מאמר שיטה

הפקת חלבון סה"כ ו2-D שיטות ג'ל אלקטרופורזה עבור

29.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50730

⸱

15 באוקטובר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Centre for Understanding and Preventing Infection in Children, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

תקציר

החקירה של רמות החלבון תאית של מיני חיידקים היא בעלת חשיבות להבנת המנגנונים פתוגניים במחלות הנגרמים על ידי אורגניזמים אלה. כאן אנו מתארים הליך להפקת חלבון ממינים Burkholderia מבוססת על תמוגה מכאנית באמצעות חרוזי זכוכית בנוכחות חומצת ethylenediamine tetraacetic ופלואוריד phenylmethylsulfonyl בופר פוספט. שיטה זו יכולה לשמש למיני Burkholderia שונים, לתנאי גידול שונים, וסביר להניח מתאים לשימוש במחקרי proteomic של חיידקים אחרים. לאחר מיצוי חלבון, טכניקת proteomic דו ממדים (2-D) ג'ל אלקטרופורזה מתוארת ללמוד שינויים הגלובליים בproteomes של אורגניזמים אלה. שיטה זו מורכבת של הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ואחריו הפרדה על בסיס משקל מולקולריעל ידי ג'ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. הדמיה של חלבונים מופרדים מתבצעת על ידי צביעת כסף.

מבוא

Burkholderia הסוג מונה יותר מ 62 מינים, אורגניזמים שליליים גרם מבודדים ממגוון רחב של נישות, והוא מחולק לשני אשכולות עיקריים 1,2. האשכול הראשון כולל בני אדם, בעלי חיים ואורגניזמים phytotrophic, ורוב המחקרים התמקדו במינים פתוגניים של קבוצה זו בשל החשיבות הקלינית שלהם. החברים פתוגניים ביותר הם B. pseudomallei ו-B mallei (מה שגורם melioidosis ונחרת בהתאמה) 3,4 ופתוגנים אופורטוניסטיים (17 מינים המוגדרים של מתחם Burkholderia cepacia, BCC) 5, הגורמים למחלות בסיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת granulomatous כרונית (CGD) 1. האשכול השני, עם יותר מ 30 מינים nonpathogenic, כולל חיידקים הקשורים צמחים או בסביבה, והם נחשבים למועילים פוטנציאליים למארח 2.

סיבוכים רבים לצאת frזיהום חיידקי אום עם החברים פתוגניים של סוג Burkholderia, כגון העברת של הפתוגן בין חולים, התפשטות המחלה וכישלון טיפול בשל ההתנגדות הפנימית או נרכשה לאנטיביוטיקה הופכת קשה למגר ברוב המקרים 6-9. לכן, צובר הבנה ברורה יותר של הבסיס להקמתה של זיהום חיידקים הוא חיוני לטיפול במחלות הנגרמות על ידי אורגניזמים אלה. על מנת לקבל תובנות לגבי הקמתה של זיהום, חקירות נרחבות על רכיבי חיידקים הקשורים בפתוגנזה יש צורך. לימודים מתמקדים בניתוח proteomic של אורגניזמים Burkholderia תוך שימוש בגישות proteomic תיארו חלבונים שהיו מעורבים בפתוגנזה של חיידקים, כמו גם שינויים בproteome פרופילי 10-16.

שיטות הפקת חלבון באמצעות sonication ומחזורי הקפאה מופשרת במאגר תמוגה המכיל גבוה קונצרט כלשהוentration של אוריאה, thiourea בשילוב עם חומרי ניקוי וampholytes כבר יושם במחקרי proteomic Burkholderia 10-13. למרות האוריאה היא די יעילה לdenaturation חלבון, זה יכול לבסס שיווי משקל בתמיסה מימית עם איזוציאניד אמוניום, אשר יכול להגיב עם קבוצות חומצת אמינו, ובכך יוצר חפצים (תגובת carbamylation) 17. לכן, מומלץ לכלול ampholytes המוביל, אשר פועל כמו אוכלי נבלות cyanate ולהימנע מטמפרטורות מעל 37 מעלות צלזיוס 17. יתר על כן, כדי למנוע כל הפרעה כימית של מאגר תמוגה עם כימות חלבון, אותו המאגר תמוגה יכול לשמש כדי ליצור עקומת הסטנדרט, כדי שהדגימות והסטנדרטים יש לו הרקע 10. מתודולוגיות אחרות כרוכות בשימוש במאגרים וחומרי ניקוי בסיסיים עם תקופות דגירה חום 17,18, אולם תנאים אלה עלולים לגרום לשינויים בproteome ושחומרי ניקוי מסוימים אינם תואמים ליחסי ציבוריישום oteomics אלא אם כן צעדים להסרת חומר ניקוי שלאחר מכן כלולים 17,18.

