ג'רייס, ומ 'שריון לקבלת ייעוץ וסיוע טכניים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים אמריקאים לבריאות מענק NS063550 F31 (לDAL), פרס בזיל אוקונור Starter Scholar ומענקים מקרן Klingenstein וNARSAD (לSB). SB הוא צעיר נכבד Scholar קק WM במחקר רפואי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלטפורמת מחקר SARRPXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP בונקר הקרנהXstrahlאופציונלי, אך יש להכיל חשיפה לקרינה עם מיגון עופרת חלופי
סרט כרומי GAFIPSGAFchromic ETB2
פנטום עכברGammex457רכוש לוחות מים מוצקים בגודל 0.5 ס"מ x 30 ס"מ x 30 ס"מ מגמקס וחתוך לגודל הרצוי.
נוגדן נגד פוספו-היסטון H2AX Ser139 עכברMillipore, Inc.05-636שיבוט JBW301
דיאטת מכרסמים עתירת שומןדיאטות מחקרD12492i60% מהקלוריות כשומן, יש להקרין
IsofluraneBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0.01 M נתרן ציטראטפישר סיינטיפיק1.471 גרם נתרן ציטראט מומס ב 500 מ"ל מים נטולי יונים
Superfrost Plus שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
DAPIFisher Scientificכתם נגד גרעיני
אמצעי הרכבהFisher ScientificVectashield או Gelvatol
מזון עדיף

מקורות

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588(2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133(2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203(2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957(2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GAFDNA
חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.