לאחר חילוץ וכימות נאותים, ביטוי חלבון הגלובלי של כל חלבון בודד ניתן ללמוד באמצעות גישות proteomic כגון דו ממדים (2-D) ג'ל אלקטרופורזה. טכניקה זו תוארה לראשונה על ידי O'Farell 19 ומורכב בהפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ולאחר מכן בהתאם למשקל המולקולרי שלהם על ידי ג'ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. בשל הרזולוציה והרגישות שלה, טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לניתוח וזיהוי של חלבונים ממקורות ביולוגיים מורכבים 19,20. טכניקת הפרדה זו זמינה כיום בגישות חלבון ממוקד עם היתרון הגדול של פתרון isoforms החלבון נגרם על ידי שינויים לאחר תעתיק או עיבוד פרוטאוליטי. שינויים הכמותייםיכול להיות מזוהה על ידי השוואת עוצמת הנקודה המקבילה לאחר הצביעה של ג'ל 20. עם זאת, טכניקה זו אינה מתאימה לזיהוי של חלבונים גדולים מאוד, חלבונים בממברנה, חלבונים מאוד בסיסיים וחומצי או הידרופובי, והיא טכניקה קצת מייגע וגוזל זמן 20. גישות פפטיד הממוקד חדשות (המבוסס על ג'ל שאינו), כי הם יותר חזקים והמטרה להיות זמינות וניתן להשתמש בם להשוואת כמותית בשיטות תיוג איזוטופ היציב ההפרש כגון תיוג ציסטאין ידי זיקה מקודדת איזוטופ תיוג (ICAT) 21, וקבוצת אמינו תיוג על ידי תיוג איזוטופ כדי לכמת יחסי ומוחלט (iTRAQ) 22. השימוש בטכניקת proteomic אחת עשויה לתת מידע מספיק, ולכן השימוש בשני גישות proteomic משלימות הוא הכרחי עבור רוב השינויים בהערכה באופן מלא בproteome. עם זאת, ג'ל אלקטרופורזה 2-D נעשתה שימוש נרחב ויכולה להיות מיושמת באופן שיגרתי לקוואןtitative ביטוי של מספר חלבונים באורגניזמים שונים.

כאן אנו מתארים מיצוי חלבון כל התא ונהלי ג'ל אלקטרופורזה 2-D למיני Burkholderia שהותאמו ומותאמים מ2-D עקרונות אלקטרופורזה GE Healthcare ושיטות Handbook 80-6429-60AC 2004 (www.amershambiosciences.com). הפקת החלבון בוצעה באמצעות מקצף חרוז בחרוזי זכוכית בנוכחות של PBS המכילה 5 מ"מ EDTA (חומצת tetraacetic ethylenediamine) ו1 מ"מ PMSF (פלואוריד phenylmethylsulfonyl). הליך זה מאפשר כימות של חלבונים עם השפלה מינימלית הוא amendable לגישות proteomic כ15,23,24 שדווחו בעבר. ג'ל אלקטרופורזה 2-D בוצעה באמצעות 24 סנטימטר ארוך משותק pH 4-7 שיפוע וחלבונים הופרדו על פי נקודה איזואלקטרית. אז חלבונים הופרדו על פי Molecמשקל תואר בלבד על ידי ג'ל SDS-polyacrylamide. בנוסף, אנו תיארתי שיטת צביעת כסף להדמיה של חלבוני מקום, ושיטת כתם כסף שהוא תואם לניתוח ספקטרומטריית מסה. יחד נהלים אלה יכולים לאפשר זיהוי של חלבונים חשובים ממינים Burkholderia שיכול להיות מעורב בפתוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צמיחת תרבות (ימים 1 +2)

  1. לגדול תרבות המתנע: 3 מיליליטר של מרק לוריא Bertani (LB) בצינור מיליליטר הצמד עליון 15, במסובב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. לדלל צמיחה בן לילה לOD 600 של 0.6. הוסף 1 מיליליטר של דילול זה של מרק LB 100 מיליליטר בבקבוק 250 מיליליטר Erlenmeyer. לדגור על 37 ° C עם הרועד בסל"ד 250 ל16 שעות לתוך שלב נייח (SP), למקורב יותר טוב, בתרבות אצווה, תנאי זיהום וכדי להבטיח גורמים ארסי חיידקים שתחת השליטה של ​​גורמי אות בשלב נייחים כגון rpoS ומניין חישה, באים לידי ביטוי. לחלופין, חיידקים גדלו בSP מוקדם או בשלב האמצע או בסוף הלוגריתמים ניתן להשתמש בם כדי לקבל מידע על שלב הסתגלות החיידקים.
  2. לאחר 16 שעה למדוד את קוטר חיצוני 600 ולהבטיח הגיעה התרבות SP בהשוואה לעקומת צמיחה שנבנתה בעבר בתנאים זהים.

2. הפקת חלבון (יום 3)

  1. צ'יל כל אמצעי התקשורת ופתרונות מראש במקרר למשך הלילה. צריכים להתבצע בכל הצעדים עם צינורות בדלי קרח. Prechill microcentrifuge וצנטריפוגות בקמן קולטר ביצועים גבוהים (או שוות ערך) עד 4 מעלות צלזיוס והרוטור פנימי (רוטור = JA-20, צנטריפוגה = J2-HS).
  2. הכן פלואוריד phenylmethanesulfonyl 0.1 M הטרי פתרון (PMSF, 174.19 g / mol) באצטון על ידי המסת .0174 גרם של PMSF (PMSF "זהירות" הוא רעיל ומאכל, מגיני פנים שימוש וכפפות) ב 1 מיליליטר של אצטון (אצטון "זהירות" הוא רעיל ודליק, יש להשתמש במגנים פנים וכפפות).
  3. מרכיב את פתרון PBS / EDTA / PMSF: 0.1 מיליליטר של M 0.1 PMSF, 0.1 מיליליטר של 0.5 M EDTA, ו9.8 מיליליטר של PBS. בדוק את OD של תרבות שעות 16 הוא כ איפה שהוא צריך להיות בSP.
  4. קח 35 מיליליטר של התרבות והעברת חיידקים לצינור Oakridge צנטריפוגה ו צנטריפוגות התרבות ב4,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר supernatant למכל פסולת ולהוסיף 35 מיליליטר של PBS מקורר וresuspend את הכדור. צנטריפוגה שוב בגרם × 4,500 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
  6. הסר supernatant ו resuspend ב 1 מיליליטר של PBS הקר. העברה לסטרילי 2 מיליליטר Eppendorf ודקות צנטריפוגות 1 על גבוה בmicrocentrifuge בגרמו × 14,000 ב 4 ° C. להסיר ולהשליך supernatant.
  7. הוסף 1 מיליליטר של פתרון PBS / EDTA / PMSF, resuspend את הכדור ולהעביר 2 מיליליטר בורג צינור כובע (עם O-Ring) המכילים ~ חרוזי זכוכית 0.5 מיליליטר (presterilized). הוסף את גלולה מחדש מושעה לצינור המכיל חרוזי הזכוכית וחרוזים לנגח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות בקור חדר. האם 3x זה, לשים את המדגם על קרח לאחר כל המסיבה.
  8. צנטריפוגה ב XG 14,000 דקות 1 בmicrocentrifuge. הסר את supernatant ולשים אותו בצינור קלקר 5 מיליליטר סטרילי.
  9. כדי להגדיל את התשואה להוסיף 1 מיליליטר של PBS / EDTA / פתרון PMSF לאותו צינור מכיל חרוזי זכוכית שוב. bash חרוז הצינור ב C ° 4 דקות 1. אל 2x זה לשים את המדגם על af הקרחbash ter. צנטריפוגה ב XG 14,000 למשך דקה אחת בצנטריפוגה ולהסיר את supernatant ולהוסיף לsupernatant משלב 2.8. השתמש במזרק 1 מיליליטר ומסנן 0.20 מיקרומטר supernatant מצינור הקלקר לצינור 2 מיליליטר Eppendorf חדש סטרילי.
  10. בשלב זה הדגימות צריכה להיות assayed לכמות חלבון, שימוש בערכת פירס MicroBCA חלבון החילוץ וaliquots של 200 מיקרוגרם צריך להיות קפוא ב-80 ° C עד צורך.

3. לדוגמא הכנה (יום 4)

  1. הכן 25 מיליליטר פתרון מניות להחזרת נוזלים (8 מ אוריאה, בחורים 2%, 2% הצפת IPG, bromophenol 0.002% הכחול) ולאחסן ב2.5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. הוסף 7 dithiothreitol מ"ג (DTT, 154.2 g / mol) רק לפני השימוש לaliquot 2.5 מיליליטר של פתרון מניות להחזרת נוזלים.
  2. תהליך הפשיר דגימות משלב 2.10 באמצעות נקי 2-D את ערכה עם resuspension הסופי ב450 μl של פתרון מניות להחזרת נוזלים מוכנים בשלב 3.1.

4. ראשוןממד isoelectric התמקדות (IEF) (יום 4)

כל השלבים בסעיף זה משתמשים במערכת IEF Ettan IGPhor.

  1. הגדר את רצועות IPG ​​הראשונות ממד: מחזיקי רצועה נקיים עם תמיסת ניקוי רצועה ולאחר מכן לשטוף עם מים מילי-Q, להשאיר הפוך לייבוש. להקצות לכל מדגם למספר בעל רצועת ג'ל.
  2. טען המדגם מצעד להחזרת נוזלים באזור רחב יותר מהשני (-) בסופו. שימוש במלקחיים נקיים כדי למשוך את רצועות ג'ל מתוך אריזה. קח את שכבת הגנה מרצועות ג'ל. קו רצועות צד מחוספס כלפי מטה בתנועה איטית, הזזה כדי לקבל את הרצועות רטובות לאורך הדרך מ( -) מקצה לקצה (+).
  3. שים את נייר סופג לח עם מים מעוקרים על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות ג'ל למניעת שחיקה. יש לשטוף את הפינצטה שבין סיבובים עם מים ואתנול מטוהרים. הסר את כל הבועות, כיסוי דק עם שמן מינרלים כדי למנוע פסקי יבשים. מרפד את מחזיקי רצועת ג'ל במכונה.
  4. הפעל שעות 12 ב20 מעלות צלזיוס למשך rehydמנה, שעה 1 ב200 V, שעה 1 ב500 V, שעה 1 ב1,000 V, 0.5 שעות ב 4,000 V, 12 שעות ב 8,000 V, המתנה שעות 24 ב300 V וניתן להוציא בשלב זה.
  5. לאחר IEF הוא סיים, מומלץ לבצע ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide השנייה ממד, אלא אם כן את רצועת IPG ​​נמצאים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס בניילון מצופה בשמן מינרלים לניתוח בעתיד. לחלופין, על מנת להימנע מפסי נקודה בשל גישת DTT ניתן לכלול צעד איזון שני של IPG רצועות לפני הממד השני עם חיץ המכיל iodoacetamide.

5. שני ממד SDS-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (יום 5)

כל השלבים בסעיף זה משתמשים במנגנון אלקטרופורזה Ettan DALTsix.

  1. כדי להרכיב את מנגנון גלגלית ג'ל, לנקות ביסודיות את כל הרכיבים ולהבטיח כי גלגלית ג'ל היא ברמה והגומי האפור המחייב הוא משומן עם ג'ל סיליקון. שים לשפשף השחורבער פקק משולש בתחתית. לאחר מכן, לסירוגין למקם את המפריד ואת לוחות הזכוכית עם הצלחת הקצרה של זכוכית מול חזית. ודא המפרידים הם על הגב והחזית. למלא את החלל שנותר עם חומרי המילוי (כ -5 גיליונות) כך שהחלק העליון הוא שטוח. שים את הלוח הקדמי על עם הקצה האדום בצד החיצוני. שימוש מלחציים להדק כל צד והדק את הברגים בתחתית.
  2. הכנת ג'ל: הוסף 297.3 מיליליטר של Duracryl, ('זהירות' Duracryl הוא מגיני פנים שימוש רעיל וכפפות), 147 מיליליטר של הצפת טריס pH 1.5 M 8.8, ו143.3 מיליליטר של מים מילי-Q לתוך בקבוק עם קצה ואקום המכיל בר ומערבב. שים את המכסה על גבי ולערבב פתרון במהירות מתונה עם הוואקום ל20 דקות. הוואקום משמש לדה גז הפתרון. הפוך טרי 10% מפתרון persulfate אמוניום (APS, 218.8 g / mol): 0.2 גרם של APS ל2 מיליליטר של מים מילי-Q.
  3. הוספת תערובת ג'ל לגלגלית ג'ל: כאשר הוואקום נעשה להוסיף 6 מיליליטר של 10% נתרן גופרתי dodecyl (SDS, 228.38 g / mol)לצדו השני של הבקבוק כדי להימנע מלהכניס יותר בועות בפתרון. הוספת APS, מערבבים, מוסיף 0.25 מיליליטר N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED, 116.20 g / mol) ("זהירות" TEMED הוא מגיני פנים שימוש דליק וכפפות) ומערבבים.
  4. יוצקים את תערובת ג'ל לגלגלית ג'ל דרך משפך המוכנס בחלק האחורי של המכשיר. יוצקים עד סנטימטר מתחת לצלחת הקצרה. הוסף 1.5 מיליליטר של butanol רווי מים לחלק העליון של ג'ל ולעטוף את הראש בניילון נצמד כדי למנוע התייבשות. לחכות לשעה 1 כדי להבטיח פילמור מלא.
  5. בבדיקה ג'ל: כאשר ג'ל נעשה (בדוק את הבקבוק), לפרק גלגלית הג'ל על ידי כיור. הגעה לשלמות ג'ל תוך שטיפת צלחות זכוכית עם מים חמים; לא מאפשר למים להיכנס לצלחת. שפוך butanol ולשטוף את החלק העליון של ג'ל פעמיים עם מים כדי להיפטר מבוטאנול. למלא את הראש במים שוב ולתת לשבת אם ג'לים לא נעשה שימוש באופן מיידי.
  6. מכין את הרצועות: הכן פתרון חיץ איזון ממקפיא (6 M אוריאה, 75 מ"מ טריס-HCl pH 8.8, 29.9% SDS, bromophenol 0.002% הכחולים). זה יכול להיות preprepared ומאוחסן ב10 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. ממיסים 0.1 גרם של DTT ל10 מיליליטר של תמיסת חיץ איזון. צינור אחד יכול לשמש לשתי רצועות IPG. מניחים את ג'לי של הפנים כלפי מטה על רצועת החיץ ולתת לשבת במשך 30 דקות. זכור שסופו של דבר הוא ש.
  7. הכנת יחידת אלקטרופורזה (מנגנון הפרדה 2-D): הוסף 4.5 L של חיץ 1x אלקטרופורזה (25 מ"מ טריס בסיס [121.1 g / mol], 192 מ"מ גליצין [288.38 g / mol], ו0.1% w / v SDS [288.38 g / mol]) לטנק הריצה. מאגר זה יכול לשמש לתקופה של עד 3x. הפעל את יחידת אלקטרופורזה ב. בדוק את רמת מים במכונה קירור מים ולמלא אותו במים אם הוא נמוך. הדלק את המכשיר, מצב עיתונות כדי לבדוק את הטמפרטורה המיועדת, שאמורה להיות 10 ° C.
  8. הפוך 1 ליטר של חיץ 2x ריצה ו1 ליטר של 1x של הפעלת מאגר ולאחסן אותם ב 4 ° C. הפוך פתרון האיטום-agarose: משקל 0.25 גרם של agarosדואר ולהתמוסס ב50 מיליליטר של חיץ 1x פועל. Pulse ל15 שניות כל אחד.
  9. הקמת יחידת אלקטרופורזה: פינצטה השתמש כדי להוציא את כל רצועה ולהסיר את החיץ העודף משני הצדדים עם נייר מגבת נקייה. אל תיגעו ברצועות. יוצקים את המים על החלק העליון של ג'ל ומרפד את החלק העליון ג'ל עם חיץ 1x פועל. להשתמש בפינצטה נקייה ומניח את הרצועות על גבי הצלחת הארוכה, עם צד ג 'פונה כלפיכם. הוסף חוצץ 1x לרצועות כדי לשמן אותו. רצועות שקופיות בהמשך באמצעות רצועות פלסטיק. הסר את כל הבועות שבבין הרצועה וג'ל.
  10. הוספת פתרון האיטום-agarose לחלק העליון של הרצועה כדי לאטום אותו. חזור על פעולה עבור שאר הרצועות. מקם את צלחות זכוכית המכילות ג'ל לעריסת ג'ל ונמוך לתוך טנק ג'ל. להבטיח את רמת חיץ 1x בחדר החיצוני היא בשורה תחתונה המיועדת לפני שהכניס את החדר העליון ב.
  11. הנח את המסגרת לתא חיץ עליון על גבי לוחות הזכוכית ולהבטיח שהוא כל way למטה על ידי לחיצה למטה בתחתית. השתמש במשפך ולהוסיף למאגר פועל 2x לתוך התא העליון עד לקו האמצע. השתמש במשפך ולהוסיף למאגר הריצה 1x לתא החיצוני עד שהוא מגיע לשורה העליונה. מניחים את המכסה על גבי ולהפעיל את יחידת אלקטרופורזה ואת חבילת הכוח.
  12. הפעל לילה בשעה 52 V, 96 mA, 5 W. בדוק אם הזרם הולך על ידי מחפש בועות על חוט הכסף קרוב לפסגה. הרץ את הג'ל עד הקו המוביל הוא 1 סנטימטר מהחלק התחתון.
  13. יכולים גם להיות מנותחים חלבונים תוך שימוש בציוד וחומרים כימיים מחברות אחרות BioRad או Hoefer כאמור, בהתאם להוראות יצרן.

6. צביעת כסף של ג'לי ויזואליזציה ג'ל (יום 5-6)

  1. הכן פתרון תיקון 1 (800 אתנול מיליליטר, חומצה אצטית 200 מיליליטר, ו -1,000 מיליליטר של מים מילי-Q במנדף לדלי פלסטיק). הפתרון טוב ל6 ג'לים. הפעל את כל המכונות ולקחת את כל החלק האמצעי של יחידת אלקטרופורזה וpuיהיה עליה בכיור. גם לשים את העמדה הלבנה בכיור. משוך החוצה את המגש העליון המכיל את חיץ הריצה 2x.
  2. לפרק את המנגנון והסר את ג'לי מלוחות הזכוכית לפתרון לתקן 1. ניתן לזהות ג'לים על ידי חיתוך פינות כאשר הם הוסרו מצלחות הזכוכית, מספר הפינות לחתוך המתאים על מנת ג'ל בגלגלית.
  3. מניחים את המכל עם פתרון התיקון וג'לים על כיסא נדנדה במשך שעה לפחות 1 לילה לב 4 ° C.
  4. העבר את ג'לי לתקן פתרון 2 (20 מיליליטר של glutaraldehyde 50%, 600 מיליליטר של אתנול, 5 גרם של tetrathionate אשלגן (302.46 g / mol), 136 גרם של נתרן אצטט (82.03 g / mol), ומים מילי-Q כדי 2,000 מיליליטר) ומניחים על כיסא נדנדה במשך שעה 1.
  5. שטוף את הג'לים 4x ל15 דקות כל אחד במים מילי-Q.
  6. להכתים את ג'לי בכסף חנקת פתרון (4 גרם של כסף חנקתי (169.87 g / mol), 500 μl של פורמלדהיד, ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) ל30 דקות או עד 48 שעה.
  7. שטוף ג'ל ל1דקות במים מילי-Q.
  8. העברה לפתרון מפתחים (60 גרם של סודיום קרבונט (105.99 g / mol), 300 μl של פורמלדהיד, 15 מ"ג של נתרן תיוסולפט (158.11 g / mol), ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) עבור 5-30 דקות עד ג'ל מוכתם.
  9. שים את ג'לי בStop פתרון (של טריס-Base (121.14 g / mol), 40 מיליליטר של חומצה אצטית 100 גרם, ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) ל10 דקות.
  10. לאחסון, להעביר את ג'לי לגליצרול פתרון (40 מיליליטר של גליצרול או 400 מיליליטר אם אחסון לטווח ארוך הוא רצוי, ו1,600 מיליליטר מים מילי-Q) ל10 דקות ולאחר מכן לייבש אותם בעזרת מייבש ג'ל.
  11. ניתן דמיינו ג'לים לאחר הצביעה באמצעות מערכות הדמיה כגון סורק / densitometer, צילם באמצעות transilluminator אור או תרמי ג'ל. תוכנת ניתוח תמונה כגון ניתוח 2-D PDQuest מBioRad לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להשיג מידע כמוני ואיכותי מחלבונים במדגם.

7. ג'ל כסף מכתים לניתוח ספקטרומטריית המסה

  1. תקן את ג'לי במתנול 50%, ו -5% חומצה אצטית במשך שעה 1.
  2. שטוף במתנול 50% לפחות 10 דקות ללילה.
  3. לשטוף במים מזוקקים 3x עבור 10 דקות.
  4. רגישות עם 0.02% thiosulfate נתרן (158.11 g / mol) 2x ל15 דקות.
  5. 3x לשטוף במים מזוקקים 3x הצונן בשביל 10 דקות.
  6. לצלול ג'ל בפתרון מצונן 1% כסף חנקה (169.87 g / mol) לפחות 20 דקות לשעה 1 על 4 מעלות צלזיוס
  7. לשטוף 2x דקות 1 עם מים מזוקקים. שינוי מגש / דלי.
  8. לפתח בפורמלדהיד 0.04% ב 2% נטול מים סודיום קרבונט (105.99 g / mol) וזורקים כאשר מתברר צהוב די מהיר; יש שלוש קבוצות ולהיות מוכנים לשנות את כל 5 דקות.
  9. לשטוף בחומצה אצטית 5% לאחר מכן לאחסן ב1% חומצה אצטית.
  10. יש לשטוף 1.5 מיליליטר Eppendorf צינורות (להחזיק לקבל מקום מגזרות) עם אתנול USP כיתה ואוויר יבש לפני השימוש.
  11. מלקחיים נקיים, סכיני גילוח ומשטחים עם מתנול 100%.
  12. ספריי כפפות ומשטחים עם אתנול.
  13. כתמי בלו בזרימת אוויר נקי אזור מכסה המנוע או. כתמים יכולים להיות גם נכרת באמצעות חותך נקודה אוטומטית.
  14. שים אותם בצינורות Eppendorf וספינה על קרח, או לשמור במקרר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח השוואתי של פרופילי החלבון המופקים מאותה התרבות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה פסי דפוסים דומים המצביע על עקירות חלבון מוצלחות. חלבונים במשקל מולקולריים שחולצו נעו 10-150 kDa. איור 1 מציג נציג ג'ל Coomassie כתמי כחולים של עקירות חלבון כל התא מmultivorans Burkholderia (חבר של BCC) קליני מבודדים גדל בLB או שמרים / Manitol מרק (YEM) ו נקטף משלב נייח.

לניתוח ג'ל אלקטרופורזה 2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה להכנת חלבונים שתוארה שיכול לחלץ את רוב חלבוני Burkholderia עם שחזור טוב. זו באה לידי הביטוי על ידי קבלת באותו פרופיל חלבון משני תכשירים עצמאיים שבוצעו בימים שונים תוך שימוש באותה התרבות חיידקים גדלה בLB או מרק YEM כפי שמוצג באיור 1. החילוץ היה יעיל לחיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, אך יש לנו לא נבדקו בשיטה זו לחיידקים גדלו על צלחות. שיטה זו שימשה גם לאפיון חלבונים נוסף באמצעות כלים proteomic; הקבוצה שלנו למדה בהצלחה שינויי proteome באמצעות ג'ל אלקטרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת לימודים מאוניברסיטת בריטיש קולומביה (לBV) ומענקים מסיסטיק פיברוזיס מכוני קנדה וקנדיים לבריאות מחקר (לDPS). אנו מודים לז'קלין צ'ונג להכנה הראשונית של פרוטוקולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
פניל-מתאןסולפוניל פלואוריד (PMSF)SigmaP7626אצטון רעיל, קורוזיבי
פישרA18-1
מאגר PBSBioscienceR028
אתילנדיאמין-טטראצטי חומצה (EDTA)פישרBP118-500חרוזי זכוכית רעילים
(0.1 מ"מ)מוצרי BioSpec11079101
צינורות צנטריפוגה של Nalgene Oak Ridge, פוליקרבונט (50 מ"ל)VWR21009-342
ערכת מיצוי חלבון MicroBCAפירס23235
צינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל צינורות כובע בורג חרוטי עם מכסה וטבעתO פישר02-681-375
ערכת ניקוי דו-ממדיתGE Healthcare80-6484-51
אוריאהInvitrogen15505-050
מגרה CHAPSאמרשם ביוסיינסס17-1314-01
דיתיותרייטול (DTT)MPביורפואי, LCC856126מגרה
אימובילין רצועות יבשות pH 4-7 24 ס"מאמרשם ביוסיינסס176002-46
DuracrylProteomic Solutions80-0148רעיל מאוד, מסרטן
אמוניום פרסולפטפישרBP179-100דליק, רעיל, קורוזיבי
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)Invitrogen15524-010
נתרן דודציל סולפט דליק (SDS)FisherBP166-500רעילות חריפה,
אגרוזInvitrogen15510-027
אתנולפישרHC1100-1GL
חומצה אצטיתפישרA491-212, קורוזיבי
גלוטרלדהידפישרG151-1רעיל מאוד, קורוזיבי, מסוכן לסביבה
אשלגן טטרתיונאטסיגמאP2926
מגרה נתרן אצטטEM Science7510
כסף חנקתיסיגמא209139קורוזיבי, מסוכן לסביבה
פורמלדהידסיגמא252549
נתרן תיוסולפטסיגמאS7026
Tris BaseEMD9230
גליציןMPBiomedical, LCC808831
גליצרולMPBiomedical, LCC800688
מתנולפישרA412-4דליק, רעיל, סכנה בריאותית
נתרן פחמתי נטול מיםEMDSX0400-3
שמן מינרליACROS415080010
<חזק>ציוד
רוטור אולטרה-צנטריפוגה JA-20בקמן קולטר334831
מיני מקצף חרוזיםמוצרי Biospec3110BX
מערכת מיקוד איזואלקטרית Ettan IPGphor II ואביזריםGE Healthcare80-6505-03www.amershambiosciences.com
Ettan DALT מערכת אלקטרופורזה אנכית גדולהGE Healthcare80-6485-27www.amershambiosciences.com
דליק דליק דליקה, רעילה דליק רעיל רעיל

מקורות

  1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
  2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
  3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
  4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
  5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
  6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
  7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
  8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
  9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
  10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
  11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
  12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
  13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
  14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
  15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
  16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
  17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
  18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078(2007).
  19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
  21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
  22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
  24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
  25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
  26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
  27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
  28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS PAGE

מאמרים קשורים